Article de méthode

Technique d’élevage in vitro pour l’étude de la dynamique cellulaire dans les écailles de poisson-zèbre

DOI :

10.3791/66619

⸱

10 janvier 2025

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole propose une méthode pour étudier la dynamique cellulaire à l’aide d’une technique de culture in vitro simple. Il offre aux chercheurs et aux éducateurs du poisson-zèbre l’occasion d’étudier les processus cellulaires, tels que ceux liés à l’homéostasie osseuse et à la biologie cellulaire de base, en visualisant les noyaux fluorescents et les cellules apoptotiques à l’intérieur des échelles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les écailles de poisson-zèbre offrent une variété d’avantages pour une utilisation dans les laboratoires standard à des fins d’enseignement et de recherche. Les écailles sont facilement collectées sans qu’il soit nécessaire de les euthanasier, se régénèrent en quelques semaines et sont translucides et petites, ce qui permet de les observer à l’aide d’un microscope standard. Les écailles de poisson-zèbre sont particulièrement utiles dans les environnements éducatifs, car elles offrent aux étudiants une occasion unique de s’engager dans des expériences d’apprentissage pratiques, en particulier dans la compréhension de la dynamique cellulaire et des méthodes de culture in vitro . L’objectif principal de ce protocole est de décrire une méthode de collecte et de conservation des écailles de poisson-zèbre en élevage pour une utilisation dans une variété d’études biologiques à l’aide d’équipements de laboratoire de base. De plus, le protocole détaille leur utilisation dans la compréhension de l’homéostasie osseuse en examinant l’activité des cellules osseuses impliquées dans la résorption et le dépôt osseux. Il comprend également des protocoles supplémentaires pour des techniques générales, telles que la visualisation des noyaux et des cellules apoptotiques. Le protocole de culture in vitro produit des résultats fiables avec un minimum de réactifs et d’équipements. Cet article traite des avantages de l’utilisation de cultures in vitro d’écailles de poisson-zèbre pour favoriser la recherche scientifique et décrit les ressources nécessaires pour soutenir leur intégration dans les milieux éducatifs.

Introduction

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Ces dernières années, le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle précieux dans divers domaines scientifiques, notamment la génétique, la biologie du développement et la toxicologie 1,2,3. Le poisson-zèbre est un petit poisson tropical d’eau douce originaire des rivières d’Asie du Sud-Est4. Ils sont devenus un organisme modèle populaire en biologie en raison de leur entretien facile, de leur petite taille, de leur cycle de reproduction rapide et de leurs embryons translucides1. Cela permet d’observer facilement leur développement interne, ce qui les rend idéaux pour l’étude de divers processus biologiques en biologie du développement. Le poisson-zèbre partage des similitudes génétiques avec les humains ; Environ 70% des gènes humains ont au moins un équivalent poisson-zèbre, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les troubles génétiques et les maladies chez l’homme 5,6. En manipulant des gènes spécifiques chez le poisson-zèbre, les chercheurs peuvent obtenir des informations précieuses sur la fonction et le comportement des gènes, qui peuvent ensuite être appliquées à la recherche en santé humaine6, à l’édition de gènes et à la création de lignées transgéniques 7,8.

Les écailles du poisson-zèbre se régénèrent après avoir été retirées 9,10 et peuvent être cultivées pendant un à trois jours avec un incubateur de base (sans CO2) pendant qu’elles sont utilisées pour des expériences11. L’utilisation d’écailles de poisson-zèbre est avantageuse dans les laboratoires de base, car elles peuvent être retirées des poissons anesthésiés sans avoir besoin d’euthanasie. Les écailles de poisson-zèbre sont un composant du squelette dermique, composé principalement de deux couches : la couche interne, qui est épaisse et constituée de tissu partiellement minéralisé formé par des couches de fibrilles de collagène, et la couche externe, qui est fortement minéralisée et contient un réseau de fibrilles de collagène entrelacées12,13 (Figure 1A-C). Ces caractéristiques morphologiques et cellulaires de l’échelle sont facilement observées au microscope composé standard. Ces caractéristiques font des écailles de poisson-zèbre un bon modèle pour l’étude cellulaire et moléculaire. Par exemple, les écailles de poisson-zèbre ont été utilisées pour étudier l’homéostasie osseuse, y compris l’activité des cellules osseuses11,12. Ils ont également été utilisés pour comprendre la régénération tissulaire 9,14,15, les voies génétiques et la signalisation14,16, le métabolisme17, les études du microbiote18, etc. Le poisson zèbre, comme les autres téléostéens, est également très sensible aux facteurs environnementaux tels que les polluants et les toxines 19,20,21,22. En tant que telles, les écailles de poisson sont utilisées pour étudier l’exposition aux toxines dans les populations de poissons. Ces caractéristiques font des échelles un excellent modèle pour enseigner aux élèves les impacts des facteurs environnementaux sur les organismes vivants. De plus, les écailles des lignées de poissons-zèbres transgéniques, telles que Tg(osterix :mCherry) et Tg(runx2a :GFP), pourraient ajouter un autre niveau de complexité aux expériences des étudiants.

