Article de méthode

Préparation et analyse de lames histologiques de globes oculaires de rat et de souris pour évaluer la rétine

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DOI :

10.3791/66663

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23 août 2024

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1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit présente un protocole pour la préparation histologique de lames à partir de globes oculaires de rongeurs. Avec la méthode proposée, la rétine interne peut être facilement visualisée et évaluée au microscope optique. La procédure est présentée pour les globes oculaires des souris et des rats.

Résumé

Un globe oculaire de rongeur est un outil puissant pour étudier les mécanismes pathologiques de nombreuses maladies ophtalmiques, telles que le glaucome, la rétinopathie hypertensive et bien d’autres. Les expériences précliniques permettent aux chercheurs d’examiner l’efficacité de nouveaux médicaments, de développer de nouvelles méthodes de traitement ou de rechercher de nouveaux mécanismes pathologiques impliqués dans l’apparition ou la progression de la maladie. Un examen histologique fournit de nombreuses informations nécessaires pour évaluer les effets des expériences menées et peut révéler une dégénérescence, un remodelage tissulaire, une infiltration et de nombreuses autres pathologies. Dans la recherche clinique, il y a rarement une chance d’obtenir un tissu oculaire adapté à un examen histologique, c’est pourquoi les chercheurs devraient profiter de l’opportunité offerte par l’examen des globes oculaires des rongeurs. Ce manuscrit présente un protocole pour la préparation histologique des coupes oculaires de rongeurs. La procédure est présentée pour les globes oculaires de souris et de rats et comporte les étapes suivantes : (i) prélèvement du globe oculaire, (ii) conservation du globe oculaire pour une analyse plus approfondie, (iii) traitement du tissu en paraffine, (iv) préparation des lames, (v) coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, (vi) évaluation du tissu au microscope optique. Avec la méthode proposée, la rétine peut être facilement visualisée et évaluée en détail.

Introduction

Le globe oculaire est une structure en forme de globe constituant l’organe de la vue. L’intérieur du globe oculaire peut être divisé en deux segments : le segment antérieur, qui comprend la cornée, l’iris, le corps ciliaire, le cristallin, la chambre antérieure et la chambre postérieure, et le segment postérieur, qui comprend le corps vitré, la rétine, la choroïde, la sclère, la tête du nerf optique. La chambre antérieure est située entre la cornée et l’iris 1,2. L’iris est une structure circulaire avec une ouverture au centre appelée la pupille. À la jonction de la cornée et de l’iris, il y a l’angle de drainage, où un système spécialisé de trabécules draine l’humeur aqueuse du globe oculaire au système veineux. La chambre postérieure est délimitée par l’iris, le corps ciliaire et le cristallin, ainsi que par les ligaments suspenseurs qui maintiennent le cristallin en place. Derrière le cristallin se trouve le corps vitré, qui est la plus grande structure du globe oculaire. Le corps vitré adhère à la rétine et stabilise sa position. La rétine est entourée par la choroïde et la sclérotique1. L’anatomie du globe oculaire est résumée à la figure 1.

La paroi du globe oculaire se compose de trois couches. La couche la plus externe est la sclère, qui protège le globe oculaire des blessures et maintient sa forme. Au pôle antérieur du globe oculaire, la sclérotique se transforme en une cornée transparente. Sous la sclère, il y a une structure vasculaire appelée uvée, dont la fonction principale est de nourrir les structures de l’œil. L’uvée forme la choroïde, et à l’intérieur du pôle antérieur, le corps ciliaire et l’iris1. La couche la plus interne est la rétine, qui est une structure hautement spécialisée de l’œil, composée de neurones, de cellules gliales et de cellules épithéliales pigmentaires. Les neurones rétiniens comprennent les cellules photoréceptrices (bâtonnets et cônes), les cellules horizontales, les cellules bipolaires, les cellules amacrines et les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR). Ces cellules sont organisées en couches complexes, et leur rôle est de recevoir et de traiter les stimuli lumineux 2,3. Les cellules gliales de la rétine comprennent les cellules de Müller, les astrocytes et la microglie, qui sont présentes dans toutes les couches de la rétine. Les nombreuses fonctions des cellules gliales comprennent la nutrition des neurones, le soutien de la barrière hémato-rétinienne, le soutien structurel des neurones pour maintenir la structure en couches de la rétine, la régulation du métabolisme des neurones, la sécrétion de protéines biologiquement actives régulant le fonctionnement, la croissance et la survie des neurones, et la régulation des processus immunologiques au sein de la rétine4. Les cellules épithéliales pigmentaires constituent la couche la plus externe de la rétine et agissent comme une barrière entre la choroïde et les photorécepteurs. Ces cellules régulent le transport bidirectionnel des déchets et des nutriments et protègent également la rétine des dommages excessifs induits par la lumière en absorbant l’énergie lumineuse et en neutralisant les espèces réactives de l’oxygène générées par la lumière5.

