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Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

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DOI :

10.3791/66631

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8 mars 2024

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1Department of Anatomy, Keio University School of Medicine, 2Department of Molecular Neurobiology, Institute for Developmental Research, Aichi Developmental Disability Center

Dans cet article

Résumé

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Résumé

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. Ce processus est crucial pour le bon fonctionnement du cerveau, et sa dérégulation peut entraîner des troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques après la naissance. En fait, de nombreux gènes responsables de ces maladies se sont avérés être impliqués dans ce processus, et par conséquent, il est important de révéler comment ces mutations affectent la dynamique cellulaire pour comprendre la pathogenèse de ces maladies. Ce protocole introduit une technique d’imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des coupes de cerveau obtenues à partir d’embryons de souris. Les cellules sont marquées avec des protéines fluorescentes à l’aide de l’électroporation in utero , qui visualise les cellules individuelles migrant de la zone ventriculaire avec un rapport signal/bruit élevé. De plus, ce système de transfert de gènes in vivo nous permet d’effectuer facilement des expériences de gain ou de perte de fonction sur les gènes donnés par co-électroporation de leur expression ou de leurs vecteurs knockdown/knock-out. À l’aide de ce protocole, le comportement migratoire et la vitesse de migration des cellules individuelles, des informations qui ne sont jamais obtenues à partir de cerveaux fixes, peuvent être analysés.

Introduction

Au cours du développement du cortex cérébral, la glie radiale (apicale) dans la zone ventriculaire palléenne (VZ) tapissant le ventricule latéral produit d’abord des neurones, puis des progéniteurs gliaux avec une période1 qui se chevauche. Les neurones sont également générés à partir de progéniteurs intermédiaires ou de la glie radiale basale dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) adjacente à la VZ, qui proviennent toutes deux de la glie radiale (apicale) 2,3. Chez la souris, les cellules gliales radiales ne produisent que des neurones le jour embryonnaire (E) 12-14, des neurones et des progéniteurs gliaux le jour E15-16, et des progéniteurs gliaux à partir de E174. La principale population de progéniteurs gliaux générée au cours de ces stades embryonnaires se différencie préférentiellement en astrocytes, bien que certaines cellules se différencient également en oligodendrocytes5. Les neurones et les progéniteurs astrocytaires générés à ces stades migrent vers la surface du cerveau et pénètrent dans la plaque corticale (future matière grise corticale). La migration neuronale de la VZ à la plaque corticale se produit en plusieurs phases. Les neurones adoptent d’abord une morphologie multipolaire juste au-dessus de la zone d’accumulation de cellules multipolaires (MAZ), chevauchant la SVZ ou zone intermédiaire, où ils étendent et rétractent vigoureusement plusieurs processus minces et migrent lentement (migration multipolaire)6,7. Après environ 24 heures, les neurones se transforment en une morphologie bipolaire, étendant un processus de pointe épais vers la surface du cerveau et un processus de traînée mince vers l’arrière, et migrent linéairement vers la surface du cerveau en utilisant un processus radial s’étendant de la glie radiale à la surface piale comme un échafaudage, appelé mode de locomotion 2,8. Parce que les neurones en mode de locomotion atteignent toujours la surface la plus externe de la plaque corticale, en passant par leurs prédécesseurs juste en dessous de la zone marginale, les neurones sont alignés de l’intérieur vers l’extérieur en fonction de la date de naissance dans la plaque corticale 9,10,11.

En revanche, les progéniteurs des astrocytes migrent rapidement vers la zone intermédiaire et la plaque corticale, avec des changements de direction fréquents. Ce comportement migratoire est complètement différent de la migration neuronale et est appelé migration erratique5. Les progéniteurs des astrocytes migrent également le long des vaisseaux sanguins dans un processus appelé migration guidée par les vaisseaux sanguins. Les progéniteurs des astrocytes passent d’un mode de migration à l’autre et atteignent la plaque corticale 5,12. Bien que le positionnement des astrocytes ne soit pas strictement déterminé par leur date de production, une légère tendance des astrocytes précoces à s’installer dans la partie superficielle de la plaque corticale a été observée5. Il est intéressant de noter que les astrocytes qui s’installent dans la plaque corticale sont générés à des stades embryonnaires et finissent par se différencier en astrocytes protoplasmiques, tandis que les astrocytes générés après la naissance ne migrent pas activement, restent dans la substance blanche et se différencient en astrocytes fibreux5. La façon dont cette spécification des sous-types astrocytaires dépend du stade se produit reste incertaine.

