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SYSTÈME DE SYNTHÈSE DE PROTÉINES ACELLULAIRES POUR LA CONSTRUCTION DE CELLULES SYNTHÉTIQUES

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DOI :

10.3791/66626

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19 avril 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit le système de synthèse des protéines libres (CFPS) utilisé dans la construction des cellules synthétiques. Il décrit les étapes clés avec des résultats représentatifs dans différents micro-compartiments. Le protocole vise à établir les meilleures pratiques pour divers laboratoires de la communauté des cellules synthétiques, faisant ainsi progresser le développement des cellules synthétiques.

Résumé

Le système de synthèse des protéines acellulaires (CFPS) a été largement utilisé pour faciliter l’assemblage ascendant des cellules synthétiques. Il sert d’hôte à la machinerie de base du Dogme Central, se dressant comme un châssis optimal pour l’intégration et l’assemblage de divers systèmes de mimétisme cellulaire artificiel. Malgré son utilisation fréquente dans la fabrication de cellules synthétiques, la mise en place d’un système CFPS adapté et robuste pour une application spécifique reste un défi non négligeable. Dans cet article sur les méthodes, nous présentons un protocole complet pour le système CFPS, couramment utilisé dans la construction de cellules synthétiques. Ce protocole englobe des étapes clés dans la préparation du système CFPS, y compris l’extrait cellulaire, la préparation de la matrice et l’optimisation de l’expression de routine à l’aide d’une protéine rapporteure fluorescente. De plus, nous montrons des résultats représentatifs en encapsulant le système CFPS dans divers micro-compartiments, tels que des gouttelettes monocouches, des vésicules à double émulsion et des chambres situées au sommet de bicouches lipidiques soutenues. Enfin, nous élucidons les étapes critiques et les conditions nécessaires à la réussite de l’assemblage de ces systèmes CFPS dans des environnements distincts. Nous nous attendons à ce que notre approche facilite l’établissement de bonnes pratiques de travail entre les différents laboratoires au sein de la communauté des cellules synthétiques en constante expansion, accélérant ainsi les progrès dans le domaine du développement des cellules synthétiques.

Introduction

La synthèse de cellules synthétiques ou artificielles est devenue un domaine de recherche interdisciplinaire très important, suscitant un intérêt considérable de la part des scientifiques dans les domaines de la biologie synthétique, de la chimie et de la biophysique. Ces scientifiques sont unis par l’objectif commun de construire une cellule vivante minimale 1,2,3. La croissance rapide de ce domaine a été en phase avec des avancées significatives dans des technologies critiques, telles que la manipulation de l’ADN recombinant4, les matériaux biomimétiques5 et les techniques de microfabrication pour la compartimentation6, y compris la méthode de synthèse de protéines libres (CFPS)7. Les systèmes CFPS englobent la machinerie cellulaire essentielle à la transcription et à la traduction, fournissant le cadre fondamental pour le développement et l’intégration de cellules artificielles multifonctionnelles.

Bien que les techniques CFPS soient fréquemment utilisées dans l’assemblage de cellules synthétiques, le développement d’un système CFPS robuste et adapté à l’assemblage de divers systèmes de cellules synthétiques reste un défi complexe. À l’heure actuelle, il existe de nombreux systèmes CFPS, dérivés à la fois de procaryotes et d’organismes modèles eucaryotes8, chacun spécialisé pour des applications particulières dans la synthèse cellulaire synthétique. Au-delà de leur rôle central dans la transcription et la traduction, les systèmes CFPS varient dans leurs principaux composants et les procédures de préparation associées. Ces variations, qui incluent des différences dans les extraits cellulaires, les ARN polymérases, les méthodes de préparation des matrices et les compositions tampons, sont en grande partie dues aux trajectoires de développement distinctes poursuivies par les groupes de recherche qui ont intensivement optimisé leurs systèmes pour un rendement maximal en protéines.

Parmi les différents composants du système CFPS, l’extrait cellulaire est un pool enzymatique critique pour la transcription et la traduction, et donc un déterminant clé de la performance CFPS9. Le CFPS basé sur Escherichia coli (E. coli) est le système le plus couramment utilisé en raison de son statut d’organisme procaryote le mieux compris. De plus, un système CFPS entièrement reconstitué comprenant des protéines et des ribosomes purifiés individuellement, connu sous le nom de PURE10, a été développé par le groupe de recherche d’Ueda, qui est particulièrement adapté aux applications nécessitant un arrière-plan clair. Aujourd’hui, même les systèmes CFPS à base d’E. coli se sont diversifiés, notamment en termes de souches sources pour l’extrac11 et de méthodes de préparation12,13, d’ARN polymérase14,15, de sources d’énergie16,17 et de systèmes tampons18,19. Les souches les plus fréquemment utilisées comprennent les dérivés des souches K12 et B, tels que A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 et Rossetta223, ainsi que leurs homologues génétiquement modifiés.

