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Article de méthode

Préparation d’échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission

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DOI :

10.3791/66590

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7 juin 2024

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1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une procédure de préparation optimisée et élaborée pour les échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission. Il convient aux applications qui impliquent l’analyse des synapses dans les organoïdes rétiniens matures.

Résumé

Les organoïdes rétiniens (OI) sont un système de culture tridimensionnel imitant les caractéristiques rétiniennes humaines qui se sont différenciées des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) dans des conditions spécifiques. Le développement et la maturation des synapses dans les OI ont été étudiés immunocytochimiquement et fonctionnellement. Cependant, les preuves directes de l’ultrastructure de contact synaptique sont limitées, contenant à la fois des synapses de ruban spéciales et des synapses chimiques conventionnelles. La microscopie électronique à transmission (MET) se caractérise par une haute résolution et une histoire respectable élucidant le développement de la rétine et la maturation des synapses chez l’homme et diverses espèces. Il s’agit d’un outil puissant pour explorer la structure synaptique des OI et est largement utilisé dans le domaine de la recherche sur les OI. Par conséquent, pour mieux explorer la structure des contacts synaptiques de l’OI à l’échelle nanométrique et obtenir des preuves microscopiques de haute qualité, nous avons développé une méthode simple et reproductible de préparation d’échantillons TEM d’OI. Cet article décrit le protocole, les réactifs utilisés et les étapes détaillées, y compris la préparation de la fixation de l’OI, la post-fixation, l’intégration et la visualisation.

Introduction

La rétine, un organe sensoriel visuel vital chez l’homme et les mammifères, présente une structure laminée distincte caractérisée par trois couches nucléaires abritant des somas neuronaux et deux couches plexiformes formées par des connexions synaptiques1, y compris les synapses conventionnelles et la synapse de ruban spécialisée 2,3. La synapse du ruban joue un rôle crucial dans la transmission des impulsions des vésicules de manière graduée 2,3. Le processus de vision implique la transmission de signaux électro-optiques à travers différents niveaux de neurones et de synapses, atteignant finalement le cortex visuel 4,5.

Les organoïdes rétiniens (OI) représentent un système de culture tridimensionnel (3D) dérivé de cellules souches pluripotentes induites (CSPi), imitant les états physiologiques du tissu rétinien in vitro 1,6,7. Cette approche est prometteuse pour l’étude des maladies de la rétine8, le dépistage de médicaments9 et la thérapie potentielle pour les maladies dégénératives irréversibles de la rétine telles que la rétinite pigmentaire10 et le glaucome11. En tant que puissant système de conduction optique in vitro, la synapse au sein des RO est une structure cruciale facilitant la transformation et le transfert efficaces du signal5.

Le développement de l’OI peut être grossièrement divisé en trois étapes en fonction de leurs caractéristiques morphologiques et de leurs profils d’expression moléculaire 6,12. Les OI au stade 1 (autour de D21-D60) comprennent des cellules progénitrices neurales de la rétine, de nombreuses cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) et quelques cellules amacrines en étoile (SAC), correspondant à la première époque du développement fœtal humain. Au stade 2 (vers D50-D150), les RO expriment certains précurseurs de photorécepteurs, interneurones et gènes liés à la synaptogenèse, ce qui représente une phase de transition. Les photorécepteurs développent leur maturité au stade 3 des RO (environ après J100-D150), correspondant au troisième stade du développement du fœtus humain 6,12,13. Notamment, par rapport aux RO de stade 1 et 2, les RO de stade 3 ont une structure lamellaire distincte dont les synapses ont mûri12, y compris la présence de synapses rubanées14. De plus, une étude récente a confirmé que les synapses matures existent pour la transmission de signaux lumineux, indiquant qu’elles sont fonctionnelles13. Ainsi, les OI au stade 3 sont souvent sélectionnées pour étudier la structure synaptique.

L’immunohistochimie est largement appliquée à l’étude de l’expression de diverses protéines moléculaires. Cependant, la limite de la microscopie optique réside dans sa capacité à n’observer qu’un nombre restreint de cellules et de molécules spécifiques à la fois, ce qui entraîne un manque d’analyse complète des relations entre les cellules et leur environnement. La microscopie électronique à transmission (MET) se caractérise par une haute résolution, avec une résolution limitée de 0,1 à 0,2 nm, surpassant le microscope optique de ~10 à 20 fois15. Il compense les défauts de la microscopie optique et est utilisé pour élucider le développement rétinien et la maturation des synapses chez l’homme16,17 et diverses espèces 18,19,20,21. La MET permet de distinguer directement les composants présynaptiques et postsynaptiques18,20, et permet même l’observation complète de structures subcellulaires telles que les rubans 2,3, les vésicules22 et les mitochondries23. Par conséquent, la MET est un outil essentiel pour identifier les types de synapses et explorer l’ultrastructure des contacts synaptiques dans les OI à l’échelle nanométrique.