Un nombre croissant de gènes impliqués dans la migration neuronale ont été identifiés, y compris ceux impliqués dans les troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques13,14. Par conséquent, il est crucial d’élucider les effets des mutations de ces gènes sur le comportement des neurones en migration. Comme mentionné précédemment, la migration neuronale se produit en plusieurs phases. Les observations en accéléré permettent de déterminer directement la phase qui est principalement affectée (sortie du cycle cellulaire, transition multipolaire-bipolaire, vitesse de migration de la locomotion, etc.). Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la spécification, à la migration et au positionnement des astrocytes restent largement inconnus. Étant donné que les astrocytes jouent un rôle crucial dans la synaptogenèse15 et la formation de la barrière hémato-encéphalique au cours du développement cérébral16, les anomalies du développement des astrocytes peuvent entraîner des troubles neurodéveloppementaux. Des études en accéléré sur les progéniteurs des astrocytes pourraient clarifier ces mécanismes moléculaires et leur relation avec la maladie mentale.

Ce protocole fournit une méthode d’observation en accéléré des cellules corticales dérivées de VZ. Un protocole vidéo similaire pour l’observation de la migration neuronale a déjà été publié17. Ici, nous décrivons la méthode pour migrer les neurones et les progéniteurs des astrocytes. Pour marquer ces cellules avec des protéines fluorescentes, telles que des protéines fluorescentes vertes et rouges (GFP et RFP), des mélanges de plasmides contenant des composants appropriés sont introduits dans la VZ corticale par électroporation in utero aux stades appropriés 18,19,20,21. Les embryons manipulés sont retirés aux stades souhaités, et les cerveaux sont découpés et utilisés pour des observations en accéléré à l’aide d’un microscope à balayage laser. La vitesse de migration, la direction et d’autres comportements, qui ne sont jamais abordés à l’aide d’échantillons de cerveau fixes, peuvent être examinés à l’aide de cette méthode. En utilisant l’électroporation in utero, l’expression et les vecteurs knockdown/knock-out peuvent être facilement transférés en concomitance avec des vecteurs protéiques fluorescents, ce qui nous permet de mener des études de gain et de perte de fonction de gènes spécifiques.

Protocole

La présente étude a été réalisée avec l’approbation et en suivant les directives du Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut de recherche sur le développement, du Centre de déficience intellectuelle d’Aichi (#2019-013) et de l’Université Keio (A2021-030). Des souris ICR gravides (de type sauvage) ont été obtenues commercialement (voir la table des matières). Pour observer la relation entre les cellules migratrices et les vaisseaux sanguins, des souris Flt1-DsRed, chez lesquelles les cellules endothéliales expriment DsRed22, ont été utilisées. Des souris mâles Flt1-DsRed ont été croisées avec des souris femelles ICR (les deux souris étaient âgées de 8 à 24 semaines). Tous les animaux ont été logés et manipulés dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS) jusqu’à l’échantillonnage. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Électroporation in utero