Initialement, les souches d’E. coli avec des activités RNases et protéases réduites ont été choisies pour améliorer la stabilité de l’ARNm et la stabilité des protéines recombinantes nouvellement synthétisées, conduisant à une augmentation des rendements finaux en protéines24. Par la suite, des extraits d’E. coli ont été modifiés pour faciliter des modifications post-traductionnelles spécifiques, notamment la glycosylation25, la phosphorylation26 et la lipidation27, ont été développés pour réaliser les modifications post-traductionnelles ci-dessus. De plus, une gamme d’additifs tels que des chaperonsmoléculaires 28 et des stabilisants chimiques ont été incorporés pour faciliter le repliement des protéines cibles, contribuant ainsi à la diversification des systèmes CFPS. L’ARN polymérase T7 du bactériophage, connu pour sa processivité élevée, est principalement utilisé pour la transcription, bien que d’autres polymérases telles que SP629 aient également été utilisées. L’ARN polymérase endogène d’E. coli a été adaptée pour le prototypage de circuits génétiques en exploitant les facteurs sigma30. Enfin, une variété de précurseurs d’énergie 31,32,33 et différents sels et composants tampons 19,34,35 ont été systématiquement optimisés pour améliorer la productivité.

Outre le système CFPS lui-même, les méthodes d’encapsulation ainsi que les matériaux de compartimentation sont également essentiels pour la réussite de l’assemblage des cellules synthétiques. Divers systèmes qui ont été développés pour encapsuler avec succès la réaction CFPS comprennent des gouttelettes d’eau/d’huile stabilisées par des tensioactifs, des lipides/polymères et leurs vésicules unilamellaires hybrides (avec des diamètres allant de 50 nm à plusieurs μm), ainsi que des bicouches lipidiques à support planaire. Cependant, en raison de la teneur en molécules complexées du système CFPS, le taux de réussite de l’encapsulation dépend de cas spécifiques, notamment pour la formation de vésicules. Pour améliorer le taux de réussite et l’efficacité de l’encapsulation des CFPS, diverses puces de microfluides ont été développées pour faciliter la formation de gouttelettes et de vésicules36. Néanmoins, des puces et des appareils supplémentaires devront être mis en place.

Ce protocole délimite un système CFPS d’E. coli utilisant la souche BL21(DE3), qui est un hôte couramment utilisé pour la production de protéines recombinantes. Le protocole comprend un compte rendu détaillé de la préparation de l’extrait cellulaire, de la préparation de la matrice et de l’optimisation de l’expression standard à l’aide d’une protéine rapporteure fluorescente. De plus, nous présentons des résultats exemplaires obtenus en encapsulant le système CFPS dans divers micro-compartiments, y compris des gouttelettes monocouches, des vésicules à double émulsion et des chambres situées au sommet de bicouches lipidiques soutenues. Enfin, nous exposons les éléments procéduraux essentiels et les conditions requises indispensables à la mise en place réussie de ces systèmes CFPS dans des contextes environnementaux distincts.

Protocole

1. Préparation de l’extrait

  1. Épluchez la souche d’E. coli BL21 (DE3) à partir d’un stock de glycérol sur une plaque de gélose Luria Bertani (LB) et incubez pendant au moins 15 h à 37 °C.
  2. Préparez une préculture d’une nuit en inoculant une seule colonie de la plaque LB fraîchement préparée dans une fiole de 50 mL de milieu Luria Bertani (LB).
  3. Inoculer 5 mL de préculture dans 500 mL de milieu 2xYTPG dans un erlenmeyer à chicanes de 3 L. Cultivez-la à 37 °C en secouant vigoureusement (entre 220 tr/min et 250 tr/min) et récoltez les cellules lorsqu’elles atteignent la phase mi-logarithmique (OD600 ~ 3). Ensuite, placez les cultures cellulaires dans de l’eau glacée froide pendant 10 min et centrifugez-les à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
    REMARQUE : Dans cette étape, le glucose dans le milieu 2xYTPG peut être omis pour des applications spécifiques 9,12.
  4. Remettre en suspension les pastilles obtenues dans 35 mL de tampon S30 A pré-refroidi, puis procéder à une centrifugation à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  5. Répétez l’étape 1.4 deux fois.
    REMARQUE : Les granulés de cellule peuvent être stockés à -80 °C s’ils ne sont pas utilisés immédiatement.
  6. Remettez les pastilles finales en suspension dans la mémoire tampon S30 B (p. ex., utilisez 1,1 mL de tampon S30 B pour 1 g de pastille cellulaire) et perturbez les cellules en un seul passage dans la presse française à 17 000 psi.
    1. Pour utiliser la presse française, suivez le manuel d’utilisation et transférez la suspension de la cellule dans la chambre de dérivation du métal de la presse française, en vous assurant que tous les composants sont assemblés et que la soupape inférieure de la chambre de dérivation est fermée.
    2. Transférez la chambre de perturbation assemblée sur la plate-forme hydraulique et sécurisez le verrou de sécurité.
    3. Allumez la pompe hydraulique et commencez la perturbation.
    4. Contrôlez la soupape de sortie pour permettre à la suspension de la cellule de s’écouler du tube de sortie dans un nouveau tube de 50 ml. Ajustez la vitesse d’écoulement pour assurer une perturbation efficace, idéalement une goutte à la fois. Maintenez la pression au-dessus de la limite inférieure de 15 000 psi.
  7. Centrifugez le lysat obtenu à 30 000 × g pendant 30 min à 4 °C et prélevez le surnageant. Répétez la centrifugation une fois et récupérez le surnageant. Ajouter 0,3 volume de tampon de préincubation dans le surnageant collecté et incuber en agitant doucement à 37 °C pendant 80 min.
    REMARQUE : L’utilisation d’un tampon de préincubation pourrait augmenter le rendement final, bien qu’il ait été signalé qu’un ruissellement vide (sans tampon de préincubation) pourrait également améliorer l’efficacité37,38, qui dépend de la souche source correspondante.
  8. Dialiser le mélange de ruissellement obtenu pendant 2 h contre 2 L de tampon S30 C, remplacer une fois le tampon de dialyse par 2 L de tampon S30 C frais et dialyser pendant une nuit à 4 °C39.
    REMARQUE : La deuxième étape de la dialyse de nuit peut être raccourcie à environ 3 h.
  9. Prélever l’échantillon dialysé et centrifuger à 30 000 × g pendant 30 min à 4 °C. Recueillir le surnageant et l’aliquote dans les volumes appropriés et congeler immédiatement dans de l’azote liquide.
    REMARQUE : L’échantillon congelé peut être stocké à -80 °C au moins pendant 6 mois à 1 an sans perte d’efficacité.