En résumé, en utilisant des écailles de poisson-zèbre, les chercheurs peuvent concevoir et mener des expériences pour étudier divers aspects de la biologie, des mécanismes cellulaires aux changements environnementaux. Le poisson-zèbre est également une ressource précieuse dans l’enseignement supérieur, car il peut fournir des expériences pratiques en matière de conception expérimentale, de collecte de données et d’analyse. Le poisson-zèbre peut également être utilisé dans des cours avancés et des programmes axés sur la recherche pour explorer des domaines d’intérêt spécifiques. Cet article décrit un protocole d’utilisation des écailles de poisson-zèbre dans les environnements de recherche et d’apprentissage en classe.

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Protocole

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Tous les protocoles décrits ici suivent les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvés chaque année par le comité de protection des animaux de l’Université Saint Mary’s et de l’Université Mount Saint Vincent sous les numéros de protocole 20-14 et 21-12. Avant d’appliquer ce protocole, les utilisateurs doivent s’assurer que les lignes directrices fédérales et provinciales sur l’utilisation des animaux en recherche ou en enseignement sont respectées23. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des réactifs pour la culture de tartre

  1. Préparez le milieu DMEM avec HEPES (10 g de poudre de DMEM, 5,95 g de HEPES, dans 1 L d’eau distillée ou dH2O, pH : 6,91), aliquotez-vous et conservez-le à 4 °C.
  2. Préparez le milieu de culture - solution de travail (88 % de milieu DMEM avec HEPES, 10 % de sérum fœtal bovin et 2 % de pénicilline-streptomycine [5000 unités de pénicilline et 5 mg de streptomycine par ml] ajustée au volume nécessaire le jour de la réalisation de l’expérience.
    REMARQUE : La solution de travail doit être préparée fraîche tous les jours et ne peut pas être conservée. Le milieu de culture doit être conservé au froid (à 4 °C ou sur glace) jusqu’à ce qu’il soit utilisé.
  3. Aliquote la solution de travail du milieu de culture dans les récipients dans lesquels l’expérience sera réalisée. Dans ce cas, des tubes de 0,2 mL ou une plaque de 96 puits ont été utilisés. Conservez ces aliquotes sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    REMARQUE : Cette solution doit être préparée fraîche et ne peut pas être conservée plus de 1 jour. Voir le tableau 1 pour tous les réactifs.