  1. Préparez une solution saline tamponnée à l’HEPES (HBS) en ajoutant un volume égal d’eau autoclavée à 2x HBS disponible dans le commerce.
  2. Il existe deux options d’anesthésiques ; l’isoflurane (inhalation) et le MMB (injection). Dans le cas de l’utilisation de MMB, préparez-le comme suit. Ajouter 0,75 mL de médétomidine (1 mg/mL), 2 mL de midazolam (5 mg/mL) et 2,5 mL de butorphanol (5 mg/mL) dans 19,75 mL d’eau autoclavée23.
    REMARQUE : Cette solution anesthésique devient moins active dans les 2 mois. Conserver à 4 °C avec un écran photoélectrique.
  3. Préparez la solution d’atipamézole. Diluer 0,75 mL d’atipamézole (5 mg/mL) avec 24,25 mL d’eau autoclave.
  4. Préparez une solution Fast Green à 0,2 % (p/v) dans de l’eau autoclave. Stériliser avec un filtre (taille des pores 0,22 μm).
  5. Préparez le plasmide à l’aide d’un kit de purification de plasmide conventionnel basé sur la lyse alcaline et la purification sur colonne23 selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Dissoudre le plasmide purifié d’une culture bactérienne de 100 mL dans 30 à 50 μL de HBS pour préparer le stock plasmidique (3-5 μg/μL) (Fichier supplémentaire 1).
    1. Mélangez et diluez les stocks de plasmides avec HBS, et ajoutez 1/10 de volume de 0,2% de vert rapide pour colorer l’injecteur. Les composants et les concentrations finales des plasmides sont déterminés en fonction de leur fonction (tableau 1).
  6. Fabriquez les micropipettes en tirant sur les capillaires en verre à l’aide d’un extracteur de pipette.
    REMARQUE : La pointe de la pipette est coupée obliquement à l’aide d’une pince fine. Le diamètre extérieur de la pointe est d’environ 70 μm. Marquez les micropipettes à des intervalles de 2 μL en aspirant de l’eau de 2 μL.
  7. Injecter l’anesthésique MMB à une dose de 10 μL/g de poids corporel par voie intrapéritonéale à une souris enceinte à un stade approprié (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
    REMARQUE : Les stades embryonnaires à manipuler doivent être déterminés en fonction de l’objectif. Pour marquer les futurs neurones pyramidaux II/III, E14.5 convient. Pour marquer les progéniteurs gliaux, une électroporation doit être effectuée sur E15-16. Alternativement, les souris peuvent être anesthésiées par inhalation d’isoflurane (1% à 2%).
  8. Une fois la souris profondément anesthésiée, placez-la sur une plaque chaude à 38 °C.
    REMARQUE : Assurez-vous que la souris ne répond pas au pincement de la queue.
  9. Après avoir enlevé la fourrure autour du site chirurgical à l’aide d’une crème dépilatoire, désinfectez la zone chirurgicale plusieurs fois en mouvements circulaires avec un gommage à base d’iode et d’alcool à 70 %. Faites une incision cutanée de 2 cm de long le long de la ligne médiane à partir du niveau de la 2e paire de mamelons la plus postérieure vers l’avant, suivie d’une incision de 2 cm sur la ligne médiane de la paroi abdominale le long de la ligne blanche (Figure 1A).
    REMARQUE : Dans le processus d’incision dans la paroi abdominale, soulevez-le légèrement avec des pinces fines afin de ne pas couper les organes internes.
  10. Placez une feuille de plastique stérile sur la peau et un morceau de papier de soie stérile dessus (Figure 1A). Créez un trou au centre pour exposer la zone chirurgicale.
    REMARQUE : La feuille de plastique stérile et le papier de soie stérile sont placés après avoir fait l’incision car un large champ de vision est nécessaire pour positionner l’incision en se référant à la position des mamelons.
  11. Mouillez le papier avec du PBS stérile, observez attentivement les cornes utérines de l’incision et retirez la corne utérine à travers les trous de la feuille de plastique et du papier.
  12. À l’aide d’une micropipette fixée à un tube d’aspirateur, injecter 1 μL du mélange plasmidique dans le ventricule latéral gauche ou droit à travers la paroi utérine par pression expiratoire (figure 1A).
    REMARQUE : Alternativement, le plasmide peut être injecté à l’aide d’un micro-injecteur.
  13. Pincez la tête de l’embryon à l’aide d’une électrode de type pince à épiler et appliquez des impulsions électroniques à l’aide d’un électroporateur (35 V pour E14-16, 50 V pour E17, impulsions carrées de 50 ms avec des intervalles de 450 ms, 5 fois) (Figure 1A).
    REMARQUE : Ne pincez pas fortement la tête des embryons, ce qui endommagerait les embryons. Le courant réel doit être de 40 à 70 mA.
  14. Replacez la corne utérine dans la cavité abdominale.
  15. Suturez la paroi abdominale à l’aide d’un fil de soie 5-0.
  16. Appliquer la solution d’atipamézole à une dose de 10 μL/g de poids corporel par voie intrapéritonéale.
  17. Suturez la peau à l’aide d’un fil de soie 5-0.
    REMARQUE : La peau peut être fermée à l’aide d’un clip automatique.
  18. Conservez les souris manipulées sur une plaque chaude pendant au moins 30 min. Les souris commenceront à bouger dans la cage.
    REMARQUE : La procédure d’électroporation in utero (des étapes 1.7 à 1.16) doit être effectuée dans les 30 minutes. Le temps de fonctionnement typique est de 20 min.

