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Article de méthode

MiR-15a exosomal dérivé de la déchirure comme nouvel outil diagnostique pour la rétinopathie diabétique

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DOI :

10.3791/66687

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30 décembre 2025

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1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un protocole pour la collecte et la détection de miR-15a à partir de déchirures comme nouvel outil diagnostique pour la rétinopathie diabétique.

Résumé

La rétinopathie diabétique (DR) est une complication majeure du diabète sucré, touchant un pourcentage significatif de la population diabétique. Un diagnostic précoce et une intervention sont essentiels pour prévenir une perte de vision irréversible. Les méthodes de diagnostic actuelles, bien qu’efficaces, présentent des limites. Le miARN, un petit ARN non codant qui inhibe la stabilité et/ou la traduction d’un ARNm en se liant aux régions non traduites 3' (3'-UTR) des ARNm cibles, est de plus en plus reconnu comme étant significativement associé au diabète et peut être obtenu par déchirure. Cette étude a étudié le potentiel du miR-15a exosomal dérivé du liquide lacrymal comme nouveau marqueur diagnostique pour la DR. Des échantillons lacrymaux ont été prélevés sur 135 patients diabétiques (36 atteints de rétinopathie diabétique [DR] et 50 sans DR) et 49 témoins en bonne santé. Les exosomes ont été isolés et les niveaux d’expression du miR-15a exosomal ont été mesurés à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR). Les résultats ont montré que l’expression exosomale de miR-15a était modifiée chez les patients diabétiques et atteints de RD par rapport aux individus en bonne santé. Ces résultats indiquent que le miR-15a exosomal dérivé du liquide lacrymal pourrait jouer un rôle dans les mécanismes moléculaires sous-jacents au diabète et à ses complications. De plus, il présente un potentiel comme biomarqueur diagnostique non invasif et fiable pour la rétinopathie diabétique, offrant une sensibilité et une spécificité élevées.

Introduction

La rétinopathie diabétique (DR) est l’une des complications microvasculaires les plus marquantes du diabète, menaçant la vision de millions de personnes à travers le monde. La prévalence mondiale de la RD d’après les données démographiques de l’IDP Atlas 2019 a été estimée à 22,7 % de l’ensemble de la population diabétique mondiale, le nombre de nouveaux cas étant en constante augmentation, notamment dans les pays développés et endéveloppement 1. Cliniquement, la DR se caractérise par une DR précoce ou rétinopathie diabétique non proliférative (NPDR), une DR avancée ou rétinopathie diabétique proliférative (RDP), ainsi que la présence d’œdème maculaire. Une perméabilité vasculaire accrue et un blocage capillaire sont deux changements pathologiques courants observés dans la NPDR, et une néovascularisation anormale de l’iris, de la macula, du disque optique ou de la rétine est observée dans le cas dePDR 2,3. La progression vers la RDP, qui pourrait potentiellement entraîner une hémorragie vitrée et un décollement de la rétine, peut entraîner une déficience visuelleimportante 3. Dans tous les cas, des modifications pathologiques peuvent être détectées par funduscopie ou examen photographique du fond d’œil par des ophtalmologistesformés 4. En utilisant la méthode standard de la photographie du fond d’œil, la rétinopathie diabétique peut être détectée avec une sensibilité de 78 % à 96 % et une spécificité de 86 % à 97% 5. Cependant, cette méthode ne détecte qu’une fois que des dommages à la rétine ont été affectés. Il existe un besoin non comblé de détection précoce de la RD avant l’apparition de signes rétiniens cliniquement visibles, tels que des hémorragies rétiniennes à blot, des microanévrismes, des exsudats et de la prolifération de nouveaux vaisseaux.

L’avancée des outils moléculaires a conduit à la découverte des exosomes comme outil potentiel de diagnostic pour diverses maladies, notamment le cancer et les maladiescardiovasculaires 6,7. Les exosomes sont des particules de taille nanométrique liées par une membrane lipidique bicouchée sécrétée par la plupart des cellules dans leur espace vésiculaire extracellulaire (EV). Ces exosomes peuvent être transportés par des biofluides tels que le sang, les larmes, la salive et l’urine, ce qui les rend facilement accessibles pour des procédures diagnostiques non invasives oumini-invasives 8. Ils portent divers marqueurs cellulaires d’origine, notamment des protéines, des lipides et des acides nucléiques. Un intérêt particulier sont les petits ARN non codants transportés à l’intérieur des VE. Bien que ces ARN ne soient pas codés pour les protéines, ils jouent un rôle clé dans la régulation des gènes et ont été impliqués dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, notamment dans les cellules β pancréatiques, qui sont très importantes dans le développement dudiabète 9,10.