2. Retirer les écailles des poissons vivants

  1. Préparez un récipient ou un réservoir pour le poisson-zèbre avec un volume d’eau d’environ 2 L pour 4-5 poissons adultes.
    REMARQUE : Les paramètres typiques de l’eau qui conviennent au poisson-zèbre sont pH 7,5, température 28,5 °C, conductivité 640-781 μS et un cycle de lumière sombre de 12-12 heures. Assurez-vous que la température est constamment maintenue dans le réservoir.
  2. Utilisez un filet de pêche pour capturer 4 à 5 poissons-zèbres adultes et placez-les dans le réservoir de stockage de poisson-zèbre préparé ci-dessus.
  3. Préparez un contenant d’au moins 60 ml d’eau où le poisson sera anesthésié.
    REMARQUE : Le poisson doit pouvoir se déplacer dans le récipient et être suffisamment profond pour l’empêcher de sauter. Ce récipient doit contenir du méthane-sulfonate de tricaïne tamponné à 0,01 % (MS222), qui doit être composé d’eau de poisson-zèbre (dilué à 0,1 % de MS222, qui est préparé avec 0,3 g de MS222, 615 μL de 1 M de NaOH dans 300 mL de système d’eau de poisson zèbre, dix fois).
    ATTENTION : Les personnes qui mènent ces expériences doivent avoir l’approbation du comité d’éthique animale de l’établissement pour capturer, anesthésier et manipuler le poisson-zèbre. De même, l’anesthésique utilisé est une faible concentration de méthane-sulfonate de tricaïne (MS222), qui est un produit chimique couramment utilisé en biologie des poissons, mais qui nécessite une manipulation appropriée, comme un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants en nitrile jetables, des lunettes de sécurité/lunettes anti-éclaboussures et une blouse de laboratoire (voir la fiche de données de sécurité du MS222 pour plus d’informations).
  4. Préparez un contenant de récupération avec les mêmes spécifications que celles utilisées précédemment à l’étape 1 (au moins 2 L d’eau) où le poisson sera placé après l’enlèvement des écailles. Ce récipient doit avoir suffisamment d’espace et les bons paramètres d’eau, comme indiqué ci-dessus.
  5. À l’aide d’un filet, transférez avec précaution un seul poisson-zèbre adulte dans le récipient contenant 0,01 % de MS222. Attendez que le poisson soit complètement immobile et qu’il ait un mouvement operculaire minimal (cela prend généralement moins de 10 minutes).
    REMARQUE : Toute cette étape est effectuée un poisson à la fois. Ne pas anesthésier le poisson suivant tant que les écailles n’ont pas été retirées avec succès du poisson manipulé et que ce poisson n’a pas été transféré dans le récipient de récupération.
  6. Placez individuellement le poisson-zèbre adulte sur une boîte de Pétri inversée recouverte d’une serviette en papier humide.
  7. À l’aide d’un stéréomicroscope de dissection et à l’aide d’une pince fine, retirez un maximum de 10 à 12 écailles d’un poisson. Les écailles sont retirées de la région latérale du poisson, où les écailles sont plus grandes et ont une taille plus constante par rapport aux autres parties du corps (figure 2). Les deux côtés du poisson peuvent être utilisés.
    1. Retirez les écailles une à la fois en tirant doucement dans la direction naturelle de l’écaille (c’est-à-dire dans la direction de l’avant vers l’arrière). Cela doit être fait le plus rapidement possible.
  8. Placez chaque balance dans un tube séparé de 0,2 mL contenant la solution de travail du milieu de culture des cochenilles (préparée à l’étape 1.1) pour éviter que les cochenilles ne se dégradent. Une plaque à 96 puits peut être utilisée comme alternative.
    REMARQUE : L’isolement des balances individuelles dans des tubes ou des puits séparés empêche les balances de coller ensemble et permet le suivi des balances individuelles qui peuvent être nécessaires pour plusieurs expériences.
  9. Si l’expérience spécifique nécessite un traitement à l’échelle, appliquez-le à cette étape. Pour obtenir des exemples de certains protocoles, reportez-vous aux étapes 4 et 5.
  10. Placez les tubes avec les balances dans un incubateur à 28 °C. Le milieu de culture doit être changé toutes les 24 heures (avec la solution de travail du milieu de culture). Un incubateur sansCO2 a été utilisé pour les expériences décrites ici.
  11. Après l’enlèvement des écailles, remettez soigneusement le poisson-zèbre dans le réservoir de récupération et surveillez jusqu’à ce que le mouvement reprenne. Une pipette ou une pierre d’aération est utilisée pour fournir de l’air dans le réservoir afin d’accélérer la récupération.
  12. Une fois le mouvement rétabli, remettez le poisson-zèbre dans un bassin d’élevage régulier. N’oubliez pas de garder les poissons qui ont été utilisés séparément de tous les autres poissons afin qu’ils puissent se rétablir séparément et de garder une trace des poissons qui régénèrent activement leurs écailles.
  13. Attendez ~2 semaines avant de répéter l’ablation des écailles de ces mêmes poissons. Cela leur laisse le temps de régénérer naturellement leurs écailles.