2. Préparation des tranches

NOTE : La fraîcheur des tranches est la clé du succès de cette expérience. Les tranches doivent être préparées (selon les étapes 2.5 à 2.12) dans les 2 heures.

  1. Préparez la solution saline équilibrée de Hanks avec du Ca2+ et du Mg2+ ; HBSS(+). Ajouter 5 mL de CaCl2 (14 g/L, autoclave) et 5 mL de MgSO 4.7H2O (20 g/L, autoclave) à 500 mL de HBSS(-). Conserver à 4 °C. Faites buliser la solution avec du gaz 95% O2 + 5% CO2 pendant 5 min sur de la glace avant utilisation.
  2. Préparez le milieu de culture. Au moins 2,5 ml/plat sont nécessaires. Ajouter 2 ml de sérum fœtal bovin, 25 μL de L-glutamine (200 mM), 200 μL de B27 (50x), 50 μL de pénicilline + streptomycine (10 unités K/mL et 10 mg/mL) à 8 mL de milieu neurobasal.
  3. Préparez du gel d’agarose à basse température de fusion à 3%. Porez 50 mL de HBSS(+), puis ajoutez 1,5 mg d’agarose à basse température de fusion et autoclavez-le. Faites fondre l’agarose dans un four à micro-ondes et maintenez-le à 50 °C dans un incubateur à bain-marie avant de l’utiliser.
  4. Ajouter 1,9 mL de milieu de culture dans un plat à base en verre. Placez soigneusement un insert de culture cellulaire dessus pour ne pas coincer les ampoules d’air sous le filtre, puis ajoutez 500 μL de milieu de culture sur le filtre (Figure 1B). Placez-le sur de la glace.
  5. Après avoir anesthésié les souris manipulées par inhalation d’isoflurane à 5 %, sacrifiez-les par luxation cervicale (selon les protocoles approuvés par l’établissement) aux stades appropriés pour être observés.
    REMARQUE : Deux jours (48 h) et 3 jours après l’électroporation à E14.5 conviennent pour observer la transition multipolaire-bipolaire et le mode de locomotion, respectivement.
  6. Sortez les embryons et placez-les dans une boîte de Pétri avec du PBS froid.
  7. Sélectionnez les embryons par l’expression de la GFP ou d’autres protéines fluorescentes au microscope.
  8. Après la décapitation des embryons, disséquez les cerveaux6 sous un microscope de dissection et conservez-les dans HBSS(+) froid.
  9. Versez le gel d’agarose fondu à basse température de fusion à 3% dans un cryomoule (voir tableau des matériaux), puis mettez-y les cerveaux et roulez-les plusieurs fois. Placez-le à température ambiante jusqu’à ce que l’agarose se solidifie complètement, puis placez-le sur de la glace.
  10. Trancher les cerveaux coronaires à l’épaisseur de 350 μm à l’aide d’un microtome vibrant (voir Tableau des matériaux).
  11. Disposez les tranches sur le filtre (maximum 6 tranches par filtre).
  12. Prélever le milieu de culture de l’intérieur et de l’extérieur de la coupelle filtrante (600 μL au total). Dans cette étape, les tranches sont pressées et fixées sur un filtre. Après 5 min, ajoutez 100 μL de milieu de culture à l’intérieur de l’insert de culture cellulaire.

3. Imagerie en accéléré

  1. Maintenir la chambre de culture montée sur la platine d’un microscope à balayage laser inversé à 37 °C à l’aide de la chaleur de la chambre ou d’un pare-soleil entourant le microscope au moins 30 minutes avant l’imagerie pour éviter la dérive Z. Fournir du gaz humidifié 5% CO2 + 40% O2 à la chambre de culture.
  2. Placez le plat de culture avec les tranches préparées ci-dessus dans la chambre de culture.
  3. À l’aide d’un objectif 20x à longue distance de travail (NA = 0,45), capturez environ 10 images Z-stack avec des pas de 5 μm toutes les 15 à 30 minutes pendant 24 h.
    REMARQUE : L’utilisation d’une platine XY motorisée est fortement recommandée. Cela nous permet d’obtenir des images à partir de plusieurs champs objectifs. En règle générale, nous obtenons 10 à 20 images à partir de différents champs d’objectifs dans une expérience en accéléré.