2. ARN polymérase T7

  1. Transformer le plasmide pAR1219 en cellules compétentes BL21(DE3) star E. coli 40.
  2. Inoculer 10 mL d’une culture de nuit dans 1 L de milieu LB (contenant 100 μg/mL d’ampicilline). Cultivez les cellules à 37 °C jusqu’à ce que la DO600 atteigne 0,6-0,8.
  3. Démarrez l’induction en ajoutant une concentration finale de 1 mM d’IPTG. Induire les cellules pendant 5 h supplémentaires et récolter par centrifugation à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Conservez les granulés cellulaires à -80 °C pendant plusieurs semaines maximum.
  4. Remettez les pastilles en suspension dans 30 mL de tampon T7 A et perturbez les cellules en un seul passage dans la presse française à 15 000 psi. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 20 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
  5. Ajouter le sulfate de streptomycine goutte à goutte sur le surnageant de l’étape précédente, jusqu’à une concentration finale de 4 % (p/v). Après une courte incubation sur glace, centrifuger à 20 000 × g pendant 30 min à 4 °C.
  6. Filtrez le surnageant à travers une membrane filtrante de 0,45 μm et chargez l’échantillon filtré sur une colonne d’échange d’anions forte (volume de colonne de 40 mL), qui a été prééquilibrée avec 10 volumes de colonne de tampon T7 B, via un système de chromatographe liquide automatisé.
  7. Laver la colonne chargée avec 50 volumes de colonne de tampon B T7 et éluer l’échantillon avec 10 volumes de colonne de mélanges de tampon C T7 à faible teneur en sel (50 mM) et à haute teneur en sel (500 mM), en établissant un gradient de concentration linéaire de NaCl de 50 à 500 mM à un débit de ~3 mL/min41.
  8. Collectez les fractions de crête et analysez-les par SDS-PAGE.
    REMARQUE : La polymérase T7 présente une bande prédominante à ~100 kDa, tandis que des quantités importantes d’impuretés apparaissent encore sur le gel SDS-PAGE.
  9. Regroupez les fractions contenant de la T7 polymérase et dialysez-les contre 2 L de tampon T7 C pendant la nuit.
  10. Ajouter du glycérol pour atteindre une concentration finale de 10% et concentrer le mélange obtenu à une concentration finale de 3-4 mg/mL par ultrafiltration42.
    REMARQUE : Si des précipitations apparaissent pendant le processus de concentration, arrêtez-vous immédiatement et éliminez les précipités par centrifugation.
  11. Ajustez la concentration de glycérol à 50%. Aliquote et congélation instantanée de l’échantillon avec de l’azote liquide. Conserver à −80 °C pendant une période plus longue.
    REMARQUE : Une petite aliquote peut également être stockée à -20 °C pendant au moins 1 mois sans perte d’efficacité.

3. Préparation du tampon

  1. Préparez les tampons comme indiqué dans le tableau 1 un jour avant l’utilisation.

4. Conception et préparation du modèle

  1. Clonez le gène d’intérêt dans un vecteur basé sur le promoteur T7 ou générez un produit de PCR linéaire contenant le gène d’intérêt.
    REMARQUE : Voir la section de discussion pour les principes de conception.
  2. Préparez le plasmide à partir d’une culture nocturne à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide.
    REMARQUE : Nous vous recommandons de choisir un kit plasmidique qui comprend une étape de précipitation de l’isopropanol suivie d’une procédure de lavage avec de l’éthanol à 70%.
  3. Dissoudre l’ADN séché dans un petit volume d’eau ultrapure jusqu’à une concentration comprise entre 200 μg/mL et 500 μg/mL, déterminée par un spectrophotomètre de microvolume.
  4. Facultatif : Exprimer directement les protéines à partir de produits de PCR linéaire.
    REMARQUE : Dans ce cas, une étape de purification par PCR est nécessaire.