3. Fixation des écailles

  1. Lavez les balances trois fois avec 200 μL de 1x de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préparée à partir de 10x PBS (pour 1 L, ajoutez 80 g de NaCl, 2 g de KCl et 11,2 g de Na2HPO4, ajoutez dH2O jusqu’à 1 L).
  2. Retirez le 1x PBS et ajoutez 200 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant la nuit à 4 °C. Pour 100 ml de PFA, ajoutez 4 g de paraformaldéhyde et 0,1 g de NaOH, puis ajoutez 1 fois le PBS jusqu’à 100 ml. Mélangez sur une plaque chauffante réglée à feu doux et remuez jusqu’à ce que la solution soit claire, puis laissez la solution refroidir et stabiliser le pH à 7,4. Conserver à -20 °C. Pour plus de détails, veuillez consulter le Fichier supplémentaire 1 (Tableau 1).
  3. Après la fixation, lavez les balances trois fois avec 200 μL de 1x PBS. Stockez les balances à 4 °C.
    ATTENTION : Le PFA est nocif. Reportez-vous à la fiche de données de sécurité pour plus d’informations. Tous ces processus nécessitent une manipulation appropriée, comme un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants en nitrile jetables, des lunettes de sécurité/lunettes anti-éclaboussures et une blouse de laboratoire.

4. L’homéostasie osseuse

REMARQUE : Deux procédures d’homéostasie osseuse sont décrites ci-dessous. La coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et au phosphate alcalin (AP) est généralement utilisée pour identifier les ostéoclastes et les ostéoblastes actifs, respectivement. Les ostéoclastes résorbent la matrice osseuse tandis que les ostéoblastes déposent la matrice osseuse. L’AP est la principale enzyme libérée par les ostéoblastes lors de la formation osseuse, tandis que la TRAP est sécrétée par les ostéoclastes dans l’espace acide entre l’ostéoclaste et la matrice osseuse, aidant à la dégradation et à la résorption osseuses 24,25,26. Ce protocole est également disponible sur The Zebrafish Information Network27et a été publié précédemment28. La phosphatase alcaline est une enzyme produite par plusieurs types de cellules dans le cadre du processus métabolique. Ce processus n’est pas entièrement spécifique aux ostéoblastes, mais dans le tissu osseux, il est utilisé comme marqueur de la fonction des ostéoblastes.

  1. Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)
    1. Placez chaque balance fixe dans un tube de 0,2 mL ou une plaque à 96 puits avec 200 μL de dH2O. Lavez les balances en ajoutant et en retirant environ 150 μL de dH2O pendant 15 minutes trois fois. Pour plus de détails, veuillez consulter le Fichier supplémentaire 1 (Tableau 2).
    2. Retirez les écailles du tube ou du puits de 0,2 mL et placez-les dans un nouveau tube contenant 200 μL de tampon de tartrate de 50 mM. Incuber 1 h à température ambiante.
      1. Pour 100 mM de tampon de tartrate, préparez un récipient en verre, ajoutez 2,3 g d’acide tartrique et mélangez-le avec un tampon d’acétate 0,2 M (pH 5,5) jusqu’à ce que 100 mL de solution. Bien mélanger et conserver à 4 °C. Pour préparer 50 mM de tampon de tartrate, ajoutez des volumes égaux de dH2O et 100 mM de tampon de tartrate. Pour plus de détails, veuillez consulter le fichier supplémentaire 1 (tableau 3 et tableau 4).
    3. Retirer le tampon de tartrate du tube et ajouter 200 μL de solution de substrat TRAP. Incuber les échantillons pendant 1 h à température ambiante. Assurez-vous que les échantillons restent dans l’obscurité.