4. Analyse d’imagerie

  1. Convertissez les images XYZT en XYT par la projection maximale de l’axe Z à l’aide d’ImageJ ou d’un autre logiciel.
    REMARQUE : Si les tranches ont glissé pendant l’observation, ajustez la position des cellules dans les images à l’aide de StackRed, un plugin ImageJ, avec sa fonction de transformation de corps rigide (voir Tableau des matériaux).
  2. Tracez la trajectoire des cellules GFP ou d’autres cellules positives aux protéines fluorescentes, manuellement ou automatiquement. Le traçage manuel et automatique peut être effectué à l’aide de MTrackJ24 et TrackMate25,26 (plugins ImageJ), respectivement. Le traçage automatique à l’aide de TrackMate est efficace pour analyser de nombreuses cellules de manière impartiale. Cependant, le traçage manuel à l’aide de MTrackJ reste utile pour le suivi précis des cellules individuelles.

Résultats

Les cellules gliales radiales dans le VZ palléal ne produisent que des neurones jusqu’à E14, et des neurones et des cellules gliales à E15 et E16. Pour observer simultanément les comportements migratoires des neurones et des cellules gliales, nous les avons marqués avec une GFP améliorée (EGFP) et une RFP, respectivement, en utilisant un promoteur spécifique des neurones, le promoteur Tα127, et le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale humaine (hGFAP)28, qui est préférentiellement activé dans les astrocytes. Les progéniteurs des astrocytes répètent les divisions cellulaires au cours de la migration, ce qui entraîne la dilution du plasmide dans les cellules. Pour éviter cela, un système de vecteurs de transposons composé d’un plasmide donneur (pPB) et d’un vecteur d’expression de la transposase (pCAG-hyPBase) a été utilisé29,30. Le plasmide donneur utilisé ici (pPB-CAG-LNL-RFP) a une cassette loxP-neo-loxP (LNL) et exprime la RFP en fonction de la recombinase Cre. Souris ICR (type sauvage ; WT) ont été électroporés avec les plasmides indiqués à la figure 2A à E15, et les coupes ont été préparées 3 jours plus tard. Au cours de cette période, la première cohorte de neurones EGFP+ a atteint la surface de la plaque corticale (Figure 2B), mais de nombreux neurones EGFP+ étaient encore en migration. L’observation en accéléré a été effectuée pendant 24 h. Au cours de cette observation, des neurones à processus dirigeant épais ont migré linéairement vers la surface du cerveau à un rythme relativement constant dans la plaque corticale (19,54 ± 6,21 μm/h, moyenne ±écart-type, 70 cellules). Les trajectoires de migration ont été tracées automatiquement à l’aide du logiciel TrackMate (lignes magenta sur la figure 2B). Dans le même champ objectif, les progéniteurs d’astrocytes ont été visualisés avec RFP (Figure 2C). Étant donné que le promoteur hGFAP est également actif dans les cellules gliales radiales aux stades embryonnaires avancés, certains neurones dérivés de ces cellules gliales radiales expriment également RFP (flèches bleues sur les figures 2B et C). Ces neurones sont presque toujours transfectés avec un vecteur d’expression EGFP. Par conséquent, les progéniteurs d’astrocytes ont été identifiés comme des cellules RFP mono-positives.

Contrairement aux neurones, les progéniteurs des astrocytes migrent rapidement et de manière aléatoire avec des changements de direction fréquents dans la zone intermédiaire et la plaque corticale (migration erratique)5. La migration des progéniteurs astrocytaires a été tracée manuellement par le logiciel MTrackJ (lignes magenta sur la figure 2C), qui a révélé leur motilité élevée (88,37 ± 33,61 μm/h, 5 cellules). Pour observer la relation entre les progéniteurs des astrocytes et les vaisseaux sanguins, des souris Flt1-DsRed, qui expriment DsRed, un RFP, dans les cellules endothéliales, ont été utilisées. Dans cette expérience, les progéniteurs des astrocytes étaient censés être identifiés uniquement par EGFP. À cette fin, le système rDIO5 a été développé, dans lequel l’expression de l’EGFP dépendant de hGFAP-Cre peut être éliminée dans les neurones en utilisant un promoteur Dcx (un promoteur spécifique précoce des neurones)31 activant un autre ensemble de recombinase d’ADN et sa séquence de reconnaissance (Dre-rox) (Figure 2D, la séquence de pPB-CAG-rDIO-EGFP est fournie dans le fichier supplémentaire 1)32, 33. Planche 33. Le système rDIO a été introduit chez la souris Flt1-DsRed à E15 par électroporation in utero, et des coupes ont été préparées 24 h plus tard. En conséquence, il a été observé que les progéniteurs astrocytaires positifs à l’EGFP migraient activement le long des vaisseaux sanguins (migration guidée par les vaisseaux sanguins)5 (Figure 2E).