5. Optimisation Mg2+ et K+

  1. Préparez un mélange maître pour le dépistage de la concentration en Mg2+ , comme indiqué dans le tableau 2, ou pour le dépistage de la concentration en K+ , comme indiqué dans le tableau 3.
  2. Transférez le mélange principal dans des tubes microfuges individuels ou une plaque en forme de V à 96 puits.
  3. Pipetez le volume exact de solutions mères de Mg2+ ou K+ dans des tubes microfuges individuels ou dans la plaque en forme de V à 96 puits et complétez les réactions CFPS avec de l’eau ultrapure. Incuber les réactions pendant au moins 2 h.
    REMARQUE : Si vous utilisez une plaque en forme de V à 96 puits, scellez la plaque avec un couvercle en plastique pour éviter l’évaporation.
  4. Prélever 2 μL du mélange réactionnel et le transférer dans une plaque noire à 96 puits pour les mesures de fluorescence par un lecteur de plaques.
    REMARQUE : Nous utilisons un lecteur de plaques fluorescentes avec la configuration suivante : excitation / émission : 485/528, Gain : 50, Hauteur de lecture : 7,00 mm. Cependant, il faudrait régler son lecteur de plaques pour générer une courbe d’étalonnage spécifique à l’aide de protéines fluorescentes purifiées.

6. Encapsulation

  1. Gouttelette
    1. Préparez une huile fluorée contenant un tensioactif (2 % de PFPE-PEG dans HFE7500) ou une solution d’huile lipidique-minérale en dissolvant les lipides dans de l’huile minérale (voir l’étape 6.2.1)
    2. Préparez un volume total de 100 μL de réaction CFPS en combinant les réactifs correspondants 2 à 18 du tableau 4. Ajouter la réaction CFPS à 500 μL d’huile préalablement préparée dans un tube de 1,5 mL, puis frotter vigoureusement le tube sur la grille du tube 50x pour former de fines gouttelettes (eau dans l’huile). Incuber le tube à 30 °C pour effectuer la réaction.
      REMARQUE : De simples puces microfluidiques pourraient également être utilisées pour générer des gouttelettes homogènes43.
  2. Vésicules unilamellaires géantes (GUV)
    1. Préparation de la solution d’huile lipidique-minérale
      1. Ajouter 57 μL de chloroforme dans un flacon en verre de 4 mL, puis ajouter 18 μL de lipides de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycérol-3-phosphocholine (POPC) de 25 mg/mL pour former la solution lipidique de chloroforme, atteignant une concentration finale de 8 mM (utiliser d’autres lipides ayant des concentrations finales similaires).
        REMARQUE : Cette étape de mélange visait à assurer un mélange homogène des différents lipides.
      2. Évaporez le chloroforme sous un flux d’argon pendant 15 min, puis évaporez davantage sous vide pendant 1 h.
      3. Dissoudre les lipides secs obtenus dans 1 500 μL d’huile minérale, jusqu’à une concentration finale de 400 μM. Incuber le mélange pendant la nuit à température ambiante.
    2. Formation d’une couche lipidique interfaciale
      1. Ajouter 500 μL de la solution externe (voir le tableau 5) dans un tube de 1,5 mL et superposer lentement 250 μL de solution d’huile lipidique et minérale sur la solution externe. Incuber à température ambiante pendant 30 min pour former une couche lipidique interfaciale stable.
    3. Préparation de la solution interne
      1. Mélangez tous les réactifs du tableau 6 pour former la solution de préinner et conservez-la sur de la glace jusqu’à utilisation. Complétez la solution interne en ajoutant du T7RNAP, de l’extrait S30 et une matrice d’ADN dans la solution préinterne en tant que réactifs 16 à 18 énumérés dans le tableau 4.
        REMARQUE : L’augmentation de la concentration de saccharose encapsulé au-dessus de 250 mM peut inhiber la traduction acellulaire44.
    4. Formation des GUV
      1. Ajouter 50 μL de solution interne dans un tube neuf de 1,5 mL contenant 500 μL d’huile lipidique-minérale, pipeter de haut en bas rapidement et agiter vigoureusement.
      2. Laissez le tube sur de la glace pendant 10 minutes et ajoutez lentement 20 μL du mélange d’émulsion sur le dessus de la phase huileuse dans le tube de 1,5 mL à partir de l’étape 6.2.2.
      3. Centrifuger à 800 × g (utiliser une vitesse de centrifugation allant de 100 × g à 1000 × g) pendant 10 min à 4 °C et observer la formation de GUVs au fond du tube.
        REMARQUE : Une vitesse de centrifugation spécifique plus élevée peut être utilisée ; cependant, on pourrait considérer que la vitesse de centrifugation pourrait influencer la taille des GUV45 formés.
      4. Retirez la phase d’huile supérieure.
      5. Aspirez soigneusement 30 μL de GUVs au fond du tube. Incuber les GUV collectés à 30 °C.
        REMARQUE : La température d’incubation optimale varie pour différentes protéines.
      6. Utilisez la microscopie confocale à balayage laser (LSM) pour surveiller l’expression des protéines fluorescentes.
  3. Bicouche lipidique prise en charge (SLB)
    1. Préparation des chambres SLB
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 en ajoutant sept gouttes d’acide sulfurique et deux gouttes de peroxyde d’hydrogène à 50 % au centre de chaque lame de couverture. Incuber les réactifs sur les lamelles pendant au moins 45 min ; Rincez abondamment à l’eau ultra-pure.
      2. Assemblez la chambre de reconstitution en fixant un tube de microfuge coupé de 0,5 mL sur les lamelles nettoyées à l’aide de colle optique durcie sous une lampe ultraviolette (365 nm) pendant 10 min pour former une chambre de réaction.
    2. Formation SLB
      1. Dissoudre 80 % molaire de 1,2-dioléoyl-sn-glycérol-3-phosphocholine (DOPC), 19,95 % molaire de 1,2-dioleoyl-sn-glycérol-3-phospho-L-sérine (DOPS) et 0,05 % molaire d’Atto488-DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine = DOPE), mélanger dans du chloroforme, sécher sous un léger écoulement d’azote et mettre sous vide pendant 1 h pour éliminer complètement le solvant.
      2. Réhydratez le film lipidique séché dans le tampon SLB A, ce qui permet d’obtenir une concentration finale en lipides de 4 mg/mL.
      3. Vortex et sonicate les échantillons résultants jusqu’à ce qu’ils deviennent clairs.
      4. Diluer 4 mg/mL de SUV avec 130 μL de tampon SLB A, transférer 75 μL de la suspension dans les chambres de réaction préformées et l’incuber sur un bloc chauffant à 37 °C pendant 1 min. Ajouter 150 μL de tampon SLB A dans la chambre de réaction pour une incubation ultérieure pendant 2 min.
      5. Lavez la chambre avec 2 mL de tampon SLB B (tampon SLB A sans MgCl2) avant de remplacer le tampon par le tampon S30 C avec 0,4 % (p/v) BSA pour les réactions CFPS, en laissant 100 μL de tampon à l’intérieur de la chambre pour éviter que le SLB formé ne se dessèche.
      6. Retirez le résidu du tampon S30 C et ajoutez soigneusement le mélange réactionnel CFPS dans la chambre SLB. Incuber la chambre à 30 °C et surveiller l’expression à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.