La rétine peut être divisée en dix couches : (i) l’épithélium pigmentaire rétinien, (ii) la couche du segment photorécepteur (bâtonnets et cônes), (iii) la membrane limitante externe (ELM), (iv) la couche nucléaire externe (ONL), (v) la couche plexiforme externe (OPL), (vi) la couche nucléaire interne (INL), (vii) la couche plexiforme interne (IPL), (viii) la couche de cellules ganglionnaires (GCL), (ix) la couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL), et (x) membrane limitative interne (ILM)2. Les couches nucléées de la rétine comprennent l’ONL, l’INL et le GCL, tandis que les couches avec des connexions synaptiques entre les cellules comprennent l’OPL et l’IPL6. Les noyaux des bâtonnets et des cônes forment l’ONL, et leurs axones s’étendent dans l’OPL, où ils se connectent aux dendrites des cellules bipolaires et horizontales. À l’intérieur de l’INL, les noyaux cellulaires horizontaux, bipolaires et amacrines sont situés. Au sein de l’IPL, les terminaisons axonales des cellules bipolaires et amacrines font synapse avec les dendrites des CGR. Au sein du GCL, les CGR constituent la plupart des corps cellulaires, mais on peut également y trouver des cellules amacrines disloquées. Les axones des CGR forment le RNFL et, plus loin, le nerf optique 7,8,9.

De nombreuses maladies ophtalmiques, telles que les troubles neurodégénératifs de la rétine, entraînent une cécité irréversible et incurable10. La vision est considérée comme l’un des sens les plus importants11, et la cécité permanente réduit considérablement la qualité de vie du patient. Pour approfondir la compréhension des mécanismes pathologiques de nombreuses maladies, la recherche préclinique utilisant des cultures cellulaires ou des modèles animaux est largement réalisée. Les études précliniques sur des animaux de laboratoire sont l’occasion d’évaluer les mécanismes pathologiques sous-jacents aux maladies oculaires et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les maladies oculaires peuvent être modélisées à la fois chez les grands animaux (singes, vaches, chiens et chats) et les petits animaux (lapins, rats, souris et poissons-zèbres). L’utilisation d’animaux plus grands permet un meilleur accès à l’œil en raison de sa taille. Les expériences réalisées sur des rongeurs, en revanche, en raison de leur reproduction relativement rapide, permettent la reproduction de souches consanguines caractérisées par une sensibilité à certaines maladies12,13.

Dans les modèles animaux, l’énucléation est possible, ce qui permet d’effectuer un examen histopathologique détaillé du globe oculaire, avec l’évaluation des pathologies mineures qui apparaissent dans des structures particulières de l’œil au cours du développement de la maladie - un examen qui peut être très rarement effectué chez l’homme. L’évaluation histopathologique est un outil extrêmement précieux dans la recherche des mécanismes pathologiques des troubles oculaires. Dans la littérature publiée, les descriptions de la méthodologie d’examen histologique des globes oculaires sont très limitées et les guides étape par étape manquent, ce qui rend difficile la recréation pour les débutants. Cette étude vise à fournir une méthode simple et concise de préparation de lames histologiques et d’évaluation de la rétine du rat et de la souris.

Protocole

La recherche a été réalisée dans le respect des directives institutionnelles. Les globes oculaires utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir d’animaux inclus dans une expérience menée sur la base du numéro d’approbation de l’étude WAW2/122/2020 délivré par le 2e comité d’éthique local de l’Université des sciences de la vie de Varsovie à Varsovie, en Pologne. Notre protocole a été élaboré en examinant des souris âgées de 11 et 44 semaines et des rats âgés de 6, 12 et 16 semaines.

1. Préparation des globes oculaires de souris

REMARQUE : Ce protocole présente la méthode de préparation de coupes de globes oculaires de souris et a été élaboré à l’aide de globes oculaires prélevés sur des souris femelles C57Bl/6 âgées de 11 semaines (poids moyen de 21 g), des souris femelles C57Bl/6 âgées de 44 semaines (poids moyen de 25 g), des souris DBA/2 femelles âgées de 11 semaines (poids moyen de 21,5 g) et des souris femelles DBA/2 âgées de 44 semaines atteintes de glaucome (poids moyen de 25 g).