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Figure 1 : Flux d’observations en accéléré de cellules marquées par électroporation in utero. (A) Une souris enceinte à un stade approprié est anesthésiée et la cavité abdominale est ouverte. La zone chirurgicale est recouverte de feuilles de plastique stérile et de papier stérile. Les cornes utérines sont exposées et les embryons sont injectés avec 1 μL de mélange plasmidique et des impulsions électroniques appliquées. La paroi abdominale et la peau sont suturées, et les souris manipulées sont replacées dans la cage domestique. (B) Les tranches préparées à partir de cerveaux électroporés sont placées sur le filtre de l’insert de culture cellulaire (6 tranches maximum) dans un plat à base de verre. Les plats de base en verre contenant les tranches sont montés dans une chambre de culture. Ce système time-lapse dispose d’un pare-soleil en acrylique couvrant l’ensemble du microscope pour maintenir la température à 37 °C. La chambre de culture, dans laquelle est fourni un mélange de gaz humidifié, est équipée d’une platine de microscope à l’intérieur de la hotte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Observations en accéléré de neurones et de progéniteurs d’astrocytes. (A) Méthode de marquage différentiel des neurones (EGFP, vert) et des progéniteurs d’astrocytes (RFP, rouge), et une image représentative d’une coupe préparée 2 jours après l’électroporation à 2 h du début de l’imagerie en accéléré (à droite). (B, C) Images en accéléré des cellules EGFP+ (B) et RFP+ (C) sur le même champ objectif montré en (A)-droite de 2 h à 21 h d’observation. (B) Les trajectoires des cellules EGFP+ en migration détectées automatiquement par le logiciel TrackMate étaient affichées en magenta. (C) Les trajectoires des cellules RFP+ ont été tracées manuellement à l’aide du logiciel MTrackJ. Les cellules doubles positives EGFP/RFP, que l’on pense être des neurones, sont indiquées par des flèches bleues. (D) Stratégie de marquage des progéniteurs d’astrocytes à l’aide du système rDIO dans les embryons de souris Flt1-DsRed. (E) Résultat représentatif de la migration guidée par les vaisseaux sanguins. Une cellule (flèche) a fait saillir un processus principal (pointe de flèche) et a migré le long du vaisseau sanguin exprimant DsRed (magenta) vers la surface piale. CP; plaque corticale. IZ; zone intermédiaire. VZ ; zone ventriculaire. Barres d’échelle : 200 μm (A–C), 50 μm (E). Cette figure est adaptée de Tabata H. et al.5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Neurones (couches II/III)Progéniteurs des astrocytesSystème rDIO
(étiquetage spécifique aux astrocytes)
pCAG-EGFP0,5 μg/μLpPB-CAG-LNL-EGFP0,5 μg/μLpPB-CAG-rDIO-EGFP0,5 μg/μL
ou Ta1-EGFP (plus spécifique pour les neurones)0,5 μg/μLhGFAP-Cre0,75 μg/μLhGFAP-Cre0,75 μg/μL
pCAG-hyPBase0,5 μg/μLpDcx-Dre0,5 μg/μL
pCAG-hyPBase0,5 μg/μL

Tableau 1 : Composants représentatifs du mélange plasmidique pour chaque cible. Les vecteurs EGFP peuvent être remplacés par des RFP équivalents ou d’autres vecteurs d’expression de protéines fluorescentes. Pour marquer les progéniteurs des astrocytes, un système de vecteurs transposons est utilisé. Les vecteurs pPB sont des vecteurs transposons PiggyBac pour l’intégration du génome. pCAG-hyPBase est un vecteur d’expression de la transposase PiggyBac. LNL est une cassette loxP-neo-loxP pour l’expression dépendante de Cre. rDIO-EGFP est une cassette d’expression de l’EGFP dépendante de Cre-loxP et Dre-roxP. Pour observer le phénotype de gain ou de perte de fonction des gènes souhaités, des vecteurs d’expression ou des vecteurs d’inactivation peuvent être ajoutés à 1 μg/μL. La concentration de ces vecteurs doit être ajustée dans chaque cas.