Plus précisément, il a été démontré que miR-15a est fortement associé au développement du diabète, principalement par la régulation de la production d’insuline et des fonctions des cellules bêtapancréatiques 11. Notre groupe a récemment démontré que miR-15a est altéré dans le plasma de la rétinopathie diabétique. De plus, il a également été démontré que le miR-15a est sécrété par les cellules bêta pancréatiques, et il voyage dans le sang jusqu’à larétine 12. Le liquide lacrymal est considéré comme un fluide facilement accessible, facilement accessible à l’œil de manière non invasive et économique13. Il contient un mélange de diverses protéines, lipides, électrolytes et autres molécules, qui reflète l’état physiologique de la surface oculaire et des tissus environnants, y compris larétine 14. Un nombre plus élevé de miARN ont été détectés dans le liquide lacrymal que dans la solution sérique et aqueused’humeur 15,16. La composition des larmes change en réponse à diverses affections systémiques, y compris lediabète 17. En fait, l’analyse du liquide lacrymal a démontré un potentiel prometteur pour la surveillance et le diagnostic d’autres maladies non liées aux yeux telles que la sclérose en plaques et le cancer dusein 18,19. Avec le lien direct de la rétinopathie diabétique à l’œil, il serait plus pertinent de rechercher les propriétés diagnostiques potentielles du liquide lacrymal dans cette maladie. Des niveaux d’IL-1RA, IL-8, IL-6 et TNF-α dans les liquides lacrymaux des patients atteints de rétinopathie diabétique ont été observés en subissant des modifications, qui varient également selon la gravité de lamaladie 20,21. Comparée à l’examen traditionnel de la funduscopie, l’analyse du liquide lacrymal pour la rétinopathie diabétique offre des avantages potentiels en termes d’accessibilité, de non-invasivité et de spécificité, et permet une détection précoce avant l’apparition de lamaladie 22.

Ainsi, l’objectif principal de cette étude est d’étudier le potentiel du miR-15a exosomal dérivé du liquide lacrymal comme nouveau marqueur diagnostique de la rétinopathie diabétique par isolement et quantification des miARN à partir de liquides lacrymaux chez la population diabétique souffrant de rétinopathie. Dans ce contexte, une nouvelle méthode de détection de la rétinopathie diabétique serait instaurée par un dépistage du liquide lacrymal, détectable même avant l’apparition des complications rétiniennes, permettant des mesures préventives ou thérapeutiques précoces.

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Protocole

L’étude a été menée avec l’approbation du Comité d’éthique de la recherche médicale de l’Université de Malaya Medical Centre (numéro de référence : 20165-2446). Le consentement écrit a été obtenu de tous les sujets humains avant le recrutement. Au total, 135 sujets ont été inclus parmi les patients fréquentant la clinique d’ophtalmologie de l’Universiti Malaya Medical Centre (UMMC), Kuala Lumpur. Les critères d’inclusion incluaient les patients ayant reçu des services sous l’UMMC et âgés de 20 à 80 ans. Les patients ayant suivi un traitement actif à l’insuline, ayant des antécédents de traitement laser ou anti-VEGF au cours des 3 derniers mois, ou sous antiplaquettes ou anticoagulants réguliers ont été exclus de l’étude. Les sujets ont ensuite été divisés en trois groupes : (1) témoins sains (témoin), (2) diabétiques sans rétinopathie (DM sans DR), et (3) diabétique avec rétinopathie (DR). Un résumé du protocole est fourni à la Figure 1. Les détails des réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

figure-protocol-1
Figure 1 : Aperçu du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Préparation des matériaux    

  1. Installez un ensemble de pansement stérile contenant deux pinces, six boules de coton, quatre compresses à gaze, un plateau et un sac de bio-danger.
  2. Verser 5 mL de solution d’irrigation au chlorure de sodium à 0,9 % dans un plateau.
  3. Ouvrez un paquet de lingettes nettoyantes pour les paupières et posez-les sur le champ stérile.
  4. Préparez un tube contenant 250 μL de solution de conservateur.
  5. Pliez une bande de Schirmer au niveau du coin tout en étant encore dans son emballage avant de placer la bande stérile sur le champ stérile.
  6. Mettez des gants chirurgicaux de manière aseptique.
  7. À l’aide d’une pince stérile, humidifiez les boules de coton avec 0,9 % de solution d’irrigation stérile au chlorure de sodium.