  1. Énucléation
    1. Utilisez de petites pinces pour ouvrir les paupières. Appuyez sur les paupières pour que le globe oculaire prolapsus.
    2. Disséquez le globe oculaire de l’orbite en coupant le tissu derrière le globe oculaire avec de petits ciseaux pointus. Une fois le globe oculaire retiré de l’orbite, coupez le tissu conjonctif saillant et les muscles périoculaires.
      1. Marquez les globes oculaires pour une meilleure orientation, par exemple, en attachant une petite suture sur le moignon du tendon du muscle droit latéral du globe oculaire pour marquer le côté temporal du globe oculaire.
  2. Fixation des tissus
    1. Placez le globe oculaire énucléé dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et laissez-le reposer dans une solution à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dissous dans une solution saline tampon de phosphate (PBS) pendant 24 h.
    2. Ensuite, traitez le globe oculaire pendant 24 h dans une solution à 10 % de saccharose, puis retirez-le et placez-le pendant 24 h dans une solution à 20 % de saccharose, et enfin, retirez-le et placez-le pendant 24 h dans une solution à 30 % de saccharose.
      REMARQUE : Tout au long du processus, maintenez le globe oculaire à une basse température de 4 °C. Les perforations d’aiguille pour l’infiltration de saccharose doivent être évitées afin de minimiser le risque de lésions oculaires.
  3. Congélation et stockage des tissus
    1. Retirez le globe oculaire de la solution de saccharose et séchez-le en le tamponnant légèrement avec une serviette en papier.
    2. Placez le globe oculaire dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml et congelez-le à -80 °C pour un traitement ultérieur.
      REMARQUE : S’il est stocké à - 80 °C, un globe oculaire peut rester viable jusqu’à 12 mois jusqu’à un traitement ultérieur.
  4. Préparation des lames
    1. Décongelez le globe oculaire à température ambiante. Déplacez-le du tube de microcentrifugation dans une cassette et rincez à l’eau courante pendant 20 minutes pour éliminer le saccharose.
    2. Déshydratez le globe oculaire en le plaçant dans les solutions suivantes, puis en le retirant des solutions suivantes sous une hotte : solution d’alcool éthylique à 70 % (EtOH) pendant 10 min, solution à 80 % d’EtOH pendant 10 min, solution à 96 % d’EtOH pendant 10 min, solution à 99,9 % d’EtOH pendant 10 min et acétone pendant 5 min.
    3. Nettoyez le globe oculaire en le plaçant dans du xylène pendant 5 minutes sous une hotte.
    4. Faites fondre la paraffine en plaçant un peu de paraffine solide dans un bécher et en la mettant dans un incubateur de laboratoire réglé à une température supérieure à la température de fusion spécifiée par le fabricant de la paraffine (la température de fusion de la paraffine est comprise entre 46 °C et 68 °C). Une fois que la paraffine est complètement fondue (le temps dépend de la quantité de paraffine utilisée), déplacez le globe oculaire dans le bécher avec de la paraffine et maintenez-le au chaud dans l’incubateur pendant 1 h. Pendant 1 h d’infiltration de paraffine dans les tissus, remuez la paraffine toutes les 10 à 15 min.
      REMARQUE : Un processeur de tissu qui permet l’infiltration de paraffine pendant l’agitation de la solution peut être utilisé pour cette étape.
    5. Intégrez le globe oculaire dans un bloc de paraffine comme décrit ci-dessous.
      1. Ouvrez la cassette et retirez le capot supérieur. Choisissez un moule en métal et versez une petite quantité de paraffine pour couvrir le fond du moule. Retirez le globe oculaire de la cassette à l’aide d’une pince et placez-le sur la paraffine dans le moule. Placez le globe oculaire sur le côté pour assurer la coupe dans le plan sagittal.
        REMARQUE : Placer le globe oculaire sur son côté (avec le pôle antérieur d’un côté et le pôle postérieur de l’autre) permettra de couper dans le plan sagittal. De cette façon, des coupes à travers la cornée, l’iris, le corps ciliaire, la pupille, la rétine périphérique et centrale seront obtenues.
      2. Refroidissez brièvement le moule sur une plaque de refroidissement réglée à - 15 °C pour que la paraffine se solidifie légèrement afin d’ancrer le tissu en place. Couvrez soigneusement le tissu avec de la paraffine et le fond de la cassette pour former un bloc. Placez le bloc sur une plaque de refroidissement pour qu’il se solidifie complètement. Ensuite, retirez le bloc du moule métallique et replacez les blocs de paraffine sur la plaque de refroidissement pendant au moins 15 min pour refroidir avant de couper.
    6. Fixez un bloc de paraffine dans le microtome. Réglez le microtome pour couper l’excès de paraffine du bloc (nous le réglons pour couper 15 μm) et coupez jusqu’au centre du globe oculaire. Modifiez les paramètres du microtome pour couper des sections plus fines (nous le réglons pour couper 3,5 μm) et placez la section sur une lame. Si vous utilisez un microtome avec un bain-marie adjacent, retirez l’excès d’eau de la lame avec un mouchoir humide.
      REMARQUE : L’objectif est d’obtenir au moins 3 sections transversales à travers la pupille. Moins le chercheur est expérimenté, plus il faut obtenir de sections pour assurer une section au niveau de l’élève. Placez quelques sections sur une seule diapositive. De plus, pour les chercheurs moins expérimentés, coupez le tissu plus épais, par exemple, en sections de 4 μm ou 5 μm d’épaisseur. L’utilisation d’un microtome avec un bain-marie adjacent facilite grandement le processus de transfert de sections de tissus sur des lames par rapport à l’utilisation de microtomes sans bain-marie. Un autre point à noter est que l’objectif peut être difficile à couper. Pour minimiser le risque de lésions tissulaires causées par la lentille fragile, n’utilisez que des lames de microtome tranchantes conçues pour couper les tissus durs. Envisagez d’utiliser une lame pour la coupe et une autre pour couper des sections afin de minimiser l’émoussement de la lame.
    7. Placez la lame dans un incubateur de laboratoire réglé à 56 °C pendant 30 min.
    8. Retirez la lame de l’incubateur et commencez à la colorer manuellement avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) en plaçant et en retirant séquentiellement la lame vers et depuis les solutions suivantes. Commencez avec 7 min de xylène, 5 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre) et 5 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre). Poursuivez avec 2 min 96 % EtOH, 1 min 96 % EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 1 min 96 % EtOH (un autre bécher avec une solution propre).
    9. Laver à l’eau courante 5 min, puis 2 min d’hématoxyline de Mayer, 2 min d’hématoxyline de Mayer (un autre bécher avec une solution propre), 5 min d’eau courante, 5 min d’eau courante (un autre bécher propre).
    10. Ajouter 1 % d’éosine pendant 2 min, suivi de 1 min 96 % d’EtOH, 30 s 96 % d’EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 30 s 96 % d’EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 2 min de xylène, 1 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre), 2 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre).
      REMARQUE : Vous pouvez également utiliser un colorateur de lames automatisé.
    11. Scellez la diapositive à l’aide d’une scelleuse de lames automatisée. La lame préparée est prête à être stockée et évaluée au microscope optique.
      REMARQUE : Vous pouvez également effectuer le scellement manuel de la lame en plaçant une fine couche de polystyrène sur le tissu taché et en le recouvrant d’une lamelle en verre.
      ATTENTION : Les étapes qui incluent le PFA, l’EtOH, l’acétone et le xylène doivent être effectuées sous une hotte de laboratoire.