Résultats

Pour chaque nouveau lot d’extrait cellulaire et d’ARN polymérase T7, il est recommandé d’effectuer un dépistage de base des concentrations de Mg2+ et de K+ afin d’assurer les performances optimales du système CFPS. La fluorescence de la GFP du superplieur peut servir d’indicateur du rendement global du système CFPS dans des conditions variables, comme illustré à la figure 1A,B. De plus, une comparaison parallèle du rendement du système CFPS à travers différents compartiments est présentée à la figure 1C, démontrant des performances constantes dans les systèmes CFPS encapsulés, bien qu’avec une légère diminution des GUV, potentiellement due à l’influence du saccharose46. De plus, les réactions CFPS ont été encapsulées avec succès dans des gouttelettes (figure 2), des GUV (figure 3) et au sommet de SLB (figure 4).

La figure 2A met en évidence la formation de gouttelettes d’émulsion, évidentes lorsque la solution d’huile est devenue turbulente. L’expression des protéines fluorescentes vertes/rouges (GFP et mCherry) a été capturée à l’aide d’une microscopie confocale à balayage laser. La figure 3 a montré le succès de l’encapsulation de la réaction CFPS dans les GUV par le simple processus de transfert d’émulsion. Le canal rouge indiquait les lipides marqués ; le canal vert a montré l’expression du superfolder GFP ; et le canal jaune représentait un colorant fluorescent inerte. La figure 4A montre la chambre SLB où la réaction CFPS a pu être déposée. À l’intérieur de cette chambre, une SLB a été formée sur la lamelle de verre, avec le mélange réactionnel CFPS placé sur la SLB préformée, permettant l’imagerie via une microscopie confocale à balayage laser. Comme l’indique la figure 4B, la SLB a été visualisée par des lipides marqués, représentés en vert, tandis que la petite GTPase Cdc42 exprimée fusionnée avec mCherry a été représentée en magenta. L’expression in situ de mCherry-Cdc42 a été observable, ainsi que le processus de ciblage membranaire réversible, au microscope. Cependant, le système CFPS utilisé a été complété par des machines de prénylation, comme détaillé dans une publication récente47.

