Remodelage dépendant de l’expérience de la connectivité synaptique des neurones sensoriels olfactifs du cerveau juvénile au cours d’une période critique au début de la vie

Résumé

Nous décrivons ici des méthodes pour induire et analyser le remodelage dépendant de l’expérience olfactive des glomérules synaptiques du lobe antennaire dans le cerveau juvénile de la drosophile .

Résumé

L’expérience sensorielle olfactive au début de la vie induit un remodelage synaptique spectaculaire des glomérules dans le cerveau juvénile de la drosophile , qui dépend de la dose par l’expérience, est limité dans le temps et ne peut être réversible que pendant une période critique courte et bien définie. La directionnalité du remodelage de la connectivité synaptique des circuits cérébraux est déterminée par l’odorant spécifique agissant sur la classe de récepteurs des neurones sensoriels olfactifs répondants. En général, chaque classe de neurones n’exprime qu’un seul récepteur odorant et innerve un seul glomérule synaptique olfactif. Dans le modèle génétique de la drosophile , l’ensemble des glomérules olfactifs a été cartographié avec précision par la réactivité aux odeurs et la production comportementale. L’odorisant au butyrate d’éthyle (EB) active les neurones récepteurs Or42a, innervant le glomérule VM7. Au cours de la période critique au début de la vie, l’expérience de l’EB entraîne l’élimination des synapses dose-dépendantes dans les neurones sensoriels olfactifs Or42a. Des périodes chronométrées d’exposition à l’odorant EB dosé permettent d’étudier l’élagage de la connectivité des circuits dépendant de l’expérience dans le cerveau juvénile. L’imagerie par microscopie confocale des glomérules synaptiques du lobe antennaire est réalisée à l’aide de marqueurs transgéniques pilotés par le récepteur Or42a qui permettent de quantifier le nombre de synapses et le volume d’innervation. La boîte à outils génétique sophistiquée de la drosophile permet la dissection systématique des mécanismes cellulaires et moléculaires qui interviennent dans le remodelage des circuits cérébraux.

Introduction

Le remodelage des circuits cérébraux juvéniles au cours de la vie représente la dernière chance pour des changements de connectivité synaptique à grande échelle pour correspondre à l’environnement hautement variable et imprévisible dans lequel un animal naît. En tant que groupe d’animaux le plus abondant, les insectes partagent ce mécanisme fondamental de remodelage de la période critique conservé au cours de l’évolution¹. Les périodes critiques s’ouvrent avec l’apparition de l’entrée sensorielle, présentent des changements de circuit réversibles pour optimiser la connectivité, puis se ferment lorsque les forces de stabilisation résistent à un remodelage ultérieur². Les insectes sont particulièrement dépendants de l’information sensorielle olfactive et présentent une période critique olfactive bien définie. La drosophile fournit un excellent modèle génétique pour étudier cette période critique dépendante de l’expérience dans le cerveau juvénile. L’expérience odorante au cours des premiers jours suivant l’éclosion entraîne des changements frappants de connectivité du circuit dans les glomérules synaptiques ^3,4 identifiés individuellement. La direction du remodelage dépend de l’expérience spécifique de l’odorisant d’entrée. Certains odorisants provoquent une augmentation du volume du glomérule synaptique pendant quelques jours après l’éclosion (dpe)3,5,6,7, tandis que d’autres odorants provoquent une élimination rapide des synapses pendant la période critique de 0-2 dpe, entraînant une diminution du volume d’innervation ^8,9,10. Plus précisément, l’expérience odorante du butyrate d’éthyle (EB) entraîne un élagage synaptique dose-dépendant des neurones récepteurs olfactifs Or42a uniquement pendant cette période critique au début de la vie⁸. L’élimination des synapses est complètement réversible en modulant l’apport d’odorant EB pendant la période critique, mais devient permanente après la fermeture de la période critique. Cet élagage synaptique dépendant de l’expérience olfactive fournit un système expérimental précieux pour élucider les mécanismes temporellement limités sous-jacents au remodelage des circuits cérébraux juvéniles.