2. Préparation des sujets humains    

  1. Laissez le sujet s’asseoir confortablement et demandez à fermer les yeux.
  2. Essuyez la peau périorbitaire quatre fois à l’aide de boules de coton trempées dans une solution d’irrigation.
  3. Essuyez la peau périorbitaire avec une lingette nettoyante pour les paupières.

3. Collecte du liquide lacrymal humain

  1. Collectez les fluides lacrymaux à l’aide de la bande de Schirmers placée au niveau du fornix temporal inférieur.
  2. En plaçant la bande partiellement pliée sur l’œil droit, demandez au sujet de regarder vers la gauche. Baissez le couvercle inférieur pour exposer le fornix inférieur.
  3. À l’aide d’une paire de pinces stériles, placez une bande de Schirmer sur les deux tiers externes du fornix conjonctival inférieur. Évitez de laisser la bande toucher la peau afin d’éviter la contamination de l’échantillon par de la sueur ou d’autres matériaux sur la peau.
  4. Placez une compresse en gaze sous la bande pour éviter le contact cutané.
  5. Laissez les déchirures être absorbées dans la bande jusqu’à la marque des 20 mm ou un maximum de 5 minutes, selon ce qui arrive en premier.
  6. Si le seuil de 20 mm n’est pas atteint, documentez le niveau de déchirures en fonction des marquages afin de permettre la standardisation du volume du fluide lacrymal.
  7. À l’aide d’une pince stérile, retirez soigneusement la bande de Schirmer et placez la bande dans un tube contenant une solution de solution de solution tampon phosphate (PBS).
  8. Placez le tube dans une glacière pour le transporter au laboratoire.
  9. Nettoyez la surface périorbitaire en essuyant toute solution résiduelle sur la peau.

4. Prétraitement des échantillons de larmes    

  1. Vortex, le tube contenant la bande de Schirmer trempé dans du PBS pendant 5 minutes à température ambiante.
  2. Agitez le tube sur une bascule pendant 5 minutes à température ambiante.
  3. Centrifugez le tube à 2000 x g pendant 15 minutes à 4 °C.
  4. Transférez la solution dans un nouveau tube, marquez et gardez-la à -80 °C jusqu’au traitement en aval.
  5. Jetez la bande restante.

5. Isolement des exosomes

REMARQUE : L’isolation de l’ARN est réalisée à l’aide d’un kit commercialement disponible selon le protocole du fabricant (voir Tableau des matériaux).

  1. Décongelez la solution lacrymale sur de la glace pendant 10 minutes.
  2. Équilibrez la colonne de rotation pendant 15 minutes à température ambiante avant utilisation.
  3. Retirez la sortie inférieure de la colonne et placez-la sur la plaque de collecte des déchets fournie.
  4. Retirez le tapis d’étanchéité supérieur et laissez passer le tampon de stockage à travers la colonne par force gravitationnelle.
  5. Ajoutez 250 μL de PBS et laissez-le passer à travers la colonne.
  6. Répétez l’étape 5.5.
  7. Appliquez un échantillon de 110 μL en haut de chaque colonne et laissez l’échantillon entrer dans la colonne.
  8. Transférez la colonne sur une plaque de collecte d’échantillons fournie.
  9. Ajoutez 100 μL de PBS et laissez-le passer à travers la colonne jusqu’à la plaque de prélèvement.
  10. Transférez la colonne sur la plaque de collecte des déchets.
  11. Ajoutez 4 PBS de 200 μL à la colonne et laissez-la pénétrer pour éliminer la fraction de protéines libres lors de la première charge.
  12. Ajoutez 110 μL d’échantillon dans la colonne. Autorisez l’entrée dans la colonne.
  13. Placez la colonne sur une plaque de collecte d’échantillons. Ajoutez 100 μL de PBS et laissez-le passer à travers la colonne.
  14. Centrifugez brièvement la plaque de collecte de l’échantillon à 100 x g pendant 30 secondes. Les exosomes isolés sont désormais prêts pour l’isolement de l’ARN.