Fichier supplémentaire 1 : Séquences plasmidiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole a introduit une méthode d’observation en accéléré des cellules dérivées de la VZ palléale (corticale). Pour marquer les cellules migratrices de la VZ, nous avons utilisé l’électroporation in utero, dans laquelle les cellules individuelles ont été clairement marquées avec un rapport signal/bruit plus élevé que dans le marquage par vecteur viral. En utilisant l’électroporation in utero, tout type de vecteur dans n’importe quelle combinaison peut être facilement introduit dans les cellules gliales radiales (cellules souches neurales) des embryons vivants. Les neurones et les progéniteurs gliaux peuvent être marqués de manière sélective à l’aide de différents promoteurs. Étant donné que le nombre de copies des plasmides introduits par électroporation in utero est élevé, des études de gain et de perte de fonction peuvent être facilement menées par co-électroporation de vecteurs d’expression GFP et de divers vecteurs liés aux gènes d’intérêt, tels que les vecteurs d’expression et les vecteurs knockdown/knock-out. De plus, l’électroporation in utero peut être utilisée pour introduire des vecteurs plasmidiques dans la ZV de diverses régions du cerveau autres que la ZV corticale, ce qui nous permet d’observer la migration d’autres types de cellules telles que les neurones inhibiteurs, les progéniteurs oligodendrocytaires à partir des éminences ganglionnaires 34,35,36 et les neurones pyramidaux de l’hippocampe 37.

Dans les études en accéléré, les effets des expériences de gain et de perte de fonction sur le comportement cellulaire peuvent être évalués à l’aide des logiciels TrackMate et MTrackJ. De nombreux gènes, y compris ceux responsables des troubles neurodéveloppementaux et des déficiences intellectuelles, sont impliqués dans la migration neuronale. Des études en accéléré peuvent révéler directement comment ces gènes régulent le comportement cellulaire. Par rapport à la migration neuronale, les mécanismes moléculaires de la migration des cellules gliales ne sont pas bien compris. Cette méthode peut révéler non seulement le développement normal des cellules gliales, mais aussi les facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent affecter le développement glial et sa relation avec la maladie mentale.

La limite de cette méthode est qu’elle dépend inévitablement de la méthode de culture en tranches in vitro . Il est intéressant de noter que les neurones en migration ne perdent pas de repères directionnels pour la migration vers la surface du cerveau, même dans les tranches cultivées in vitro. Cependant, les enquêteurs doivent être prudents avec les artefacts. Les cellules près de la surface sont fixées au filtre et les bords des tranches sont facilement déformés. Ces cellules doivent être exclues de l’analyse. Des expériences de contrôle doivent être envisagées si possible. Il est important de noter que les coupes de cerveau récapitulent le développement normal en 24 heures environ. Par conséquent, le moment de la préparation de la tranche à partir de l’électroporation doit être déterminé de manière à ce que les événements à analyser se produisent dans cette fenêtre de temps. Pour observer la transition multipolaire-bipolaire, les coupes doivent être préparées 2 jours après l’électroporation. Pour analyser la migration en mode locomotion, 3 jours plus tard est approprié. L’observation de la migration guidée par les vaisseaux sanguins est une tâche plus difficile que celle d’autres expériences. Les cellules endothéliales se dégradent facilement en tranches sans circulation sanguine. Pour minimiser la dégradation des vaisseaux sanguins, les tranches doivent être préparées le plus rapidement possible et maintenues dans un milieu contenant 20 % de sérum et 40 % de gazO2 . D’autres expériences complémentaires, telles que les analyses histologiques de cerveaux fixes ou l’imagerie en direct in vivo par microscopie à deux photons, pourraient renforcer les observations trouvées dans les analyses time-lapse en tranches.