Ici, nous présentons un protocole détaillé utilisé pour induire et analyser l’élagage synaptique dépendant de l’expérience EB des neurones sensoriels olfactifs du récepteur Or42a pendant la période critique au début de la vie. Nous montrons que les terminaisons synaptiques Or42a dans le lobe antennaire VM7 glomérule peuvent être spécifiquement marquées en pilotant transgéniquement un marqueur mCD8 ::GFP attaché à la membrane, soit directement fusionné au promoteur Or42a (Or42a-mCD8 ::GFP)¹¹, soit en utilisant le système d’expression binaire Gal4/UAS (Or42a-Gal4 pilotant UAS-mCD8 ::GFP)¹². Les synapses individuelles des neurones Or42a peuvent être marquées de manière similaire à l’aide de l’expression transgénique ciblée de marqueurs de zone active présynaptiques fusionnés à un ensemble de marqueurs fluorescents (par exemple, Bruchpilot ::RFP)⁸ ou à un signal dense en électrons pour les analyses de synapses ultrastructurales (par exemple, miniSOG-mCherry)⁸. Les terminaux synaptiques Or42a peuvent être imagés à l’aide d’une combinaison de microscopie confocale à balayage laser et de microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’élagage synaptique des glomérules Or42a dépend de la dose d’EB, s’adaptant à la concentration de l’expérience odorante chronométrée. Le pourcentage d’odorisant EB dissous dans l’huile minérale utilisée comme véhicule peut varier, de même que la durée de l’exposition à l’odorant chez les animaux en phase de développement. Enfin, nous montrons les méthodes utilisées pour analyser l’étendue de l’élagage des glomérules synaptiques en mesurant l’intensité et le volume de la fluorescence d’innervation VM7. Le nombre de synapses peut également être quantifié en comptant les points synaptiques marqués et en mesurant les paramètres de l’ultrastructure synaptique à l’aide de la microscopie électronique^{à transmission 8}. Dans l’ensemble, le protocole présenté ici est une approche puissante qui permet la dissection systématique des mécanismes cellulaires et moléculaires médiant l’élagage de la connectivité synaptique du circuit olfactif de la drosophile pendant une période critique juvénile. La configuration générale d’exposition aux odeurs décrite dans cette étude a été utilisée dans des études précédentes utilisant d’autres odeurs et dosant d’autres glomérules ^3,7.

Protocole

1. Exposition aux substances odorantes

1. À l’aide d’un pinceau fin, trier 40 à 50 animaux au stade de développement en tant que pupes sombres pharatées (90+ h après la pupariation à 25 °C) dans des flacons de polystyrène pour drosophile de 25 mm x 95 mm contenant de la farine de maïs standard (figure 1A).
2. Placez un fin treillis métallique en acier inoxydable sur l’extrémité des flacons de drosophile pour contenir les mouches tout en permettant une bonne circulation de l’air. Fixez les capuchons en treillis métallique avec un film transparent collé sur le côté des flacons de drosophile .
3. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, placez 1 mL d’huile minérale à 100 % (témoin du véhicule) ou dissolvez l’odorisant butyrate d’éthyle (EB) dans de l’huile minérale dans un autre tube pour produire la concentration désirée (p. ex. 15 % (150 μL) ou 25 % (250 μL)).
4. Placez les tubes de contrôle du véhicule ou les tubes de microcentrifugation odorants à la verticale dans un récipient étanche à l’air de 3700 ml Glasslock. À l’aide de ruban adhésif, ancrez solidement les tubes au centre des chambres odorantes avec les flacons de drosophile (Figure 1B).
5. Placez les chambres de contrôle du véhicule scellées et les chambres odorisantes EB contenant les flacons de pupes de pharate de drosophile étagées dans un incubateur humidifié (70 %), à température contrôlée (25 °C) selon un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h.
6. Retirez les mouches nouvellement fermées après 4 h d’exposition à l’odorisant dans la chambre et transférez rapidement 20 à 25 mouches dans des flacons de drosophile frais dans des chambres contenant un odorant fraîchement préparé (Figure 1A,B). Jetez les pupes non fermées.
7. Conservez les mouches dans leurs chambres odorantes scellées dans les incubateurs pendant un total de 24 h. Pour un dosage plus long d’odorant, transférez rapidement les mouches dans de nouveaux flacons de drosophile dans des chambres odorantes fraîchement préparées toutes les 24 heures.
8. Anesthésiez les mouches au stade de développement en les immergeant dans une boîte contenant de l’éthanol à 70 % pendant 1 minute en préparation d’une dissection cérébrale immédiate et d’un traitement immunocytochimique.

2. Dissection cérébrale

1. Marquez les flacons comme témoins de véhicule (100 % d’huile minérale uniquement) ou exposés à l’EB (% d’EB) en les étiquetant et maintenez-les pendant toute la durée de la dissection cérébrale et du traitement ultérieur. Traitez 10 à 20 animaux pour chaque génotype/condition odorante.
2. À l’aide d’une pince, transférez une seule mouche anesthésiée dans une petite boîte de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) fraîchement ^préparée13. Immergez la mouche dans PBS et poursuivez la dissection complète du cerveau avec la mouche complètement immergée.
3. Avec une pince fine (#5) aiguisée dans les deux mains, placez la braguette côté ventral vers le haut et saisissez le haut du thorax avec une pince et la tête sous la trompe avec l’autre pince. Veillez à ne pas pénétrer dans le cerveau.
4. Retirez la tête du reste du corps en tirant doucement dans des directions opposées avec les deux mains. La tête doit se détacher facilement du thorax ; laisser la tête isolée pour la dissection (figure 1C).
5. Faites glisser la pince précédemment utilisée pour saisir le thorax sous le côté opposé de la trompe. Commencez à tirer doucement la cuticule de l’exosquelette dans des directions opposées afin qu’elle se déchire entre les yeux pour révéler le cerveau.
6. Lors de la traction, les lobes optiques du cerveau peuvent se séparer avec l’exosquelette. Pour éviter cela, tirez lentement et régulièrement avec les deux pinces tout en retirant la cuticule de l’exosquelette (Figure 1C, au milieu).
7. Continuez à retirer la cuticule de l’exosquelette de la tête. Assurez-vous que toutes les parties de l’exosquelette sont retirées. Retirez tous les tissus attachés au cerveau, y compris le corps adipeux et toute trachée saillante.
8. Pour éviter qu’elle ne colle, rincez une pointe de pipette P20 avec du PBS + 0,2 % de Triton-X 100 (PBST). Immédiatement après la dissection, transférez les cerveaux dans la solution de fixation (4 % de paraformaldéhyde (PFA) + 4 % de saccharose) dans un tube bouché (Figure 1C, D).