6. Isolation de l’ARN

REMARQUE : L’isolation de l’ARN est réalisée à l’aide d’un kit commercialement disponible selon le protocole du fabricant (voir Tableau des matériaux).

  1. Sujet 200 μL des exosomes isolés à l’isolation d’ARN.
  2. Ajoutez 60 μL de tampon de lyse aux exosomes isolés. Vortex pendant 5 s.
  3. Incubez à température ambiante pendant 3 minutes.
  4. Ajoutez 20 μL de tampon inhibiteur de précipitation, utilisez un vortex pendant 20 s, puis incubez à température ambiante pendant 3 minutes.
  5. Centrifugez à 12 000 x g pendant 3 minutes à température ambiante.
  6. Transférez le surnageant transparent et incolore dans un nouveau tube.
  7. Ajoutez 1 volume d’isopropanol.
  8. Vortex pendant 5 secondes et transférez la solution dans la mini colonne de spin fournie dans le kit.
  9. Centrifugez à température ambiante pendant 15 s à 8000 x g. Écartez le flux à travers.
  10. Lavez la colonne avec 700 μL de tampon de lavage RWT.
  11. Centrifugeuse pendant 15 s à 8000 x g. Abandonnez le flowthrough.
  12. Lavez la colonne avec 500 μL de tampon de lavage RPE.
  13. Centrifugeuse pendant 15 s à 8000 x g. Abandonnez le flowthrough.
  14. Ajoutez 500 μL d’éthanol à 80 % à la mini colonne de spin de l’échantillon.
  15. Centrifugez pendant 2 minutes à 8000 x g. Jetez le flux et le tube de collecte.
  16. Placez la mini colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 2 mL.
  17. Centrifugez la colonne et le tube à 18 000 x g pendant 5 minutes. Éliminez le flux et le tube de collecte.
  18. Placez la mini colonne de spin dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajoutez 15 μL d’eau sans RNase au centre de la membrane de la colonne de spin.
  19. Incubez pendant 3 minutes à température ambiante.
  20. Centrifugez à 18 000 x g pendant 1 minute pour éluer l’ARN. L’ARN est prêt pour le traitement en aval.
  21. Effectuer une analyse de suivi des nanoparticules pour le contrôle qualité et la vérification du rendement ARN.

7. Synthèse d’ADNc

  1. Effectuer la synthèse d’ADNc à l’aide de kits disponibles dans le commerce selon les protocoles du fabricant (voir Tableau des matériaux).
  2. Préparez le mélange maître selon le tableau 1 dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
  3. Mélangez la solution en pipettant de haut en bas.
  4. Pipeter 5,1 μL du mélange maître dans des tubes PCR de 0,1 μL.
  5. Ajoutez 9,9 μL d’échantillon au tube alloué contenant le mix maître.
  6. Placez les tubes PCR dans un thermocycleur et faites fonctionner selon le tableau 2.
    REMARQUE : L’ADNc est prêt pour une analyse plus approfondie.
ComposantVolume/réaction
Tampon RT 10x1,5 μL
Mélange 100M dNTP0,15 μL
Inhibiteur de l’ARNase (200U/μL)0,19 μL
Enzyme RT multiscribe (50U/μl)1 μl
Amorce RT 20x0,75 μL
Eau libre d’ARNase1,51 μL
Exemple9,9 μL
Total Volume15 μL

Tableau 1 : Préparation du mélange maître PCR utilisé pour la synthèse d’ADNc à partir de l’ARN isolé.

PasTempératureDurée
Transcription inversée16 °C30 min
42 °C30 min
Arrête85 °C5 min
Tiens4 °C

Tableau 2 : Conditions de thermocyclage pour la synthèse de l’ADNc.

8. PCR numérique à gouttelettes

REMARQUE : La PCR numérique par gouttelettes (ddPCR) est réalisée à l’aide de kits disponibles dans le commerce suivant les protocoles du fabricant (voir Tableau des matériaux).