      1. Préparez un récipient en verre foncé et ajoutez 30 ml de tampon de tartrate de 100 mM, 1 mL de PRS hexazotisé (solution de chlorhydrate de pararosaniline) et 2 mL de solution de substrat enzymatique. Bien mélanger.
        REMARQUE : Cette solution ne peut pas être stockée ; Gardez-le dans l’obscurité à température ambiante pendant l’utilisation. Pour les solutions nécessaires à la préparation de la solution de substrat TRAP, veuillez consulter le fichier supplémentaire 1 (tableaux 5 à 9).
    4. Retirez la solution de substrat TRAP et lavez les écailles en ajoutant et en enlevant environ 150 μL de dH2O pendant 15 min, trois fois.
    5. Retirez les écailles du tube et placez-les dans un nouveau tube ou un puits avec 200 μL de glycérol à 80 % (pour 100 ml, mélangez 80 ml de glycérol avec 20 mL de dH2O) enveloppés dans du papier d’aluminium pour éviter la décoloration et stockez-les à 4 °C.
    6. Pour visualiser les écailles au microscope, utilisez une lame de dépression ou concave.
  2. Coloration au phosphate alcalin (AP)
    1. Placez chaque balance fixe dans un tube de 0,2 mL ou une plaque à 96 puits avec 200 μL de dH2O et lavez-les en ajoutant et en retirant environ 150 μL de dH2O pendant 15 min, trois fois. Pour plus de détails, veuillez consulter le Fichier supplémentaire 1 (Tableau 2).
    2. Retirez les écailles des tubes ou des puits de 0,2 mL et placez-les dans un nouveau tube contenant 200 μL de tampon tris-maléate et incubez-le pendant 1 h à température ambiante.
      1. Pour ce tampon, préparez un récipient en verre et ajoutez 0,605 g de tampon tris et 0,55 g d’acide maléique. Ajouter dH2O jusqu’à 25 mL et bien mélanger. Stabiliser à pH 8,3. Conserver à 4 °C. Pour plus de détails, veuillez consulter le fichier supplémentaire 1 (tableau 10).
    3. Retirer le tampon tris-maléate du tube et ajouter 200 μL de solution de substrat AP. Incuber 1 h à température ambiante. Assurez-vous que les échantillons restent dans l’obscurité.
      1. Pour cette solution, préparez un récipient en verre foncé, ajoutez 8 mg de sel de diazonium et mélangez-le avec 0,1 ml de phosphate de napthol-AS-TR dans du N,N-diméthylformamide et 10 ml de tampon de tris-maléate (pH 8,3), en remuant bien. Préparez cette solution fraîche. Pour plus de détails, veuillez consulter le Fichier supplémentaire 1 (Tableau 11).
    4. Retirez la solution de substrat AP et lavez les écailles en ajoutant et en enlevant 200 μL de dH2O pendant 15 min, trois fois.
    5. Retirez les écailles du tube et placez-les dans un nouveau tube ou un puits avec 200 μL de glycérol à 80 % enveloppé dans du papier d’aluminium pour éviter la décoloration. Conserver à 4 °C.
    6. Pour visualiser les écailles à l’aide d’un microscope, placez les écailles sur une lame concave ou de dépression.
      ATTENTION : La plupart des réactifs utilisés dans la coloration TRAP et AP peuvent être nocifs. Reportez-vous à la fiche de données de sécurité de chaque produit chimique. Toutes ces procédures nécessitent une manipulation appropriée, comme un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants en nitrile jetables, des lunettes de sécurité/lunettes anti-éclaboussures et une blouse de laboratoire.