3. Immunocytochimie cérébrale

1. Fixez le cerveau pendant 30 minutes à température ambiante (RT) avec rotation de bout en bout. Tout en gardant la cervelle dans le tube, pipetez et jetez correctement le fixateur dangereux. Laver rapidement les cerveaux fixes 3 fois avec du PBS (Figure 1D).
2. Les cerveaux se retrouvent souvent coincés dans le capuchon des tubes après la rotation. Pour éviter la perte accidentelle de cerveaux, qui est un danger constant dans tous les transferts, utilisez un microscope de dissection lors du pipetage des liquides.
3. En préparation du marquage des anticorps, bloquer les cerveaux fixes pendant 1 h à RT dans PBST + 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) + 0,5 % de sérum de chèvre normal (NGS) avec une rotation constante d’un bout à l’autre (Figure 1D).
4. Retirez le bloc et incubez les cerveaux avec l’anticorps primaire sélectionné dilué de manière appropriée dans PBST + 0,2 % BSA + 0,1 % NGS. Incuber les cerveaux pendant la nuit (14-16 h) à 4 °C avec une rotation constante.
   REMARQUE : Exemples d’anticorps utilisés : anti-CadN de rat (dilution 1:50)¹⁴ pour marquer les glomérules synaptiques et anti-GFP de poulet (1:1000)⁸ pour marquer Or42a-mCD8 ::GFP (Figure 1D).
5. Pipeter l’anticorps primaire. Lavez les cerveaux 3 fois pendant 20 minutes chacun avec PBST. Incuber des cerveaux avec des anticorps secondaires dilués dans du PBST avec 0,2% BSA + 0,1% NGS pendant 2 h à RT avec rotation constante.
   REMARQUE : Vous pouvez également incuber les cerveaux pendant la nuit (14 à 16 h) à 4 °C. Anticorps dilués dans le PBST avec 0,2 % BSA + 0,1 % NGS ; Anticorps secondaires utilisés ici : 488 anti-poulet de chèvre (1:250) et 546 anti-rat de chèvre (1:250).
6. Pipeter les anticorps secondaires. Lavez les cerveaux 3 fois pendant 20 minutes chacun avec PBST. Terminez en lavant la cervelle pendant 20 min avec du PBS (Figure 1D).
7. Préparez des lames de microscope en verre (75 mm x 25 mm) en ajoutant deux fines bandes de ruban adhésif double face sur la lame à ~25 mm l’une de l’autre. Cela fournit une entretoise pour éviter d’écraser les cerveaux.
8. Pipette ~10-15 μL de support de montage entre les deux bandes de ruban adhésif pour monter les cerveaux. À l’aide d’une pointe de pipette P20 pré-rincée avec du PBST, transférez les cerveaux marqués sur la lame de microscope (Figure 1E).
9. Une fois les cerveaux transférés, utilisez un pinceau fin pour les aligner, en vous assurant que les lobes antennaires sont tournés vers le haut. Recherchez le côté qui a la bosse arquée, qui contiendra les lobes antennaires.
10. Une fois que les cerveaux sont correctement orientés, couvrez-les d’une lamelle en verre (n° 1.5H), en vous assurant que la lamelle est bien fixée sur le ruban. Ensuite, remplissez les côtés de la lamelle avec un support de montage supplémentaire (Figure 1E).
11. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent. Laissez la lame sécher complètement, puis conservez-la au réfrigérateur pour une imagerie ultérieure.