2. Préparation de la section des globes oculaires de rat et du montage de la glissière

REMARQUE : Ce protocole présente la méthode de préparation de coupes de globes oculaires de rat et a été élaboré à l’aide des globes oculaires prélevés sur : des rats SHR mâles âgés de 6 semaines (poids moyen 115,5 g), des rats SHR mâles âgés de 12 semaines souffrant d’hypertension artérielle (poids moyen 262,5 g), des rats WKY mâles âgés de 6 semaines (poids moyen 143,5 g), des rats WKY mâles âgés de 12 semaines (poids moyen 265 g), des rats Lewis mâles âgés de 12 semaines (poids moyen 310 g) et des rats Lewis mâles âgés de 16 semaines atteints de diabète sucré induit (poids moyen 259 g).

  1. Énucléation
    1. Utilisez de petites pinces pour ouvrir les paupières. Appuyez sur les paupières pour faire prolapsus le globe oculaire.
    2. Disséquez le globe oculaire de l’orbite en coupant le tissu derrière le globe oculaire avec de petits ciseaux pointus.
      REMARQUE : Marquez les globes oculaires pour une meilleure orientation, par exemple, en attachant une petite suture sur le moignon du tendon du muscle droit latéral du globe oculaire pour marquer le côté temporal du globe oculaire.
  2. Fixation des tissus
    1. Placez le globe oculaire énucléé dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et laissez-le reposer dans une solution à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dissous dans une solution saline tampon de phosphate (PBS) pendant 24 h.
    2. Ensuite, traitez le globe oculaire pendant 24 h dans une solution à 10 % de saccharose, puis retirez-le et placez-le pendant 24 h dans une solution à 20 % de saccharose, et enfin retirez-le et placez-le pendant 24 h dans une solution à 30 % de saccharose.
      REMARQUE : Tout au long du processus, maintenez le globe oculaire à une basse température de 4 °C. Les perforations d’aiguille pour l’infiltration de saccharose doivent être évitées afin de minimiser le risque de lésions oculaires.
  3. Congélation et stockage des tissus
    1. Retirez le globe oculaire de la solution de saccharose et séchez-le en le tamponnant légèrement avec une serviette en papier.
    2. Placez le globe oculaire dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml et congelez-le à -80 °C pour un traitement ultérieur.
      REMARQUE : S’il est stocké à -80 °C, le globe oculaire peut rester viable jusqu’à 12 mois jusqu’à un traitement ultérieur.
  4. Préparation des lames
    1. Retirez le globe oculaire du congélateur et du tube de microcentrifugation. Coupez le globe oculaire en deux le long du plan sagittal avec un scalpel bien aiguisé. Retirez et jetez l’objectif.
      REMARQUE : Cette étape est plus facile à effectuer sur un globe oculaire congelé, fraîchement sorti du congélateur. Lors de la coupe du globe oculaire, le cristallin peut endommager les tissus environnants. Pour minimiser les risques de dommages, utilisez un scalpel très tranchant et restez prudent.
    2. Décongelez le globe oculaire à température ambiante. Déplacez les deux moitiés dans une cassette et rincez à l’eau courante pendant 20 minutes pour éliminer le saccharose.
    3. Déshydratez le globe oculaire en le plaçant dans les solutions suivantes puis en le retirant des solutions suivantes sous une hotte : solution d’alcool éthylique à 70 % (EtOH) pendant 15 min, solution à 80 % d’EtOH pendant 15 min, solution à 96 % d’EtOH pendant 15 min, solution à 99,9 % d’EtOH pendant 15 min et acétone pendant 7 min.
    4. Nettoyez le globe oculaire en le plaçant dans du xylène pendant 7 minutes sous une hotte.
    5. Faites fondre la paraffine en plaçant un peu de paraffine solide dans un bécher et en la mettant dans un incubateur de laboratoire réglé à une température supérieure à la température de fusion spécifiée par le fabricant de la paraffine (la température de fusion de la paraffine est comprise entre 46 °C et 68 °C). Une fois que la parampine est complètement fondue (le temps dépend de la quantité de paraffine utilisée), déplacez le globe oculaire dans le bécher avec de la paraffine et maintenez-le au chaud dans l’incubateur pendant 1 h. Pendant 1 h d’infiltration de paraffine dans les tissus, remuez la paraffine toutes les 10 à 15 min.
      REMARQUE : Un processeur de tissu qui permet l’infiltration de paraffine pendant l’agitation de la solution peut être utilisé pour cette étape.
    6. Intégrez le globe oculaire dans un bloc de paraffine comme décrit ci-dessous.
      1. Ouvrez la cassette et retirez le capot supérieur. Choisissez un moule en métal et versez une petite quantité de paraffine pour couvrir le fond du moule. Retirez le globe oculaire de la cassette à l’aide d’une pince et placez-le sur la paraffine dans le moule. Placez la moitié d’un globe oculaire avec le fond de la tasse vers le haut et l’autre vers le bas.
        REMARQUE : Placer les moitiés du globe oculaire avec une moitié avec le bas de la tasse vers le haut et l’autre vers le bas permettra la coupe des tissus dans le plan sagittal. De cette façon, des coupes à travers la cornée, l’iris, le corps ciliaire, la pupille, la rétine périphérique et centrale seront obtenues.
      2. Refroidissez brièvement le moule sur une plaque de refroidissement réglée à - 15 °C pour que la paraffine se solidifie légèrement et ancre le globe oculaire en place. Couvrez soigneusement le globe oculaire avec de la paraffine et le fond de la cassette pour former un bloc. Placez le bloc sur une plaque de refroidissement pour qu’il se solidifie complètement. Ensuite, retirez le bloc du moule métallique et replacez les blocs de paraffine sur la plaque de refroidissement pendant au moins 15 min pour refroidir avant de couper.
    7. Fixez un bloc de paraffine dans le microtome. Réglez le microtome pour couper l’excès de paraffine du bloc (nous le réglons pour couper 15 μm) et coupez jusqu’à ce que vous atteigniez le centre du globe oculaire. Modifiez les paramètres du microtome pour couper des sections plus fines (nous le réglons pour couper 3,5 μm) et placez la section sur une lame. Si vous utilisez un microtome avec un bain-marie adjacent, retirez l’excès d’eau de la lame avec un mouchoir humide.
      REMARQUE : L’objectif est d’obtenir au moins 3 sections transversales à travers la pupille. Moins le chercheur est expérimenté, plus il faut obtenir de sections pour assurer une section au niveau de l’élève. Placez quelques sections sur une seule diapositive. De plus, pour les chercheurs moins expérimentés, coupez le tissu plus épais, par exemple, en sections de 4 μm ou 5 μm d’épaisseur. L’utilisation d’un microtome avec un bain-marie adjacent facilite grandement le processus de transfert de sections de tissus sur des lames par rapport à l’utilisation de microtomes sans bain-marie.
    8. Retirez la lame et commencez à colorer manuellement avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) en plaçant et en retirant séquentiellement la lame dans et à partir des solutions suivantes. Commencez avec 7 min de xylène, 5 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre) et 5 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre). Poursuivez avec 2 min 96 % EtOH, 1 min 96 % EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 1 min 96 % EtOH (un autre bécher avec une solution propre).
    9. Laver à l’eau courante 5 min, puis 2 min d’hématoxyline de Mayer, 2 min d’hématoxyline de Mayer (un autre bécher avec une solution propre), 5 min d’eau courante, 5 min d’eau courante (un autre bécher propre).
    10. Ajouter 1 % d’éosine pendant 2 min, suivi de 1 min 96 % d’EtOH, 30 s 96 % d’EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 30 s 96 % d’EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 2 min de xylène, 1 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre), 2 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre).
      REMARQUE : Vous pouvez également utiliser un colorateur de lames automatisé.
    11. Scellez la diapositive à l’aide d’une scelleuse de lames automatisée. Les lames préparées sont prêtes à être stockées et évaluées au microscope optique.
      REMARQUE : Alternativement, effectuez le scellement de la lame manuellement, en plaçant une fine couche de polystyrène de montage sur le tissu taché et recouvrir par une lamelle en verre.
      ATTENTION : Les étapes qui incluent le PFA, l’EtOH, l’acétone et le xylène doivent être effectuées sous une hotte de laboratoire.