5. Visualiser la dynamique cellulaire dans les écailles de poisson-zèbre

REMARQUE : Une gamme de méthodes de coloration peut être utilisée pour visualiser les différences entre les échelles et pour étiqueter les cellules à l’intérieur de l’échelle (Figure 3B). Par exemple, les méthodes de coloration des noyaux et des lysosomes dans les cellules de l’échelle sont décrites ci-dessous.

  1. Coloration DAPI pour la visualisation des noyaux cellulaires
    REMARQUE : Le DAPI est utilisé pour marquer les noyaux de toutes les cellules en marquant l’ADN. Le DAPI est un marqueur fluorescent qui se lie fortement aux régions enrichies en adénine et en thymine dans les séquences d’ADN.
    1. Avant d’utiliser le DAPI, assurez-vous que les balances sont fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % (étape 3). Lavez les balances avec 200 μL 1x PBS pendant 5 min après la fixation.
    2. Préparez une solution de travail DAPI dans une dilution de 1:10 comme suit. Mélangez 1 μL de DAPI avec 9 μL de 1x PBS pour obtenir un volume total de 10 μL.
    3. Après avoir préparé la solution de DAPI, à l’aide d’une pince ou d’une pipette en plastique, placez la balance sur une lame concave, retirez l’excès de PBS et ajoutez environ 10 μL de la solution de DAPI préparée.
      REMARQUE : Le DAPI colorera immédiatement l’écaille, de sorte qu’elle peut être visualisée à l’aide d’un microscope à fluorescence avec une longueur d’onde d’excitation de 352 à 402 nm et une longueur d’onde d’émission de 417 à 477 nm. Le DAPI colorera tous les noyaux cellulaires d’une couleur bleu vif. Afin de voir toute l’échelle dans le champ de vision, l’objectif 4x a été utilisé. Des noyaux colorés simples sont visibles à l’aide de l’objectif 20x.
    4. Comptez le nombre de noyaux colorés au DAPI afin de déterminer le nombre de cellules dans l’échelle.
  2. Coloration apoptotique pour la visualisation de la mort cellulaire dans des échantillons vivants
    REMARQUE : Des colorants fluorescents peuvent être utilisés pour marquer les cellules apoptotiques. Par exemple, le protocole de marqueur de fluorescence utilisé ici est destiné aux environnements acides et peut être utilisé pour le marquage et le traçage d’organites acides comme les lysosomes. Une augmentation du nombre de ces organites est corrélée à une augmentation de la mort cellulaire. Cette coloration doit être appliquée sur des écailles non fixées qui sont soit fraîchement arrachées, soit cultivées jusqu’à 2 jours.
    1. Préparez une solution de colorant fluorescent pour le suivi de l’apoptose selon les instructions du fabricant en utilisant le milieu de culture comme diluant.
      REMARQUE : La concentration de la coloration fluorescente peut changer radicalement en fonction de la méthode d’apoptose utilisée. Reportez-vous au protocole commercial de la coloration de votre choix pour des détails spécifiques sur les concentrations recommandées.
    2. Retirez délicatement le milieu de culture de chaque tube ou puits de 0,2 mL d’une plaque à 96 puits si les écailles ont déjà été cultivées.
    3. Ajoutez suffisamment de solution de coloration fluorescente pour couvrir toute la balance (environ 50 μL).
    4. Couvrez tous les tubes de papier d’aluminium pour éviter qu’ils ne se décolorent et laissez agir 30 min.
    5. Retirez la solution de coloration fluorescente des tubes ou des puits.
    6. Lavez les échantillons en ajoutant 200 μL de 1x PBS dans les tubes ou les puits pendant 5 min.
    7. Retirer le PBS et ajouter 200 μL de PFA à 4 % dans les tubes ou les puits pour fixer les échantillons pendant 1 h à température ambiante.
    8. Laver les échantillons en ajoutant 200 μL 1x PBS dans les tubes ou les puits pendant 5 min.
    9. Transférez les balances dans un nouveau tube ou puits de 0,2 ml et ajoutez 200 μL de PBS frais 1x. Couvrez ces tubes/puits dans du papier d’aluminium pour éviter la décoloration. Conserver à 4 °C.
    10. Pour visualiser les échelles à l’aide d’un microscope à fluorescence, utilisez une lame concave ou à dépression et le bon filtre. Le signal fluorescent utilisé ici a une excitation et une émission maximales de 577-590 nm. La coloration fluorescente montre des cellules apoptotiques contenant des lysosomes en rouge.
    11. Comptez le nombre de cellules colorées afin de déterminer le nombre de cellules subissant l’apoptose.
      REMARQUE : Une feuille d’aluminium est utilisée pendant la coloration et le stockage pour éviter la décoloration. Les échantillons peuvent être conservés dans l’obscurité pendant quelques heures, voire quelques jours, selon la coloration fluorescente utilisée. Pour conserver les échantillons fluorescents pendant de plus longues périodes, utilisez un protocole de fixation et de montage compatible avec le colorant fluorescent. Toutes les couleurs fluorescentes ont été visualisées à l’aide d’un microscope à fluorescence avec un grossissement d’au moins 20x. Le filtre utilisé était le suivant : pour DAPI 417-477 nm ; pour le suivi de l’apoptose 577-590 nm.