En résumé, cette méthode est la seule option pour observer le comportement des cellules pendant 24 h. Avec le développement de nouveaux vecteurs plasmidiques, le champ d’application de cette méthode s’élargira encore à l’avenir.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Tα1 promoteur est un don de P. Barker et F.D. Miller. Le promoteur Dcx est un cadeau de Q. Lu. hGFAP-Cre était un cadeau d’Albee Messing. Le système de vecteurs transposons PiggyBac a été fourni par l’Institut Sanger. Les souris Flt1-DsRed ont été fournies par M. Ema (Université de Shiga). Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (subvention numéro JP21K07309 à H. Tabata, JP20H05688 et JP22K19365 à K. Nakajima) et la Takeda Science Foundation, le Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, le Keio Gijuku Academic Development Funds à K. Nakajima.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube d’aspirateurDrummond2-040-000
Atipamézole (5 mg/mL)MeijiMepatia
AutoclipBecton Dickinson4276309 mm
B27supplement Gibco17504-044
Butorphanol (5 mg/mL)MeijiVetorphale
Insert de culture cellulaireMilliporePICM ORG 50
Microscope confocalNikonA1RHD25Équipé d’un objectif longue distance de travail (S Plan Fluor ELWD 20XC)
CryomoldTissue-Tek4566
Chambre de cultureTokkenTK-NBCMPÉlectroporateur sur mesure
NEPA GeneNEPA21
FastGreen Sigma-AldrichF7258
Mélangeur de gazTokkenTK-MIGM01-02
Plat à base en verreIwaki3910-035Le diamètre de la base en verre est de 27 mm
Capillaires en verreNarishigeGD-1
HBS (2x)Sigma-Aldrich51558
HBSS(-)Wako084-08345
Unité de chauffageTokkenTK-0003HU20Sur mesure, avec hotte et chauffage
hGFAP-Cre Addgene#40591Un cadeau d’Albee Messing
ImageJhttps://imagej.net/ij/
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
Agarose à basse température de fusionLonza50100
Médétomidine (1 mg/mL)MeijiMedetomin
MicroinjecteurNarishigeIM-300
Midazolam (5 mg/mL)SandozMidazolam
MTrackJhttps://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
Milieu neurobasalGibco21103-049
pCAG-hyPBaseL’ADNc hyPBase de la pCMV-hyPBase (un don de l’Institut Sanger) a été inséré dans l’aval du promoteur CAG de la pCAGGS (un don de J. Miyazaki).
pDcx-DreLe promoteur Dcx de Dcx4kbEGFP70 (un cadeau de Q. Lu) a été échangé avec le promoteur CAG de pCAG-NLS-HA-Dre34 (un cadeau de Pawel Pelczar, Addgene #51272).
Pénicilline + streptomycineGibco15140122
Kit de purification du plasmideInvitrogenPureLink HiPure plasmide midiprep kit (K210005)
La cassette pPB-CAG-LNL-RFPCAG-LNL de pCALNL-DsRed (un don de Connie Cepko, Addgene #13769), et l’ADNc TurboRFP (Evrogen, FP232) ont été insérés dans le site de clonage de pPB-CAG.EBNXN (un don de l’Institut Sanger).
pPB-CAG-rDIO-EGFPLa séquence contenant les sites rox synthétiques, la cassette DIO synthétique et l’ADNc EGFP de pEGFP-N1 (Clontech, U55762) en sens inverse a été insérée dans le site de clonage de pPB-CAG.EBNXN (un don de l’Institut Sanger). La séquence est fournie dans le fichier supplémentaire.
ExtracteurNarishigePN-31
StackRedun plugin pour ImageJhttp://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/
Aiguille de sutureNazmeC-24-521-R No.11/2 cercle, longueur 14 mm
Fil de sutureNazmeC-23-B2Soie, taille 5-0
Souris ICR enceintes temporisées (type sauvage)Japon SLCICR
TrackMatehttps://imagej.net/plugins/trackmate/index
électrode de type pince à épilerBEX ou NEPA GeneCUY650P5  ;
T&alpha ; L’ADNc 1-EGFPEGFP de pEGFP-N1 (Clontech, U55762) a été inséré en aval du T&alpha ; 1 promoteur dans le plasmide 253 (don de P. Barker et F.D.Miller)
Microtome vibrantLeica ou ZeissMicrotome à lame vibrante VT1000S ou Hyrax V50.
souris

Références

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