3. Évaluation des sections du globe oculaire

  1. Numérisation de diapositives
    1. Placez la lame dans un scanner de lames histopathologique et numérisez les coupes en utilisant le mode de balayage : 40x. Enregistrez les images sous forme de fichiers numériques haute résolution.
  2. Analyse de lames
    1. Ouvrez le fichier numérisé à l’aide d’un logiciel de visualisation d’images. Trouvez des sections transversales d’élèves et analysez trois sections consécutives.
    2. Trouvez la partie la plus épaisse de la rétine et agrandissez l’image à 20x en appuyant sur la case de grossissement dans le coin supérieur droit et en choisissant 20x. Déplacez la souris au niveau de l’ELM dans la partie la plus épaisse de la rétine et appuyez sur le bouton droit de la souris, choisissez Annoter et Règle.
    3. Déplacez la souris vers l’ILM et cliquez sur le bouton gauche. Intitulez la mesure RT et cochez les cases afficher le titre et afficher la longueur. De cette façon, l’épaisseur de la rétine (RT) sera mesurée et la mesure sera indiquée en μm. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 2 et à la figure 3.
    4. À l’aide de la règle, mesurez l’épaisseur de chaque couche rétinienne, y compris l’ONL, l’OPL, l’INL et l’IPL, et étiquetez-les. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 4 et à la figure 5.
    5. Pour compter le nombre de cellules à l’intérieur du GCL, établissez une longueur prédéterminée de la rétine. Par exemple, pour la rétine de la souris, utilisez une section de 500 μm, et pour la rétine du rat, utilisez cinq sections de 100 μm.
    6. À l’aide de la règle, mesurez la distance choisie le long du GCL. Appuyez sur le bouton droit de la souris et sélectionnez Annoter > Enregistré > 1x RBC. Cliquez sur chaque cellule identifiée comme un corps rond et coloré à l’hématoxyline le long du GCL sur la longueur prédéterminée de la rétine. Comptez le nombre de cellules encerclées. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 6 et à la figure 7.
    7. Après avoir analysé trois sections consécutives, dessinez la moyenne de toutes les mesures.