4. Imagerie confocale

1. Aveugler toutes les lames cérébrales aux conditions de génotype et d’expérience avant l’imagerie en marquant la lame avec une étiquette codée pour un décodage ultérieur.
2. Utilisez un microscope confocal à balayage laser avec un objectif à immersion dans l’huile 63x. Nous utilisons un microscope Zeiss 510 META dans toutes les images présentées ici (Figure 1F).
3. Utilisez des lignes laser appropriées pour les fluorophores utilisés. Ici, utilisez un laser Argon 488 et HeNe 543 pour l’imagerie des glomérules synaptiques du lobe antennaire et des neurones sensoriels olfactifs Or42a (Figure 2).
4. Déterminez le gain et le décalage optimaux pour les deux canaux, en conservant idéalement le gain pour les deux canaux <750 et le décalage ≈0. Ceci est fait pour s’assurer que le rapport signal/bruit est optimal tout en limitant l’arrière-plan.
5. Placez l’imagerie au centre du cerveau. Lors de l’imagerie, les glomérules VM7 résident en proximal au trou laissé au milieu du cerveau après l’ablation de l’œsophage lors de la dissection (Figure 2A).
   REMARQUE : Les glomérules VM7 seront toujours proches de l’ouverture de l’œsophage. Cependant, l’emplacement exact et la taille varient légèrement en fonction de la dissection cérébrale et des différences de montage, alors tenez-en compte lors de l’imagerie.
6. Sélectionnez la résolution d’imagerie et l’épaisseur de la tranche optique. Ici, une résolution de 1024 x 1024 avec une épaisseur de tranche Z-stack de 0,37 μm est utilisée.
7. Prenez une projection confocale complète de l’empilement Z à travers le lobe antennaire, assurant la capture de l’innervation complète des neurones Or42a des glomérules VM7.

5. Mesures synaptiques

1. Chargez l’image en aveugle du génotype/de la condition dans Fidji (1.54f). Divisez les canaux de ligne laser en cliquant sur Image > Couleur > Diviser les canaux.
2. Dans le canal sensoriel olfactif Or42a, déterminez quelles tranches contiennent l’innervation Or42a en faisant défiler l’intégralité de la pile Z, en identifiant où la fluorescence commence et se termine.
3. Créez une projection de la somme des tranches incluant uniquement les tranches contenant l’innervation des neurones Or42a en cliquant sur Piles de > d’images > Projet Z > Somme des tranches et en entrant la plage souhaitée.
4. Aux Fidji, cliquez sur l’outil Lasso dans la barre supérieure pour tracer le contour de l’innervation du neurone Or42a dans le glomérule VM7, en traitant chaque glomérule du côté du cerveau indépendamment (Figure 3).
5. Multipliez la circonférence par le nombre de tranches Z-stack et l’épaisseur de chaque tranche pour obtenir le volume d’innervation du glomérule synaptique VM7. Pour quantifier le nombre de synapses, l’outil de recherche de maxima peut être utilisé avec la macro de recherche de piles de maxima pour compter les synapses ponctuées dans la région délimitée ^8,15.

Résultats

La figure 1 montre le flux de travail des méthodes d’exposition aux odorants pendant la période critique dépendante de l’expérience olfactive et d’imagerie cérébrale. Le protocole commence par l’appariement de l’âge des pupes sombres du pharate immédiatement avant l’éclosion (figure 1A). Les pupes sont placées dans des chambres odorantes pendant 4 heures, puis les adultes nouvellement fermés sont retournés dans des flacons frais dans les chambres déodorantes de contrôle du véhicule ou d’EB dosé (figure 1B). Nous exposons généralement à l’odorant pendant 24 heures, bien que n’importe quelle durée soit possible. Après l’exposition à un odorant, la dissection cérébrale commence par le retrait de la tête du thorax, puis le retrait de l’exosquelette de la cuticule à l’aide d’une pince fine (Figure 1C). Le cerveau isolé est nettoyé de tous les tissus associés qui pourraient interférer avec l’imagerie, puis immédiatement fixé dans 4% de paraformaldéhyde et 4% de saccharose dans du PBS. Une courte dose de 30 minutes est suffisante pour une bonne intégrité du tissu cérébral. Le protocole immunocytochimique commence par un bloc de 1 h (p. ex., BSA, NGS), une incubation d’une nuit dans des anticorps primaires (p. ex., anti-GFP, -CadN), puis une brève incubation de 2 h dans des anticorps secondaires (figure 1D). Les cerveaux marqués sont montés sur des lames de verre sous des lamelles scellées, la surface dorsale du cerveau étant relevée pour une meilleure imagerie des lobes antennaires (figure 1E). Notez que tous les échantillons sont mis à l’aveugle pour le génotype et les conditions d’expérience en marquant la lame avec une désignation codée pour un décodage ultérieur. Un microscope confocal à balayage laser avec un objectif à immersion dans l’huile 63x est utilisé pour imager les lobes antennaires centraux du cerveau (Figure 1F). Des lignes laser optimales pour les fluorophores utilisés sont sélectionnées (par exemple, Argon 488 et HeNe 543) pour imager l’innervation des neurones sensoriels olfactifs Or42a de VM7 dans le contexte des glomérules environnants.

