Ce protocole fournit une procédure de préparation optimisée et élaborée pour les échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission. Il convient aux applications qui impliquent l’analyse des synapses dans les organoïdes rétiniens matures.
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Article de méthode
Préparation d’échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les organoïdes rétiniens (OI) sont un système de culture tridimensionnel imitant les caractéristiques rétiniennes humaines qui se sont différenciées des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) dans des conditions spécifiques. Le développement et la maturation des synapses dans les OI ont été étudiés immunocytochimiquement et fonctionnellement. Cependant, les preuves directes de l’ultrastructure de contact synaptique sont limitées, contenant à la fois des synapses de ruban spéciales et des synapses chimiques conventionnelles. La microscopie électronique à transmission (MET) se caractérise par une haute résolution et une histoire respectable élucidant le développement de la rétine et la maturation des synapses chez l’homme et diverses espèces. Il s’agit d’un outil puissant pour explorer la structure synaptique des OI et est largement utilisé dans le domaine de la recherche sur les OI. Par conséquent, pour mieux explorer la structure des contacts synaptiques de l’OI à l’échelle nanométrique et obtenir des preuves microscopiques de haute qualité, nous avons développé une méthode simple et reproductible de préparation d’échantillons TEM d’OI. Cet article décrit le protocole, les réactifs utilisés et les étapes détaillées, y compris la préparation de la fixation de l’OI, la post-fixation, l’intégration et la visualisation.
Introduction
La rétine, un organe sensoriel visuel vital chez l’homme et les mammifères, présente une structure laminée distincte caractérisée par trois couches nucléaires abritant des somas neuronaux et deux couches plexiformes formées par des connexions synaptiques1, y compris les synapses conventionnelles et la synapse de ruban spécialisée 2,3. La synapse du ruban joue un rôle crucial dans la transmission des impulsions des vésicules de manière graduée 2,3. Le processus de vision implique la transmission ....
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Protocole
1. Obtention d’offices récepteurs auprès des iPSC25
REMARQUE : Les OI ont été dérivées des iPSC en modifiant la procédure précédemment signalée.
- Dissocier les iPSC à ~90% de confluence à l’aide d’une protéase bactérienne (voir le tableau des matériaux). Coupez les colonies en morceaux et grattez-les avec un élévateur de cellules.
- Après le prélèvement, remettre en suspension les grappes de cellules dans 0,25 mL de Matrigel glacé. Après 20 min d’incubation à 37 °C, disperser le gel solidifié avec le milieu DMEM/F12 ....
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Résultats
L’établissement d’OI 3D par différenciation des iPSC fournit un outil puissant pour étudier les mécanismes des maladies rétiniennes et la thérapie de remplacement des cellules souches. Bien que d’autres aient démontré les connexions synaptiques dans les OI sur le plan fonctionnel et immunocytochimique, les preuves directes de synapses conventionnelles et en ruban sont très limitées. Nous présentons ici une méthode d’étude de l’ultrastructure de deux types de synapses dans les RO par TEM. Après 180 jours de culture, les O.......
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Discussion
Dans cet article, nous avons présenté un protocole détaillé pour l’observation de l’ultrastructure synaptique conventionnelle et en ruban dans les OI par TEM. Ce protocole est basé sur les méthodes de préparation rétinienne décrites précédemment, avec quelques modifications20. Pour améliorer le taux de réussite du traitement des échantillons et la qualité des micrographies TEM, tenez compte des points clés suivants. Tout d’abord, il est important de reconnaître qu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ces travaux ont été soutenus en partie par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de Chine (2022YFA1105503), du Laboratoire clé d’État des neurosciences (SKLN-202103) et de la Fondation des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (Y21H120019), de la Fondation des sciences naturelles de Chine (82070981).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Boîte de Pétri 100 mm | Corning | 430167 | |
| Acétone | Microscopie électronique Science | 10000 | |
| B27 supplément | Gibco | A3582801 | |
| Cell lifter | Santa Cruz | sc-395251 | |
| Grilles en cuivre | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | ||
| Logiciel de micrographie numérique | Gatan, Inc. | Logiciel | |
| Dispase | StemCell Technologies | #07913 | Protéase bactérienne |
| DMEM/F12 moyenne | Gibco | #11320033 | |
| Moule d’enrobage | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | ||
| Epon-812 résine | Microscopie électronique Science | #14900 | |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Biological Industries | #04-0021A | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| hiPSC | Shownin Biotechnology Co., Ltd. | RC01001-A | |
| Citrate de plomb | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | ||
| L-GlutaMax | Life Technologies | #35050061 | Substitut de L-glutamine |
| Matrigel | Corning | 356234 | |
| Lame de microscope | CITOTEST | 80312-3161 | |
| Supplément N2 | Gibco | 17502048 | |
| Na2HPO4· ; 12H2O | Sigma | 71650 | Un composant de PB/PBS |
| NaH2PO4· ; H2O | Sigma | 71507 | Un composant de PB/PBS |
| Acides aminés non essentiels | Sigma | #M7145 | |
| Microscope optique | Laboratoire Microscope biologique binoculaire | Xsz-107bnii | |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Four | Bluepard | BPG9040A | |
| Paraformaldéhyde | Microscopie électronique Science | 157-8 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | #15140-122 | |
| Microtome semi/ultramince | Reichert-Jung | 396649 | |
| Taurine | Sigma | #T0625 | |
| Bleu de toluidine | Sangon Biotech | E670105-0100 | |
| Microscopes électroniques à | transmissionHITACHI | H-7500 | |
| Acétate d’uranyle | TED PELLA | CA96049 | |
| &beta ;-mercaptoéthanol | Sigma | 444203 |
Références
- Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489(2021).
- Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F.
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Réimpressions et autorisations