Résultats

Grâce à l’utilisation du protocole présenté, l’anatomie et la morphologie de structures spécifiques du globe oculaire peuvent être évaluées en détail. Notre équipe se concentre sur la recherche des mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence dans les troubles rétiniens, tels que le glaucome, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie hypertensive. Pour évaluer les caractéristiques de la neurodégénérescence de la rétine, nous avons évalué le RT (globe oculaire de souris -Figure 2, globe oculaire de rat -Figure 3), ONL, OPL, INL et IPL (globe oculaire de souris -Figure 4, globe oculaire de rat -Figure 5), et le nombre de cellules du GCL (globe oculaire de souris -Figure 6, globe oculaire de rat -Figure 7). On s’attend à ce que la RT et les cellules de la GCL soient les plus élevées dans la rétine centrale et les plus faibles à la périphérie. En coupant le globe oculaire au niveau de la pupille, des coupes transversales à travers la rétine centrale (au pôle postérieur du globe oculaire) et périphérique (près du corps ciliaire) sont réalisées sur une seule lame.

Bien que le comptage des cellules GCL puisse être considéré comme assez objectif, le biais causé par une section asymétrique peut influencer les résultats de la mesure des couches rétiniennes spécifiques. Pour éviter les biais, les mesures peuvent être présentées sous la forme du rapport entre l’épaisseur d’une couche donnée et la valeur RT : ONL/RT, OPL/RT, INL/RT et IPL/RT.

Schéma de l’anatomie de l’œil montrant les parties étiquetées : rétine, sclère, lentille, cornée, nerf optique, macula.
Figure 1 : Anatomie du globe oculaire. Coupe transversale sagittale d’un globe oculaire avec l’étiquetage de ses plus grandes structures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Image microscopique d’une coupe transversale de la rétine, montrant les couches de tissus, mesure de l’épaisseur 125 μm.
Figure 2 : Épaisseur de la rétine chez une souris. Mesure de l’épaisseur rétinienne (RT) de la membrane limitante externe à la membrane limitante interne au point le plus large, marqué par la barre verte. Globe oculaire de souris (souche : C57Bl/6, âge : 44 semaines). La barre d’échelle dans le coin gauche indique la longueur de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Coupe histologique montrant des couches rétiniennes de 53,4 μm d’épaisseur ; Image microscopique, étude tissulaire.
Figure 3 : Épaisseur de la rétine chez un rat. Mesure de l’épaisseur rétinienne (RT) de la membrane limitante externe à la membrane limitante interne au point le plus large, marqué par la barre verte. Globe oculaire de rat (souche : Lewis, âge : 16 semaines). La barre d’échelle dans le coin gauche indique la longueur de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Schéma en coupe transversale du tissu rétinien ; couches mesurées : IPL, INL, OPL, ONL ; Analyse microscopique.
Figure 4 : Couches rétiniennes chez une souris. Mesure de l’épaisseur des différentes couches de la rétine : couche nucléaire externe (ONL), couche plexiforme externe (OPL), couche nucléaire interne (INL) et couche plexiforme interne (IPL), marquées de barres vertes. Globe oculaire de souris (souche : C57Bl/6, âge : 44 semaines). La barre d’échelle dans le coin gauche indique la longueur de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Image microscope de la coupe efficace de la rétine avec couches marquées : OPL, ONL, IPL, INL ; Barre d’échelle 100 μm.
Figure 5 : Couches rétiniennes chez un rat. Mesure de l’épaisseur des différentes couches de la rétine : couche nucléaire externe (ONL), couche plexiforme externe (OPL), couche nucléaire interne (INL) et couche plexiforme interne (IPL), marquées de barres vertes. Globe oculaire de rat (souche : Lewis, âge : 16 semaines). La barre d’échelle dans le coin gauche indique la longueur de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Coupe histologique montrant la structure cellulaire en couches, image microscope, analyse tissulaire, échelle de 500 μm.
Figure 6 : Comptage des cellules de la couche de cellules ganglionnaires chez une souris. Méthode de comptage des cellules de la couche de cellules ganglionnaires (GCL) le long de la rétine sur une longueur de 500 μm. Les corps unicellulaires ont été identifiés comme des corps ronds, colorés à l’hématoxyline, situés dans la couche de cellules ganglionnaires. Les cellules sont marquées de cercles noirs. Globe oculaire de souris (souche : DBA/2, âge : 44 semaines). La barre d’échelle dans le coin gauche indique la longueur de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Lame d’histologie, coupe transversale de la rétine ; couches de tissus visibles ; Examen microscopique, échelle 100 μm.
Figure 7 : Comptage des cellules de la couche de cellules ganglionnaires chez un rat. Méthode de comptage des cellules de la couche de cellules ganglionnaires (GCL) le long de la rétine sur une longueur de 100 μm. Les corps unicellulaires ont été identifiés comme des corps ronds, colorés à l’hématoxyline, situés dans la couche de cellules ganglionnaires. Les cellules sont marquées de cercles noirs. Globe oculaire de rat (souche : Lewis, âge : 16 semaines). La barre d’échelle dans le coin gauche indique la longueur de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

L’examen histologique du globe oculaire de souris et de rat est un outil puissant dans le domaine de l’ophtalmologie expérimentale. Il peut fournir de nouvelles informations sur les changements dans les structures oculaires au cours des maladies ophtalmiques, qui ne seraient pas observés autrement en milieu clinique. Les protocoles décrits présentent une méthode simple pour effectuer une analyse histologique de la rétine. Les subtilités de la procédure nécessaire au traitement des tissus antérieurs, tels que la cornée, ne sont pas décrites ici.