Il est important de sélectionner le gain, le décalage, la résolution d’imagerie et l’épaisseur de coupe optique optimaux pour capturer l’intégralité de la projection Z-stack de l’innervation des neurones Or42a dans les glomérules VM7. Tous les génotypes et conditions d’expérience à comparer sont imagés avec des réglages de microscope identiques. Les piles Z sont traitées à l’aide du logiciel ImageJ, les modifications dépendantes de l’expérience étant évaluées principalement par le volume d’innervation ^7,14. Les mesures volumétriques ont été calculées de deux manières. On calcule la zone d’innervation tranche par tranche à l’aide de la fonction lasso ImageJ, puis on multiplie chaque valeur par l’épaisseur de chaque tranche (μm)^8,9. L’autre utilise la somme des projections Z de tranche et multiplie le nombre de tranches de la pile Z par l’épaisseur de la tranche pour déterminer le volume moyen. Les deux méthodes donnent des résultats cohérents. En plus des mesures de volume, l’intensité de fluorescence peut également être évaluée avec la projection de l’intensité maximale de VM7 glomérules¹⁶. La somme pondérée de tous les pixels est évaluée via la projection ImageJ sum slice max, le nombre de pixels à chaque niveau d’intensité étant additionné pour calculer l’intensité globale ^8,9. Le bruit de fond peut être soustrait en quantifiant une région extra-glomérulaire de taille identique. Cette méthode de soustraction prend plus de temps mais est plus précise, car elle tient compte des différents niveaux de marquage des anticorps de fond dans chaque échantillon de cerveau pour produire une quantification plus représentative des valeurs d’intensité de fluorescence d’innervation. Les mesures d’intensité sont effectuées dans une plage typique de 18 à 30 coupes optiques (0,37 μm/tranche) à l’intérieur d’une pile Z, calculée en moyenne pour chaque cerveau¹⁶. Dans presque tous les cas, les mesures d’intensité et de volume de fluorescence d’innervation donnent des résultats cohérents.

Dans toutes les modalités de mesure, les résultats représentatifs restent inébranlables ; L’expérience odorante de l’EB au début de la vie entraîne une perte significative de l’innervation des neurones Or42a. Le glomérule VM7 peut être identifié de manière fiable par sa taille, sa forme et son emplacement parmi d’autres glomérules olfactifs du lobe antennaire cartographiés avec précision (Figure 2A) et par l’expression ciblée du marqueur membranaire Or42a-mCD8 ::GFP couplé au marquage glomérulaire avec de la cadhérine anti-neurale (CadN ; Figure 2B). L’exposition programmée au contrôle du véhicule odorant (huile minérale) entraîne une innervation neuronale Or42a impossible à distinguer d’un animal normal non traité. Pourtant, l’expérience odorante de l’EB dans les premiers jours suivant l’éclosion (dpe) provoque l’élagage des glomérules synaptiques (Figure 2C). Ce mécanisme d’élagage est entièrement limité à la brève période critique du début de la vie ^8,10. Nous utilisons généralement des expositions à des substances odorisantes de 24 heures pour évaluer l’élagage synaptique des glomérules VM7 et la diminution du volume d’innervation qui en résulte dans le cerveau de la drosophile juvénile. Une exposition de 24 h (0-1 dpe) au témoin du véhicule odorisant (huile minérale) maintient l’innervation normale et dense Or42a-mCD8 ::GFP (vert) dans les glomérules synaptiques VM7 (cercles pointillés blancs) dans les lobes antennaires des deux hémisphères cérébraux (figure 2D, à gauche). En contraste frappant, une exposition de 24 heures (0-1 dpe) à un odorant EB à 25 % dissous dans l’huile minérale entraîne une forte taille de l’innervation Or42a-mCD8 ::GFP (vert) et une perte du volume glomérulaire synaptique (Figure 2D, à droite). Ces résultats sont à la fois visuellement évidents et toujours clairs. L’un des plus grands attributs de ce protocole d’expérience olfactive est la clarté des résultats de l’imagerie cérébrale, qui se prêtent également à des quantifications simples de l’intensité de la fluorescence et du volume de l’innervation.

L’avantage majeur de ce protocole d’expérience odorante est la possibilité de l’exploiter pour l’étude de la restriction temporelle et des mécanismes dose-dépendants de l’odorant pendant la période critique de l’élagage synaptique. Pour l’élimination des synapses neuronales Or42a induites par l’EB dans le glomérule VM7, le mécanisme de remodelage est principalement limité au juvénile précoce (0-2 dpe), sans élagage synaptique détectable dépendant de l’expérience à maturité (7-9 dpe), à l’exception d’une modulation mineure aux niveaux d’exposition EB les plus élevés⁸. Une telle restriction temporelle définit une période critique, et la compréhension de ce mécanisme de synchronisation est un objectif important. Un autre attribut de ce protocole est que l’élagage synaptique dépendant de l’expérience est dépendant de la dose EB (Figure 3). L’exposition programmée au véhicule de contrôle de l’odorisant (huile minérale) avec 0 % d’odorant EB entraîne une innervation normale des neurones Or42a du glomérule synaptique VM7, qui est impossible à distinguer d’un animal non traité. Le calcul du volume tridimensionnel d’innervation neuronale Or42a montre une taille typique d’un cerveau juvénile normal (2260 μm³ ; Figure 3A, à gauche). Des résultats représentatifs montrent que l’augmentation de la concentration d’odorant EB entraîne une taille des glomérules synaptiques de plus en plus importante. Par exemple, une exposition de 24 h (0-1 dpe) à un odorant EB à 15 % entraîne une perte d’innervation claire et constante (figure 3A, au milieu). La quantification du volume d’innervation 3D montre une réduction notable par rapport aux commandes du véhicule (760 μm³ contre 2260 μm³). Une exposition de 24 heures (0-1 dpe) à un odorisant à 25 % d’EB entraîne une perte d’innervation encore plus importante (281 μm³ ; Figure 3A, à droite). Les quantifications représentatives de cette gamme de concentrations d’odorisant EB montrent des résultats cohérents pour l’intensité de fluorescence (figure 3B) et le volume d’innervation (figure 3C). Cette dépendance à la dose permet d’étudier les moyens de prévenir l’élagage synaptique ainsi que d’améliorer l’élagage avec des expositions à des odeurs plus faibles pour démontrer une augmentation du remodelage des glomérules synaptiques. Certaines études antérieures ont montré l’effet inverse de l’augmentation du volume glomérulaire en utilisant d’autres odorisants avec ce protocole¹⁰. L’exposition à l’odorant EB pendant la période critique se traduit toujours par une taille des glomérules synaptiques frappante et facilement détectable.