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Figure 1 : Optimisation et comparaison du système CFPS. Dépistage des concentrations (A) de Mg2+ et (B) de K+ pour le système CFPS en vrac. (C) Un graphique à barres montrant les rendements d’expression des protéines dans différents compartiments. La fluorescence de la superfolder GFP a été utilisée pour déterminer le rendement du système CFPS, mesuré par un lecteur de plaques ou un microscope confocal à balayage laser. Abréviations : CFPS = synthèse des protéines acellulaires ; GFP = protéine fluorescente verte ; sfGFP = superdossier GFP ; GUV = vésicule unilamellaire géante ; SLB = bicouche lipidique supportée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Synthèse des protéines acellulaires dans les gouttelettes. (A) Une photo des réactions CFPS encapsulées dans des gouttelettes d’eau dans l’huile stabilisées par un tensioactif. (B) Images en fond clair et en fluorescence (C,D) des CFPS de (C) mCherry et (D) superfolder GFP encapsulées dans des gouttelettes visualisées par microscopie confocale à balayage laser. Le superdossier GFP est indiqué en vert ; mCherry est indiqué en magenta. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : CFPS = synthèse des protéines acellulaires ; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Synthèse des protéines acellulaires dans les GUV. (A) Une photo des réactions CFPS encapsulées dans les GUV. (B-D) Image de fluorescence de CFPS encapsulés dans des GUVs POPC, exprimant la GFP du superdossier. (B) La bicouche lipidique a été marquée avec 0,05 % de lipides Atto647N-DOPE, indiqués en rouge, (C) un colorant inerte indiqué en jaune, et (D) le superfolder GFP a été indiqué en vert. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : CFPS = synthèse des protéines acellulaires ; GFP = protéine fluorescente verte ; GUV = vésicule unilamellaire géante ; POPC = 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycérol-3-phosphocholine ; DOPE = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Synthèse protéique acellulaire de la petite protéine GTPase-Cdc42 au-dessus des SLB. (A) Illustration schématique de la reconstitution du ciblage membranaire de Cdc42 et de l’extraction membranaire dépendante de RhoGDI sur les SLB, telle que visualisée par microscopie confocale à balayage laser. La machinerie de prénylation a été mise en œuvre via un extrait enrichi en prénlytransférase, qui est décrit en détail ailleurs. 47. (B) Une vue orthogonale de la pré- et postprénylation du mélange réactionnel au-dessus de la SLB. (C, D) Séries chronologiques d’intensité mCherry-Cdc42 sur la membrane (rose) et en solution (noir) pendant le ciblage de la membrane (C) et l’extraction de la membrane (D). Les barres d’échelle = 10 μm (A-D) ont été adaptées de Kai et al.47. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Liste des tampons. REMARQUE : Ajoutez du β-mercaptoéthanol et du DTT juste avant utilisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Schéma de pipetage pour le dépistage de la concentration en Mg2+ . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Schéma de pipetage pour le dépistage de la concentration en K+ . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Composition de la solution interne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Composition de la solution externe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 6 : Composition de la solution de pré-interne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Ce manuscrit décrit un système modifié de synthèse de protéines libres (CFPS) conçu pour être utilisé dans divers micro-compartiments à travers des plateformes cellulaires synthétiques, y compris les gouttelettes d’eau dans l’huile, les GUV et les SLB. Nous avons utilisé la souche hôte standard d’expression de la protéine recombinante d’E. coli, BL21(DE3), comme extrait source pour construire des systèmes cellulaires synthétiques centrés sur les protéines. Cette approche a permis d’obtenir environ 0,5 mg/mL de protéines dans différents compartiments. Bien que d’autres souches sources d’extraits personnalisées puissent être utilisées, ces systèmes ont été principalement optimisés pour un type spécifique de protéine ou d’activité métabolique, qui peut être sous-optimal pour l’expression générale des protéines. Les progrès récents de l’analyse quantitative par spectrométrie de masse ont facilité les études pilotes sur l’analyse protéomique du lysat cellulaire48,49, en particulier dans diverses conditions de préparation.

Bien que ces études aient permis d’obtenir des informations, il reste difficile d’établir une corrélation quantitative entre ces facteurs protéiques identifiés et la performance globale des systèmes CFPS. Cette lacune a laissé sans réponse des questions sur la façon d’évaluer quantitativement les performances d’un lot donné d’extraits. De plus, aucune comparaison systématique et parallèle des différentes souches sources n’a été signalée. Dans cette étude, nous avons utilisé un milieu 2xYPTG pour stimuler la production de biomasse, une stratégie recommandée pour passer à 2xYPT lors de l’utilisation de l’ARN polymérase endogène pour la transcription. Malgré les suggestions selon lesquelles la polymérase T7 pourrait être intégrée dans la procédure de préparation de l’extrait45, nous avons opté pour un protocole de préparation distinct pour l’extrait S30 et l’ARN polymérase T7 afin de réduire les variations élevées d’un lot à l’autre.