Dans l’étude présentée, l’énucléation a été réalisée après l’euthanasie des animaux car, outre les globes oculaires, d’autres tissus (sang, reins) ont été prélevés à des fins de recherche. Cependant, l’énucléation peut également être réalisée sur des animaux vivants sous anesthésie. Wilding et al. ont décrit la procédure14, et nous aimerions renvoyer les lecteurs à ce travail pour voir des photos de la procédure d’énucléation.

Bien que les protocoles de préparation des lames de souris et de rat soient similaires, la principale différence entre les yeux de souris et de rat à prendre en compte lors de la préparation des lames est leur taille. Les globes oculaires des rats ont un volume 8 à 10 fois supérieur à celui des souris, tandis que la longueur axiale moyenne d’un globe oculaire de souris est d’environ 3,2 mm et que la longueur axiale d’un globe oculaire de rat oscille généralement autour de 6,91 mm15,16. Il est donc plus facile de couper les globes oculaires des rats en deux pour une meilleure pénétration du réactif dans les tissus pendant le traitement. De plus, le temps nécessaire à la pénétration du réactif dans le tissu du rat est plus long que pour les globes oculaires de souris. Lors de la coupe des globes oculaires de rat en deux, il est important d’utiliser une lame tranchante, car le cristallin ferme et gelé peut s’avérer être un obstacle.

Un autre point qui mérite d’être discuté est la fixation des tissus après la récolte des animaux. Dans le protocole présenté, les globes oculaires, après énucléation, ont été fixés avec du PFA et immergés dans des solutions de saccharose. Le saccharose agit comme un cryoprotecteur, car il protège les cellules des gros tissus des dommages causés par les cristaux de glace qui se forment lors de la congélation17. La congélation du tissu permet aux chercheurs de le conserver plus longtemps et de l’utiliser pour divers examens à l’avenir, notamment une analyse histopathologique avec un microtome (comme présenté), une analyse histopathologique avec un cryotome et un immunomarquage pour l’évaluation à l’aide de la microscopie confocale. Par exemple, lors de la coupe d’un globe oculaire de rat en deux (étape 2.4.1), si la coupe est effectuée efficacement et rapidement (dans les 5 à 10 s) et que l’œil n’a pas le temps de décongeler, une moitié du globe oculaire peut être utilisée pour l’histopathologie et une autre peut être remise au congélateur pour un immunomarquage ultérieur. Nous ne recommandons pas d’effectuer un immunomarquage sur des tissus précédemment infiltrés avec de la paraffine en raison de changements possibles dans la conformation des épitopes protéiques après la fixation de la paraffine. Cependant, si un groupe de chercheurs envisage uniquement d’effectuer une analyse histopathologique à l’aide d’un microtome, une méthode standard plus simple de fixation des tissus pour l’enrobage de paraffine peut être utilisée - par exemple, au lieu d’effectuer les étapes 1.2.1 à 1.4.1 pour les souris ou les étapes 2.2.1 à 2.4.2 pour les rats, placez les tissus dans une solution à 10 % de PFA pendant 24 h, puis stockez-les dans du PBS à 4 °C jusqu’au traitement. Le saccharose ne sera alors pas nécessaire comme cryoprotecteur, car les tissus ne seront pas congelés. En utilisant cette méthode proposée, le processus de congélation sera évité, ce qui peut s’avérer bénéfique et conduire à l’obtention de lames de meilleure qualité. La congélation des globes oculaires, bien qu’elle offre aux chercheurs plus de liberté dans le choix du moment pour effectuer l’examen histopathologique, est une étape qui peut potentiellement diminuer la qualité de l’échantillon et entraîner un décollement de la rétine. Cependant, il ne faut pas oublier que si les tissus sont stockés à 4 °C, leur stabilité biologique sera plus courte et que les tissus doivent être analysés dans les 4 semaines. De plus, lorsque vous travaillez avec des globes oculaires de rat, l’étape 2.4.1 (couper les globes oculaires en deux) sera beaucoup plus difficile à effectuer sur un globe oculaire non gelé.

La méthodologie présentée a été élaborée sur la base de la méthodologie décrite par Chai et al.18, Igarashi et al.19, Zhang et al.20 et Dorfman et al.21, sur l’expérience personnelle et une méthode d’essais et d’erreurs. La méthode de mesure de l’épaisseur de la rétine et des couches individuelles est décrite sur la base de la méthodologie présentée par Chai et al.16 et Barber et al.18,22. La méthode de comptage rétinien RGC a été développée à partir d’une revue des travaux de Chai et al.16, Zhang et al.18, Steinle et al.19 et Dorfman et al.18,20,21,23. Dans l’ensemble, la préparation de lames histopathologiques de globes oculaires diffère d’une préparation standard de lames de tissu fixées au formol et incluses dans de la paraffine, car le globe oculaire est sphérique et, par conséquent, plus difficile à manipuler, à couper et à sectionner. De plus, la sclérotique est une barrière pour l’infiltration du réactif dans les tissus. Lors de la préparation de lames histologiques de globes oculaires, il faut travailler plus délicatement et de manière précise tout en faisant attention à ne pas endommager les structures délicates de la partie interne du globe oculaire. Les modifications de ce protocole pourraient inclure l’utilisation de la technique d’enrobage de méthacrylate au lieu de l’enrobage de paraffine, ce qui pourrait donner de meilleurs résultats morphologiques. Cependant, très peu de chercheurs ont utilisé cette méthode pour l’évaluation de la rétine24,25.