Figure 1 : Organigramme des études d’exposition aux odorants dans le cerveau juvénile de la drosophile. (A) Les pupes sombres pharates (90+ h après la pubation à 25 °C) sont collectées et placées dans des chambres odorantes. Dans des conditions odorantes, 4 heures sont autorisées pour l’éclosion, puis les mouches juvéniles sont transférées dans un flacon frais. (B) Les mouches du même âge sont divisées en conditions d’expérience soit la commande du véhicule (100 % huile minérale), soit celle du butyrate d’éthyle (EB ; % v/v dans l’huile minérale). Un grillage fin (en médaillon) permet l’accès aux odorants. Les mouches sont généralement exposées pendant 20 heures supplémentaires, pour un total de 24 heures d’exposition, 0 à 1 jour après l’éclosion (DPE). (C) Les mouches sont disséquées en enlevant d’abord la tête, puis de fines pinces sont utilisées pour retirer délicatement l’exosquelette de la cuticule et isoler le cerveau juvénile. Le cerveau isolé est débarrassé de tous les tissus environnants et de la trachée saillante. (D) Les cerveaux isolés sont fixés, bloqués, puis incubés séquentiellement dans des anticorps primaires et secondaires. La gamme d’anticorps utilisés comprend généralement une sonde membranaire générale pour révéler les glomérules synaptiques du lobe antennaire et une sonde membranaire spécifique pour les neurones sensoriels olfactifs Or42a. (E) Les cerveaux marqués sont placés dans un support de montage sur une lame de microscope en verre avec des entretoises de ruban sous une lamelle scellée. L’orientation correcte du cerveau (surface dorsale vers le haut) est essentielle pour une imagerie optimale des lobes antennaires. (F) Les cerveaux sont imagés à l’aide d’un microscope confocal fluorescent à balayage laser. Tous les échantillons sont soumis à l’insu du génotype et présentent des conditions avant l’imagerie et les analyses quantifiées ultérieures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Taille des glomérules synaptiques en fonction de l’expérience odorante. (A) Les glomérules olfactifs du lobe antennaire (AL) sont cartographiés avec précision. Quelques glomérules synaptiques représentatifs sont représentés. La classe des neurones sensoriels olfactifs (OSN) du récepteur Or42a innerve spécifiquement les glomérules VM7. (B) Les neurones marqués Or42a-mCD8 ::GFP (vert) innervent densément les glomérules VM7 appariés sur les côtés gauche (L) et droit (R) du cerveau, avec le marquage par anticorps N-Cadhérine (CadN) de tous les glomérules synaptiques AL (magenta). La ligne de mouche est w¹¹¹⁸ ; Or42a-mCD8 ::GFP/+. (C) Représentation graphique schématique de l’innervation Or42a OSN des glomérules synaptiques VM7 dans les conditions de contrôle du véhicule (100 % d’huile minérale ; à gauche) et d’exposition au butyrate d’éthyle (% EB v/v dans l’huile minérale ; à droite) pendant la période critique juvénile. L’élagage de l’innervation en fonction de l’expérience ne se produit qu’avec une exposition à l’EB au début de la vie, avec des synapses éliminées et des axones perdus, ce qui entraîne une réduction du volume d’innervation. (D) Images confocales représentatives de l’innervation d’Or42a OSN des glomérules synaptiques appariés VM7 (cercles blancs en pointillés ; Or42a-mCD8 ::GFP, vert) après le contrôle du véhicule à l’huile (à gauche) et une exposition à 25% EB (à droite) pendant 24 h (0-1 dpe). L’expérience odorante EB entraîne l’élagage synaptique et la perte de volume d’innervation. Ce mécanisme dépendant de l’expérience n’est limité dans le temps et transitoirement réversible qu’au cours d’une période critique olfactive bien définie dans les premiers jours suivant l’éclosion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Quantification de l’intensité et du volume de fluorescence de l’innervation des glomérules synaptiques dose-dépendants de l’EB. (A) Or42a-mCD8 ::GFP dans un glomérule synaptique VM7 (vert) exposé de 0-1 dpe au témoin d’huile minérale du véhicule odorant (0 % EB, à gauche), 15 % EB (au milieu) ou 25 % EB (à droite). Ci-dessous : Les mêmes images avec l’innervation glomérulaire délimitée (cercles blancs) et le volume d’innervation tridimensionnel calculé. Le témoin véhicule présente une innervation du glomérule synaptique VM7 par les neurones Or42a qui est indiscernable de celle des animaux non traités. L’expérience d’une période critique avec une exposition à 15 % de l’odorisant EB entraîne une taille évidente du glomérule synaptique, avec une diminution de 66 % du volume d’innervation tridimensionnel dans ce cas. L’exposition à la teneur plus élevée de 25 % d’EB entraîne une taille plus importante, avec une perte de près de 90 % du volume du glomérule synaptique dans ce cas. Ainsi, on peut imaginer une taille dose-dépendante à mesure que l’expérience odorante augmente. (B) Résultats représentatifs de l’intensité de fluorescence marquée Or42a-mCD8 ::GFP dans les glomérules synaptiques VM7 exposés de 0 à 1 dpe au témoin du véhicule odorant (huile, vert), 15 % d’EB (moyen, orange) ou 25 % d’EB (à droite, noir). (C) Résultats représentatifs des volumes d’innervation tridimensionnelle des glomérules VM7 dans les mêmes conditions d’exposition aux odeurs pendant la période critique. Les nuages de points montrent tous les points de données individuels avec la moyenne ± SEM. La signification est indiquée comme suit : p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) et p ≤ 0,0001 (****). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole d’exposition aux odeurs et d’imagerie cérébrale présenté ici peut être utilisé pour induire et quantifier de manière fiable l’élagage des glomérules synaptiques des neurones sensoriels olfactifs dépendant de l’expérience au cours d’une période critique au début de la vie. Des études antérieures utilisant ce paradigme de traitement pour explorer le remodelage du circuit olfactif ont commencé l’exposition aux odeurs le 2ème^{jour après} l’éclosion ^3,4,5. En revanche, nous commençons l’exposition aux substances odorantes dans les pupes de pharate avant l’éclosion adulte et constatons que la grande majorité du remodelage se produit dans les 24 premières heures suivant l’éclosion ^8,9. Ainsi, une étape essentielle de ce protocole d’exposition aux odorants consiste à placer les pupes sombres étagées dans des chambres odorantes avant l’éclosion (Figure 1). Il ne s’agit pas d’une exposition à un odorant nymphal en soi, mais plutôt d’une exposition à un odorant immédiatement après l’éclosion de l’adulte. Nous avons sélectionné des adultes juvéniles enfermés 4 h après la stadification afin de synchroniser les âges dans une fenêtre temporelle serrée et d’éviter les différences dans les temps d’exposition aux odorants. Cet intervalle d’expérience plus précoce est conforme aux études récentes démontrant que l’accoutumance à l’olfaction EB se termine après seulement 2 jours après l’éclosion¹⁰. Cependant, les conséquences des différences de moment d’exposition aux odorants au cours de la période critique (p. ex., 0-1 contre 1-2 jours) n’ont pas été bien caractérisées. Les neurones sensoriels olfactifs Or42a innervent sélectivement le glomérule VM7 dans le lobe antennaire, ce qui est facilement identifié sur la base des cartes glomérulaires précises et du marquage d’innervation ciblé (par exemple, Or42a-mCD8 ::GFP ; Figure 2). L’exposition à l’odorant EB pendant la période critique ne modifie pas l’expression du promoteur Or42a ou les niveaux^{de rapporteur 8}. L’exposition chronométrée à un odorant provoque l’élimination séquentielle des synapses et la perte d’innervation axonale des neurones récepteurs Or42a. Cette taille est complètement réversible au début de la période critique de la vie (0-2 dpe) mais pas à maturité adulte (7-9 dpe) lorsque les changements dans l’environnement odorant ne modifient plus l’innervation. La restriction temporelle stricte de ce mécanisme dépendant de l’expérience sensorielle est une question majeure en suspens dans le domaine. De nombreuses tentatives sont faites pour rouvrir la plasticité critique à maturité. Le protocole donné ici est une puissante piste d’investigation.