Il est crucial de noter que la préparation des échantillons est d’une grande importance pour l’acquisition de micrographies électroniques de haute qualité. Bien que certaines études aient effectué une EM sur les OI12, 13, 24, les procédures détaillées ne sont pas claires. Étant donné que la qualité de l’image de microscopie électronique dépend dans une large mesure de l’effet de la fixation de l’OI et de la perméation du réactif, divers facteurs importants doivent être pris en compte lors de la préparation. Par conséquent, pour mieux étudier les contacts synaptiques dans les OI, nous présentons une méthode avec une bonne reproductibilité qui montre les points de fonctionnement de la fixation, de l’intégration et de l’identification des sites d’observation.

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Protocole

1. Obtention d’offices récepteurs auprès des iPSC25

REMARQUE : Les OI ont été dérivées des iPSC en modifiant la procédure précédemment signalée.

  1. Dissocier les iPSC à ~90% de confluence à l’aide d’une protéase bactérienne (voir le tableau des matériaux). Coupez les colonies en morceaux et grattez-les avec un élévateur de cellules.
  2. Après le prélèvement, remettre en suspension les grappes de cellules dans 0,25 mL de Matrigel glacé. Après 20 min d’incubation à 37 °C, disperser le gel solidifié avec le milieu DMEM/F12 (supplément de N2 à 0,5 %, supplément de B27 à 1 %, β-mercaptoéthanol à 0,1 mM, substitut de L-glutamine à 0,2 mM, pénicilline à 100 U/mL et streptomycine à 100 mg/mL). Définissez ce temps comme le jour 0 de dérivation.
  3. Après 5 jours de culture flottante, les cellules se regroupent pour former des kystes cellulaires. Transférez ces kystes cellulaires dans une boîte de Pétri de 100 mm où ils vont maintenant adhérer et se développer.
  4. Au 15e jour, utilisez de la protéase bactérienne pour dissocier les cellules adhérentes et cultivez-les dans un milieu DMEM/F12 (supplément de 2% de B27, 0,1 mM d’acides aminés non essentiels).
  5. Le jour 21, remplacez le milieu par 20 ml de milieu contenant du sérum (milieu DMEM/F12, 8 % de FBS, 2 % de supplément B27, 100 mM de taurine et 2 mM de substitut de L-glutamine), et remplacez le milieu chaque semaine.

2. Fixation antérieure des OI

  1. Déplacez doucement l’une des OI cultivées (~D180, une taille d’environ 1~2 mm de diamètre est optimale) de la boîte de Pétri vers des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et marquez les informations pertinentes sur les OI.
    REMARQUE : Coupez les RO en deux ou coupez le tissu mal structuré avec un rasoir sous le microscope dans la boîte contenant le fixateur si les RO sont trop gros.
  2. Retirer le milieu de culture des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une pipette. Ajouter 1,5 mL de fixateur de paraformaldéhyde à 2 % de glutaraldéhyde dilué dans un tampon de phosphate (PB) à 0,1 M, pH 7,4, et fixer à température ambiante (RT) pendant 4 h. Conservez les tubes de microcentrifugation à 4 °C pendant la nuit.
    REMARQUE : Cette étape peut être interrompue pendant 1 semaine, mais il est recommandé de la redémarrer le plus tôt possible. Si les OI sont laissés plus longtemps, cela peut provoquer une autolyse des cellules conduisant à la destruction de l’ultrastructure des OI. En raison de la fragilité des OI, évitez les rotations, les oscillations, les retournements ou les opérations difficiles.