La production de protéine cible est intrinsèquement liée au processus central de transcription/traduction. Une conception et une pureté de modèle appropriées sont cruciales pour une expression sans cellule réussie. En plus de la matrice plasmidique, l’ADN double brin linéaire généré par PCR peut également être utilisé, ce qui permet le criblage et les applications à haut débit. Contrairement à la conception conventionnelle de la matrice pour l’expression in vivo chez E. coli, la conception de la matrice dans le système acellulaire d’E . coli est simplifiée sans qu’il soit nécessaire de tenir compte de l’induction de l’expression. Le seul élément essentiel d’un modèle d’expression acellulaire est une séquence régulatrice T7. Cependant, dans certains cas, la séquence 5' du gène cible pourrait influencer l’initiation de la traduction, en fonction de la structure secondaire formée par l’ARNm transcrit correspondant. Si le site de liaison au ribosome est situé dans une boucle souche stable de l’ARNm transcrit, l’initiation de la traduction pourrait être considérablement entravée, entraînant une faible expression globale. De même, des codons rares consécutifs peuvent entraver l’expression et doivent être optimisés, à l’instar des études in vivo . Cela peut être réalisé grâce à des serveurs open source dédiés à l’optimisation des codons50 et à la prédiction de la structure secondaire de l’ARNm51.

En ce qui concerne le système tampon, nous avons utilisé un tampon d’acétate complété par de la créatine phosphate et de la créatine kinase comme sources de régénération d’énergie dans notre dispositif expérimental. Cette configuration a produit un niveau d’expression modéré et une cinétique relativement rapide, attribuable à la réaction de régénération d’énergie en une seule étape catalysée par la créatine kinase à l’aide de créatine phosphate. Bien que certains chercheurs se soient tournés vers un système tampon de glutamate, citant sa ressemblance plus étroite avec l’environnement cellulaire52, nous n’avons observé aucune différence significative dans les rendements d’expression des protéines avec nos protocoles actuels. Cependant, une analyse protéomique récente a indiqué que différents systèmes tampons en combinaison avec des méthodes de traitement de l’extrait pourraient influencer le rendement final de l’expression19. En ce qui concerne les précurseurs énergétiques, divers substrats ont été étudiés par de nombreux groupes de recherche pour obtenir une rentabilité et des rendements d’expression accrus53,54. Dans le contexte du système CFPS présenté, la créatine phosphate et la créatine kinase ont été délibérément choisies. Cette sélection a été motivée par l’efficacité de la régénération d’énergie réalisable par une réaction en une seule étape et l’absence d’interférence avec les enzymes endogènes héritées de l’extrait. Par conséquent, cette configuration établit un système simple mais robuste, bien adapté à divers environnements à micro-compartiments.

Comme indiqué dans les résultats représentés, nous avons démontré une expression réussie des protéines dans trois microcompartiments distincts : des gouttelettes d’eau dans l’huile stabilisées par de l’huile semi-fluorée, des GUVs formées par transfert d’émulsion et au sommet d’une bicouche lipidique supportée. La polyvalence de l’expression des protéines à travers différents micro-compartiments souligne la robustesse de notre système CFPS pour la construction de cellules synthétiques. Parmi ces méthodes d’encapsulation, la technique des gouttelettes d’émulsion était une approche particulièrement simple pour encapsuler le système CFPS, ne nécessitant que l’agitation ou le vortex. Cependant, ces gouttelettes ont tendance à être instables en raison de l’interface précaire avec l’eau, une limitation qui pourrait être résolue en ajoutant des lipides ou des tensioactifs dans la phase huileuse. Malgré l’utilité des gouttelettes stabilisées d’eau dans l’huile, elles ne reproduisent pas complètement l’environnement cellulaire naturel, qui se compose de deux compartiments aqueux séparés par une membrane cellulaire. Au lieu de gouttelettes, des vésicules unilamellaires géantes (GUV) d’une taille supérieure à 1 micron ont été établies pour imiter plus fidèlement les cellules. Le système CFPS a été encapsulé dans la bicouche lipidique de ces vésicules, fournissant une machinerie de transcription et de traduction pour divers systèmes cellulaires synthétiques55.

Le transfert d’émulsion, également connu sous le nom de double émulsion, se distingue comme la technique typique d’encapsulation des réactions CFPS, en raison de son processus de préparation doux et de son efficacité d’encapsulation relativement élevée par rapport aux méthodes sans solvant. Cependant, la génération de vésicules à double émulsion peut aller de simples étapes de centrifugation à l’utilisation d’un transfert d’émulsion assisté par microfluidique, chaque méthode ayant ses avantages et ses inconvénients associés, comme résumé ailleurs36. L’encapsulation réussie du système CFPS dans les GUV repose sur le réglage de l’osmolarité et l’application de la force appropriée pour traverser l’interface huile-eau. Bien que la méthode de transfert d’émulsion décrite ici soit la plus simple et ne nécessite aucun équipement de laboratoire spécifique, l’efficacité et l’homogénéité des GUV générés peuvent varier entre les différents lots. De plus, toutes les méthodes de transfert d’émulsion doivent traiter de l’huile résiduelle dans la lumière de l’interface bicouche formée, ce qui nécessite une étape supplémentaire d’élimination de l’huile56, ce qui peut poser des défis dans les projets cinétiques.