La facilité d’exposition aux odeurs et le protocole d’imagerie cérébrale décrits ici permettent une large accessibilité et une grande adaptabilité. Le début, la fin et la durée de l’exposition aux odorants sont entièrement à la discrétion de l’investigateur pour permettre des études ciblées des propriétés de la période critique, de la réversibilité du remodelage et de la réouverture de la plasticité de la période critique. De même, la force de l’expérience odorante peut être facilement manipulée pour l’étude de l’élagage des glomérules synaptiques dose-dépendante (Figure 3). Il est important de noter que les études qui utilisent des concentrations d’EB plus faibles (par exemple, 15 % d’EB) peuvent être utilisées pour tester des manipulations qui pourraient améliorer le taux ou l’étendue du remodelage des glomérules synaptiques. Par exemple, les résultats pourraient montrer que l’élagage synaptique à des niveaux inférieurs d’EB (par exemple, 15 %) est indiscernable des niveaux d’EB plus élevés (par exemple, 25 %). À travers différentes manipulations, les résultats peuvent être comparés à l’innervation constante des commandes des véhicules odorants et à l’élagage robuste des glomérules synaptiques se produisant à 25 % d’EB (Figure 3). L’une des limites de cette méthode est que l’exposition à l’odorant dépend entièrement de la volatilité de l’odorant dissous. Des facteurs variables tels que la température et l’humidité relative affectent l’efficacité de l’exposition aux odorants⁸. La densité des mouches dans les chambres odorantes pourrait également avoir un impact potentiel sur l’exposition aux odorants, par exemple, par la production d’odorisants dérivés des mouches. Une densité ne dépassant pas 20 à 25 mouches par flacon est recommandée. La concentration odorante nécessaire pour induire une très forte taille des glomérules synaptiques est probablement plus élevée que ce qui est généralement observé dans la nature^10,17. Des techniques d’imagerie à bien plus haute résolution seraient nécessaires pour analyser l’élimination des synapses à des concentrations d’odorant plus faibles. Cependant, le protocole actuel permet des études cohérentes et fiables pour une gamme de manipulations.