Ce protocole n’est pas exempt de préjugés. Le plus gros problème auquel notre équipe a été confrontée était la déchirure et le décollement de la rétine. La rétine des globes oculaires de rat était particulièrement sujette à la déchirure, car ils devaient être coupés en deux avant la préparation des lames, et donc la rétine était plus sujette aux dommages. En raison du décollement de la rétine, ce protocole ne peut pas être utilisé pour l’évaluation de la choroïde, de l’épithélium pigmentaire rétinien ou de la couche du segment photorécepteur. Cependant, notre équipe pense que ce protocole peut être utilisé pour évaluer la rétine interne (de l’ILM à l’ELM). Pour minimiser la quantité de déchirure et de décollement de la rétine, chaque étape du protocole doit être effectuée avec soin, lentement et avec des mouvements précis.

L’analyse histopathologique de la rétine ne fait pas partie du diagnostic humain standard, mais est une méthode largement utilisée dans la recherche préclinique. Les résultats de l’évaluation histopathologique de la rétine dans les études précliniques peuvent être mis en relation et discutés avec les résultats de la tomographie optique cohérente (OCT)26, qui est un examen qui montre une coupe transversale à travers la rétine lors d’un examen in vivo qui peut être effectué dans un cadre clinique, chez l’homme dans des essais cliniques. L’examen de l’OCT est toutefois moins détaillé. Par conséquent, les informations que l’on peut tirer des études histologiques menées dans le cadre de la recherche préclinique sont irremplaçables et nécessaires au développement des connaissances médicales.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les travaux, y compris les rats, ont été financés dans le cadre du projet TIME 2 MUW - l’excellence de l’enseignement comme une opportunité pour le développement de l’Université de médecine de Varsovie cofinancé par le Fonds social européen dans le cadre du programme opérationnel Développement de l’éducation à la connaissance pour 2014-2020, le numéro de la convention de cofinancement : POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. Les travaux, y compris sur des souris, ont été réalisés dans le cadre d’un projet mis en œuvre dans les années 2020 à 2022, financé par une subvention pour la science obtenue par l’Université de médecine de Varsovie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acétone  ;Chempur  ;
Dumont Pince à épiler #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm TipsWorld Precision Instruments14095petite, pince microchirurgicale
EosinMar-Four4P.05.2001/LSolution aqueuse
Alcool éthylique 96 %Chempur  ;CH.ET. AL.96 %CZDA.
Alcool éthylique 99,9 %Chempur  ;Ch. ETYL. ALK.99,9 %BWUtiliser pour préparer des solutions à 70 % et 80 % d’EtOH
Glacier - 86 ° ; C Congélateur ultra-basse température NU-9483ENuAire13027D0034Température de congélation - 80 ° ; C
Lames en verreMar-FourMI.15.01673Lames en verre dépoli avec un champ mat double face pour la description
Leica CV5030 Couvre-croûte en verre entièrement automatiséLeica Biosystems  ;14,04,78,80,101Scelleuse de lames automatisée  ;
HématoxylineMayer Chempur  ;
Moules à base métallique 15 mm x 15 mmLeica Biosystems.
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtome
Lames de rasoir MicrotomeMar-FourHI. N.35Angle de coupe 35° ;
Cassette de biopsie Micro-TwinMar-FourLN.13874550
Processeur de tissus hybride à micro-ondesMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems  ;Colorateur de lames automatisé  ;
NanoZoomer 2.0-HT Scanner de lamesHamamatsuC9600Scanner de lames histopathologiques
NDP.view2 Logiciel de visualisation d’imagesHamamatsuU12388-01Logiciel de visualisation
d’images Paraffine Pathowax PlusMar-Four4P. PWP.010Température de fusion 56 ° ; C - 58 ° ; C
ParaformaldéhydeSigma - Aldrich441244-1KGPréparer une solution à 4 % dans des comprimés PBS
PBSMerck Millipore524650-1EAUtiliser pour préparer une solution de solution saline tampon phosphate, selon les instructions du fabricant
Percer Tubes de microcentrifugation, 1,5 mLThermo Scientific69715
Réfrigérateur-congélateur EN14000AWElectrolux925032562-00Réfrigération 4 ° ; C
Lame de scalpelSwann-MortonT.OST. SKAL00.024
SaccharoseChempur  ;
Ciseaux à ressort SuperCut, 12,5 cm, CurvedWorld Precision Instruments501925petits ciseaux microchirurgicaux incurvés
Ruban pour soudeuses automatiquesMar-Four KP-3020/SMRH001
XyleneChempur  ;Ch. KSYL.5l.METAL.OP  ;
111024800CH de 1246874023803081427720906

Références

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