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Résultats

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Récemment, ce protocole de culture à l’échelle a été utilisé pour étudier l’homéostasie osseuse11. Les cochenilles peuvent survivre dans le milieu de culture pendant au moins 2 jours. Le nombre de cellules apoptotiques a été analysé chaque jour de culture, jusqu’à un maximum de trois jours, en comptant les cellules marquées. Ces résultats ont montré que les cellules apoptotiques augmentaient significativement le troisième jour de culture, indiquant que le temps de culture devrait être limité à deu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les écailles de poisson-zèbre sont un modèle in vitro facilement accessible pour étudier une variété de processus biologiques différents qui peuvent être maintenus jusqu’à 2 jours à l’aide d’une méthode d’élevage et d’un incubateur pour simuler leur environnement naturel11. Les balances ont une distribution régulière et proportionnelle des cellules présentes, ce qui permet aux chercheurs de visualiser, de compter et d’étiqueter les cellules et de mener de...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le personnel de l’installation aquatique de l’Université Mount Saint Vincent et tous les membres du laboratoire de développement osseux Franz-Odendaal d’avoir fourni les soins nécessaires aux poissons. Un grand merci à Alisha McNeil, Keely A. MacLellan et Shirine Jeradi pour leur aide dans l’optimisation de certains protocoles. Cette recherche a été financée par l’Agence spatiale canadienne (ASC) [19HLSRM01] et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de 0,2 mLn/an/a
37 % HCl  ;EMDHX0603-4Pour la stabilisation du pH et la préparation de la lame
concaven/an/a
DAPIVectashieldH-1200Pour la visualisation des noyaux cellulaires
Sel de diazonium (Fast Blue B)SigmaD9805Pour la solution de substrat AP
Poudre Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  ;Sigma  ;D5523Pour milieux de culture à l’échelle
Méthanesulfonate de 3-aminobenzoate d’éthyle (MS222)  ;Sigma  ;E10521Pour la préparation de 0,1 % MS222
Sérum fœtal bovin  ;Sigma  ;F4135Pour milieux de culture à l’échelle
Microscope à fluorescencen/an/a
Acide acétique glacial  ;Fisher  ;A38 212Pour tampon d’acétate
GlycérolVWRBDH1172-4LPPour 80 % de glycérol - balances de stockage
HEPES  ;ThermoFisher  ;15630106Pour les milieux de culture à grande échelle  ;
Plaque chauffanten/an/a
KCl  ;SigmaP217-10Pour la préparation du PBS
LysotrackerThermoFisherL7528Pour la visualisation des lysosomes
Acide maléiqueSigmaM0375Pour le tampon Tris-Maleate  ;
Micropipetten/an/a
N,N-diméthylformamideSigma319937Pour solution de substrat AP
N,N-diméthylformamide  ;Sigma319937pour solution de substrat enzymatique
Na2HPO4  ;EMDSX0720-1Pour la préparation du
PBS NaCl  ;Sigma  ;S9888Pour la préparation du PBS
NaNO2SigmaS-2252Pour 4 % de NaNO2
NaOH  ;SigmaS5881Pour la préparation de 4 % de PFA
NaOH  ;Sigma  ;S5881Pour la fixation du tartre et la stabilisation du pH
Napthol-AS-TR-phosphateSigmaN6125Pour la solution de substrat AP
Napthol-AS-TR-phosphate  ;SigmaN6125Pour Solution de substrat enzymatique
Chlorhydrate de pararosaniline  ;SigmaP3750Pour PRS
Pénicilline-streptomycine 5000 unités de pénicilline et 5mg de streptomyocine/mlThermoFisher  ;15140122Pour les milieux de culture à grande échelle  ;
Équipement de protection individuelle (EPI) : gants en nitrile jetables, lunettes de sécurité/lunettes anti-éclaboussures et blouse de laboratoire.n/an/a
PFA  ;Sigma  ;P6148Pour la fixation du tartre
Acétate de sodiumSigma  ;S2889Pour tampon d’acétate
Microscope composé standardn/an/a
Plaque d’agitationn/an/a
SigmaT6521Pour tampon tartrate
Base TrisRoche03 118 142 001Pour tampon Tris-Maleate  ;
PRS