3. Post-fixation des OI

  1. Retirer le fixateur de paraformaldéhyde à 2 % et de glutaraldéhyde et laver avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 0,01 M à pH 7,4 pendant 3 x 10 min. Suspendez doucement les OI dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml pendant le processus de lavage pour un rinçage complet. Pour chaque jour supplémentaire de fixation, multipliez par deux le nombre de lavages afin d’éliminer le fixateur résiduel autant que possible.
  2. Retirez tout PBS restant à l’aide d’une pipette et remplacez-le par ~150 μL d’acide osmique à 1 % (OsO4) jusqu’à ce que les blocs de tissu soient immergés. Placez les tubes de microcentrifugation dans une boîte sombre pour les protéger de la lumière et infiltrez-les à RT pendant 1 h.
    REMARQUE : L’OsO4 est un oxydant puissant et doit être manipulé dans une hotte.

4. Taches et déshydratation

REMARQUE : Le déshumidificateur doit être allumé pour sécher l’environnement à partir de cette étape.

  1. Retirez OsO4 à l’aide d’une pipette, lavez avec 0,01 M PBS (pH 7,4) 3 x 10 min, puis lavez 3 x 10 min avec de l’eau déminéralisée.
    REMARQUE : Pour assurer un rinçage complet des RO, nous vous recommandons de suspendre les RO. Aspirez l’OsO4 dans une bouteille d’élimination dédiée.
  2. Retirez le dernier lavage à l’eau désionisée et remplacez-le par ~150 μL par tube (assurer une infiltration complète des blocs de tissus) d’acétate d’uranium et colorez-le pendant 1 à 2 h à RT. Protégez les tubes de microcentrifugation de la lumière.
  3. Retirer l’acétate d’uranium et le remplacer par 1 mL d’acétone à 50 % dans la hotte, en déshydratant pendant 10 min. Ensuite, utilisez successivement de l’acétone à 70 %, 80 %, 90 %, 100 % et 100 % pour la déshydratation en gradient des OI. Chaque déshydratation dure 10 min.
    REMARQUE : Laissez un peu de liquide tremper les RO pour chaque échange afin d’éviter l’exposition à l’air et à l’humidité. De plus, agissez rapidement dès que possible car l’acétone est volatile. Aspirer l’acétate d’uranium dans une bouteille d’élimination dédiée.

5. Infiltration

  1. Jetez l’acétone et ajoutez ~150 μL du mélange composé d’acétone et de résine Epon-812 dans un rapport de 1:1. Placez-le dans un four à 37 °C pendant 1 h.
  2. Retirez le mélange ci-dessus et remplacez-le par un mélange composé d’acétone et de résine Epon-812 dans un rapport de 1:4. Placez-le dans un four à 37 °C pendant la nuit.
  3. Transférez soigneusement les OI dans les nouveaux tubes contenant ~500 μL de résine époxy pure et placez-les dans un four à 45 °C pendant 1 h.

6. Intégration

  1. Préparez à l’avance les 30 à 50 ml de résine époxy pure dans un tube à centrifuger de 50 ml en mélangeant le kit de réactifs selon les instructions du fabricant. Faites pivoter lentement la résine époxy pure à l’envers pendant 30 minutes pour réduire les bulles d’air introduites par le mélangeur. Ensuite, laissez-le dans un four à 37 °C pendant 20 min. Ajoutez 2/3 volume de résine époxy pure dans la rainure du moule d’enrobage.
  2. Utilisez un cure-dent pour choisir les RO dans le moule d’enrobage équipé de résine époxy pure.
  3. Remplissez le sillon avec de la résine époxy pure jusqu’à ce qu’il dépasse légèrement ou renfle.
  4. Ajustez la position des RO aux deux extrémités du moule d’enrobage pour un enrobage directionnel. Placez le moule d’enrobage dans un four à 45 °C pendant 1 à 2 h, puis mettez-le dans un four à 65 °C pendant 48 à 72 h.

7. Positionnement semi-mince

  1. Poncez l’excès de résine époxy autour du tissu à partir des extrémités des quatre côtés les plus longs du bloc d’enrobage pour former une face trapézoïdale. Installez le bloc d’enrobage dans le support de montage de l’échantillon et vissez le boulon avec un tournevis en L. Ensuite, installez les couteaux en verre sur le support de couteau et serrez l’écrou manuellement.
  2. Coupez l’excès de résine jusqu’à ce que la zone souhaitée soit exposée.
  3. Remplissez l’auge du couteau en verre avec de l’eau. Coupez des tranches semi-fines sur une épaisseur de 1 μm à l’aide d’un microtome semi-fin et posez-les sur une lame de microscope à l’aide d’une aiguille.
  4. Ajouter 50 μL de bleu de toluidine à 1 % pour teindre les tranches semi-fines et incuber pendant 1 min à 95 °C sur la plaque chauffante. Rincer à l’eau distillée pendant 2 min. Utilisez un microscope optique ordinaire 20x pour observer la structure des sections.