Enfin, nous avons montré l’expression réussie de CFPS au sommet d’une bicouche lipidique soutenue (SLB), offrant une approche précieuse pour les projets nécessitant la synthèse de protéines à proximité de l’environnement de la biomembrane lipidique. Grâce à l’utilisation du système CFPS présenté, nous avons démontré son application réussie dans la caractérisation du processus de ciblage membranaire réversible de Cdc4247, une molécule protéique centrale cruciale pour la polarité cellulaire. En résumé, les rendements constants d’expression du milieu et la robustesse inhérente observée dans divers micro-compartiments mettent en évidence le potentiel de ce système CFPS dans la construction de divers systèmes de cellules synthétiques. Cette capacité peut être étendue pour inclure divers modèles centrés sur les protéines, progressant finalement vers la réalisation de cellules minimales.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.

Remerciements

M. Y. remercie le programme de recherche et d’innovation dans la pratique de troisième cycle de la province du Jiangsu, en Chine (subvention n° 100). KYCX22_2803). L.K. est reconnaissant du soutien de la Recherche en sciences naturelles des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu de Chine, Chine (subvention n° 17KJB180003), de la Fondation des sciences naturelles de l’Université normale du Jiangsu, Chine (subvention n° 17XLR037), du développement du programme académique prioritaire des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu, en Chine, et du programme de professeur spécialement désigné du Jiangsu, en Chine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-sérine (sel de sodium)(DOPS)Avanti840035P
1,4 dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti850457P
AMP 3,5-cyclique (cAMP)Sigma-AldrichA9501
50 mLEppendorf EppendorfTubes Biosourcés
50 % de peroxyde d’hydrogèneSigma-Aldrich516813
AcétateSigma-AldrichA6283
Poudre de géloseSigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Cellules agitéesMerckMillipored’ammonium
(NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArginineSigma-AldrichA4474
AsparagineSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Erlenmeyer à chicanesShuniu250 mL, 1000mL
Albumine sérique bovine (BSA)Roche10711454001
CentrifugetubeEppendorfEppendorf Tubes 3810X
Centrifugetuberack Eppendorf0030119819
Système d’imagerie par chimiluminescence et épifluorescenceUvitecAlliance Q9 Advanced
ChloroformSigma-Aldrich288306
Microscopie confocale à balayage laser (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Lames de chambre de comptage cellulaireThermo Fisher ScientificC10283
Lamelle ThermoScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
créatine kinase (CK)Roche10127566001
Créatine phosphate (CP)Sigma-Aldrich10621714001
Boîte de cultureHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Cytidine 5'-sel disodique triphosphate (CTP)aladdinC101487
Membrane de dialyseSpectrumStandard RC Tubing MWCO : 12-14 kD
E.Z.N.A. Cycle Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Électro-Chauffage Cultivateur à température deboutYiheng instrumentDHP-9602
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Biosharp
Lecteur de plaques fluorescentesBioTekSynergy 2
Huile fluoréeSuzhou CChip instrument scientifique2 %HFE7500
Acide foliniqueSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlucoseSigma-AldrichG7021
GlutamatSigma-AldrichG5667
GlutaminSigma-AldrichG5792
GlycérolSigma-AldrichG5516
GlycineSigma-AldrichG7126
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate(GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IsoleucinSigma-AldrichI5281
Isopropyl-&beta ;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinSigma-AldrichL6914
LysinSigma-AldrichL5501
Acétate de magnésium tétrahydraté (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
Chlorure de magnésium(MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MethioninSigma-AldrichM8439
MicrocentrifugeuseEppendorf5424 R
Huile minéraleSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Centrifugeuse polyvalenteEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Acide nucléique & NanoPhotomètreIMPLENN60
NucleoBond Xtra Maxi kit pour plasmide de qualité transfection DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell Plaques de polystyrène à 96 puitsSigma-AldrichP8616
Thermocycleur PCREppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
PhénylalanineSigma-AldrichP8740
Phosphoénolpyruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polyéthylène glycol 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Acétate de potassium(KOAc)Sigma-AldrichP5708
Chlorure de potassium( KCl)Sigma-AldrichP9541
Glutamate de potassium (K-glutamate)Sigma-AldrichG1501
Hydroxyde de potassium (KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Pyruvate kinase (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
ShakerZhichushakersZQZY-AF8
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-AldrichS5881
SaccharosealaddinS112226
Acide sulfuriqueSigma-Aldrich339741
Filtres à seringueJinteng0.45 &mu ; m
Tube à essaiShuniu20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12 %Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
ThreoninSigma-AldrichT8441
Base TrisSigma-AldrichV900483
ARNtRoche10109550001
TryptoneSigma-AldrichT7293
TryptophaneSigma-AldrichT8941
TyrosinSigma-AldrichT8566
UTP Sel trisodique (UTP)AladdinU100365
Pompe à vide avec système d’eau circuléeZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
Mélangeurs VortexKylin-BellVortex QL-861
Système de purification de l’eauMerckMilliporeEau ultrapure directe (Type 1)
Extrait de levureSigma-Aldrich70161
&beta ;-mercaptoéthanolSigma-Aldrich444203
Tubes de UFSC05001 Acétate 1100027

Références

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