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. New York. (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Drug Safety Eval: Met Prot. , 271-279 (2011).
  4. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  5. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  6. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 37, 1-29 (2021).
  8. Brito, R. S., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Sci Total Environ. 848, 157665(2022).
  9. Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biol. 20 (1), 1-25 (2022).
  10. Sire, J., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae), using scale regeneration. J Exp Zool. 286 (3), 297-304 (2000).
  11. Carvajal-Agudelo, J. D., McNeil, A., Franz-Odendaal, T. A. Effects of simulated microgravity and vibration on osteoblast and osteoclast activity in cultured zebrafish scales. Life Sci Space Res. 38, 39-45 (2023).
  12. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell Tissue Res. 350, 69-75 (2012).
  13. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. The zebrafish scale as model to study the bone mineralization process. J Mol Histol. 43, 589-595 (2012).
  14. De Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporos Int. 25, 567-578 (2014).
  15. Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 437 (2), 105-119 (2018).
  16. Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, e37001(2018).
  17. Carnovali, M., Luzi, L., Banfi, G., Mariotti, M. Chronic hyperglycemia affects bone metabolism in adult zebrafish scale model. Endocr. 54, 808-817 (2016).
  18. Burns, A. R., Guillemin, K. The scales of the zebrafish: Host-microbiota interactions from proteins to populations. COMICR. 38, 137-141 (2017).
  19. Vieira, E. F. S., et al. The use of freshwater fish scale of the species Leporinus elongatus as adsorbent for anionic dyes: An isothermal calorimetric study. J Therm Anal Calorim. 109 (3), 1407-1412 (2012).
  20. Ighalo, J. O., Eletta, O. A. A. Recent advances in the biosorption of pollutants by fish scales: A mini-review. Chem Eng Commun. 208 (9), 1301-1312 (2021).
  21. Eletta, O. A. A., Ighalo, J. O. A review of fish scales as a source of biosorbent for the removal of pollutants from industrial effluents. J Res Inf Civ Eng. 16 (1), 2479-2510 (2019).
  22. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  23. CCAC Canadian Council of Animal Care (CCAC). , https://ccac.ca/ (2024).
  24. Suzuki, N., Hattori, A. Melatonin suppresses osteoclastic and osteoblastic activities in the scales of goldfish. J. Pineal Res. 33 (4), 253-258 (2002).
  25. Suzuki, N., et al. Effect of vibration on osteoblastic and osteoclastic activities: Analysis of bone metabolism using goldfish scale as a model for bone. ASR. 40 (11), 1711-1721 (2007).
  26. Kawakami, K., et al. z Trap: zebrafish gene trap and enhancer trap database. BMC Dev Biol. 10, 1-10 (2010).
  27. ZFIN The Zebrafish Model Organism Database.. , https://zfin.org/ (2024).
  28. Edsall, S. C., Franz-Odendaal, T. A. A quick whole-mount staining protocol for bone deposition and resorption. Zebrafish. 7 (3), 275-280 (2010).
  29. Howe, D. G., et al. the Zebrafish Model Organism Database: Increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D854-D860 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  31. Barresi, M. J., et al. Zebrafish in the Classroom. Zebrafish. 5 (3), 205-208 (2008).
  32. Ghods, S., et al. On the regeneration of fish scales: Structure and mechanical behavior. J Exp Biol. 223 (10), jeb211144(2020).
  33. Krishnan, S., Sekar, S., Katheem, M. F., Krishnakumar, S., Sastry, T. P. Fish scale collagen-A novel material for corneal tissue engineering. Artif Organs. 36 (9), 829-835 (2012).
  34. Zhao, S., et al. A novel porous nanocomposite of sulfur/carbon obtained from fish scales for lithium-sulfur batteries. J Mater Chem. 1 (10), 3334-3339 (2013).
  35. Kumar, R., et al. A noninvasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. IJEB. 45 (11), 992-999 (2007).
  36. Hutchinson, J. J., Trueman, C. N. Stable isotope analyses of collagen in fish scales: Limitations set by scale architecture. J Fish Biol. 69 (6), 1874-1880 (2006).
  37. Kumari, S., Rath, P. K. Extraction and characterization of chitin and chitosan from (Labeo rohit) fish scales. Procedia Mater Sci. 6, 482-489 (2014).
  38. Stepnowski, P., Ólafsson, G., Helgason, H., Jastorff, B. Preliminary study on chemical and physical principles of astaxanthin sorption to fish scales towards applicability in fisheries waste management. Aquac. 232 (1-4), 293-303 (2004).
  39. Ghods, S., Murcia, S., Ossa, E. A., Arola, D. Designed for resistance to puncture: The dynamic response of fish scales. J Mech Behav Biomed Mater. 90, 451-459 (2019).
  40. Yang, W., et al. Protective role of Arapaima gigas fish scales: Structure and mechanical behavior. Acta Biomater. 10 (8), 3599-3614 (2014).
  41. Zhu, D., Zhang, C., Liu, P., Jawad, L. A. Comparison of the morphology, structures and mechanical properties of teleost fish scales collected from New Zealand. J. Bionic Eng. 16, 328-336 (2019).
  42. Witzmann, F. Morphological and histological changes of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition. Acta Zool. 92 (3), 281-302 (2011).
  43. Ibañez, A. L., Cowx, I. G., O'Higgins, P. Geometric morphometric analysis of fish scales for identifying genera, species, and local populations within the Mugilidae. Can J Fish Aquat Sci. 64 (8), 1091-1100 (2007).

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Hom ostasie osseuseActivit des cellules osseusesCollecte d caillesR sorption osseuseD p t osseuxMicroscope dissectionPerturbation environnementale

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