Il y a d’immenses avantages à ce protocole d’exposition aux odeurs et d’imagerie cérébrale. La drosophile est un modèle animal extrêmement avantageux fondé sur une boîte à outils génétique étendue et sophistiquée, qui peut être systématiquement exploitée pour l’étude large des interactions gène-environnement dans le remodelage du circuit olfactif en période critique. Parmi les exemples présentés ici, citons la ligne de commande transgénique Or42a-Gal4, le marqueur de membrane UAS-mCD8 ::GFP et la fusion directe Or42a-mCD8 ::GFP. Il n’y a pas de différences distinctes entre l’élagage synaptique des glomérules avec la fusion directe Or42a et les approches de marquage indirect Gal4/UAS ^8,9. Le pilote Or42a-Gal4 offre la possibilité de manipuler les neurones récepteurs olfactifs ciblés et de visualiser les changements dépendants de l’expérience dans l’innervation VM7, tandis que la ligne de fusion directe libère le système transgénique binaire UAS-Gal4 pour d’autres manipulations ciblées sur les cellules. De nombreuses autres lignées mutantes et transgéniques de la vaste boîte à outils de la drosophile peuvent être utilisées pour tester les mécanismes de restriction temporelle et dépendants de l’expérience, y compris l’identification des cellules médiatrices de l’élagage synaptique, les voies de signalisation intercellulaires relayant les informations d’expérience olfactive et la machinerie intracellulaire nécessaire à l’élimination ciblée des synapses. Dans l’ensemble, ce protocole permet l’interrogation systématique de nombreux mécanismes à l’origine du remodelage des circuits cérébraux dépendant de l’expérience olfactive. Ce protocole d’exposition aux odeurs et d’imagerie cérébrale peut également être utilisé pour étudier l’expérience olfactive spécifique à la période critique, les modifications comportementales, les manipulations génétiques et pharmaceutiques qui peuvent permettre la réouverture de la plasticité de type période critique à maturité et d’autres aspects de la plasticité du circuit olfactif au-delà de l’élagage des glomérules synaptiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
For Odor Exposure
Drosophila flacons Genesee	Scientific	32-110
Ethyl butyrate	Sigma Aldrich	E15701
Microcentrifugeuses tubes  ;	Fisher Scientific  ;	05-408-129
Huile minérale	Sigma Aldrich	M3516
Chambres à odeurs	Glasslock
Pinceaux	Winsor & Newton	Series 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Treillis métallique	Scienceware	378460000
Dissection cérébrale
Éthanol, 190 proof	Decon Labs	2801	Dilué à 70 %
Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldéhyde  ;	Microscope électronique Sciences	157-8	Dilué à 4 %
Boîtes de Pétri	Fisher Scientific  ;	08-757-100B
Solution saline tamponnée au phosphate	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluée à 1x
Saccharose	Fisher Scientific  ;	BP220-1
Sylgard	Electron Microscope Sciences	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific  ;	BP151-100
Brain Immunocytochemistry
488 chèvre anti-poulet	Invitrogen	A11039
546 chèvre anti-rat	Invitrogen	A11081
Albumine sérique bovine  ;	Sigma Aldrich	A9647
Poulet anti-GFP	Abcam	13970
Couvre-lames Avantor		48366-067	25 x 25 mm
Ruban adhésif double face	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G  ;	Electron Microscope Sciences	17984-25
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Vernis à ongles	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisible
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocal/Analyse
Tout ordinateur/portable
Microscope confocal	Carl Zeiss		Zeiss 510 META  ;
Logiciel	Fidji Fidji		Version 2.14.0/1.54f