8. Section ultra-mince

  1. Installez les blocs d’enrobage et les couteaux en verre comme décrit à l’étape 7.1. Ajustez la distance entre le couteau et le bloc de mouchoirs, le niveau de liquide de l’évier et la vitesse de tranchage. Coupez les sections ultraminces d’une épaisseur de ~70-100 nm avec un microtome ultrafin et déposez les tranches sur le treillis de cuivre (200 mailles) avec le film de support.
  2. Techez les sections ultraminces avec 3 % de citrate de plomb pendant 15 min pour améliorer le contraste dans une procédure de double coloration.

9. Imagerie des OI par MET

  1. Lancez le logiciel (voir la table des matériaux).
  2. Cliquez sur le bouton Mode mémoire et marquez grossièrement chaque section ultrafine.
  3. Recherche de structures synaptiques.
    1. Distinguer la structure laminée des OI à faible grossissement.
    2. Localisez la couche nucléaire externe (ONL), qui montre une structure nucléaire avec une densité électronique plus profonde. Par la suite, naviguez vers la terminaison du photorécepteur où de nombreuses vésicules s’accumulent. Recherchez les bornes à bâtonnets avec un seul ruban synaptique et les bornes coniques avec plusieurs rubans synaptiques.
    3. Passez à la couche plexiforme interne (IPL) et recherchez une structure similaire avec un petit ruban.
  4. Capturez l’image microscopique.
    1. Cliquez sur Démarrer et entrez la puissance de loupe correspondante.
    2. Enregistrez les images.

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Résultats

L’établissement d’OI 3D par différenciation des iPSC fournit un outil puissant pour étudier les mécanismes des maladies rétiniennes et la thérapie de remplacement des cellules souches. Bien que d’autres aient démontré les connexions synaptiques dans les OI sur le plan fonctionnel et immunocytochimique, les preuves directes de synapses conventionnelles et en ruban sont très limitées. Nous présentons ici une méthode d’étude de l’ultrastructure de deux types de synapses dans les RO par TEM. Après 180 jours de culture, les O...

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Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un protocole détaillé pour l’observation de l’ultrastructure synaptique conventionnelle et en ruban dans les OI par TEM. Ce protocole est basé sur les méthodes de préparation rétinienne décrites précédemment, avec quelques modifications20. Pour améliorer le taux de réussite du traitement des échantillons et la qualité des micrographies TEM, tenez compte des points clés suivants. Tout d’abord, il est important de reconnaître qu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus en partie par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de Chine (2022YFA1105503), du Laboratoire clé d’État des neurosciences (SKLN-202103) et de la Fondation des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (Y21H120019), de la Fondation des sciences naturelles de Chine (82070981).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de Pétri 100 mmCorning430167
AcétoneMicroscopie électronique Science10000
B27 supplémentGibcoA3582801
Cell lifterSanta Cruzsc-395251
Grilles en cuivreBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Logiciel de micrographie numériqueGatan, Inc.Logiciel
DispaseStemCell Technologies#07913Protéase bactérienne
DMEM/F12 moyenneGibco#11320033
Moule d’enrobageBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Epon-812 résineMicroscopie électronique Science#14900
Sérum de veau fœtal (FBS)Biological Industries#04-0021A
GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
hiPSCShownin Biotechnology Co., Ltd.RC01001-A
Citrate de plombBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061Substitut de L-glutamine
MatrigelCorning356234
Lame de microscopeCITOTEST80312-3161
Supplément N2Gibco17502048
Na2HPO4· ; 12H2OSigma71650Un composant de PB/PBS
NaH2PO4· ; H2OSigma71507Un composant de PB/PBS
Acides aminés non essentielsSigma#M7145
Microscope optiqueLaboratoire Microscope biologique binoculaireXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
FourBluepardBPG9040A
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Science157-8
Pénicilline-StreptomycineGibco#15140-122
Microtome semi/ultraminceReichert-Jung396649
TaurineSigma#T0625
Bleu de toluidineSangon BiotechE670105-0100
Microscopes électroniques àtransmissionHITACHIH-7500
Acétate d’uranyleTED PELLACA96049
&beta ;-mercaptoéthanolSigma444203
AZH400HHGZ10592GZ02618

Références

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