  1. Préparez le mélange maître pour ddPCR dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL selon le tableau 3.
  2. Pipette 19,8 μL de mélange maître dans des tubes PCR de 0,1 μL. Ajoutez 2,2 μL d’échantillons et mélangez bien en pipettant le mélange de haut en bas pendant 10 fois.
  3. Transférez 20 μL du mélange d’échantillon dans la voie d’échantillonnage de la cartouche ddPCR.
  4. Ajoutez 50 μL d’huile dans la voie d’huile de la cartouche.
  5. Fixez un joint sur la cartouche à l’aide du crochet sur la plaque.
  6. Placez la cartouche dans la machine à générer des goutteles. Un bruit de clic indique une insertion correcte de la cartouche dans la machine de génération de gouttelettes.
  7. Transférez soigneusement toutes les gouttelettes générées dans les puits d’une plaque à 96 puits. Ajoutez au moins un puits sans puits de contrôle de gabarit comme contrôle négatif.
  8. Scellez la plaque à l’aide d’une feuille d’aluminium perforable dans une machine à sceller des plaques (voir Tableau des matériaux).
  9. Placez la plaque dans un thermocycleur et faites fonctionner selon le tableau 4.
  10. Transférez la plaque dans la machine à lire des gouttelettes pour compter les gouttelettes positives et négatives.
  11. Quantifiez le nombre de copies/mL en utilisant le nombre de copie/valeur de 20 μL générés lors de la séquence.
ComposantVolume/réaction
2x ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP)10 μL
Amorces/sondes 20x1 μL
Exemple7 μL
Eau libre d’ARNase2 μL
Total Volume20 μL

Tableau 3 : Préparation du master mix PCR utilisé pour la ddPCR.

PasTempératureDuréeRampeCycle
Activation enzymatique95 °C10 min~2 °C/ s pour chaque étape1
Dénaturation94 °C30 s40
Recuissage60 °C1 min40
Désactivation enzymatique98 °C10 min1
Tiens4 °CN/AN/A

Tableau 4 : Conditions de thermocyclage pour la ddPCR.

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Résultats

Courbe standard
Une courbe standard a été créée pour déterminer le volume exact de déchirures prélevées sur chaque patient. En gros, différents volumes de conservateurs entre 3 μL et 25 μL ont été exposés aux bandes de Schirmer. Et la distance de la zone humide sur le Schirmer a été observée. La procédure a été répétée trois fois pour chaque intervention, et la lecture moyenne a été calculée. Une courbe standard du volume de larmes collectées par rapport à la distance...

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Discussion

L’examen de la funduscopie, la tomographie par cohérence optique et l’angiographie à la fluorescéine sont les techniques de détection actuellement disponibles pour la rétinopathie diabétique. Les trois techniques sont souvent utilisées ensemble pour fournir une évaluation complète de diverses maladies rétiniennes et choroïdiennes. La funduscopie est un examen clinique réalisé de manière routinière lors de l’évaluation de la rétinopathie diabétique. Cette méthode est réalisée par des opht...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par l’Alcon Research Institute (IF011-2020) et la subvention postdoctorale FOM UMSC Care 2021.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % v/v chlorure de sodiumAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x solution tampon phosphateThermo Fisher Scientific10010-023
Applied Biosystems  ; Kit de transcription inverse des microARN TaqManBiosystèmes appliqués4366596
ddPCR Supermix pour sondes (pas de dUTP)Laboratoires BioRad1863024
Plaques ddPCR à 96 puitsLaboratoires BioRad12001925
Cartouches DG8Laboratoires BioRad1864008
Joints DG8Laboratoires BioRad1863009
Huile de génération de gouttelettes pour les sondesLaboratoires BioRad1863005
Kit d’isolation d’exosomes Exospin-96Systèmes de guidage cellulaireEX07-96
Kit avancé de sérum/plasma miRNeasyQiagen  ; 217204
Scellant de plaques PCR PX1Laboratoires BioRad1814000
Système de PCR numérique à gouttelettes QX100Laboratoires BioRadQX100
QXDx Générateur de gouttelettes   ;Laboratoires BioRad12001049
Bande de SchirmerOptitechSCH-100
Cycleur thermique T100Laboratoires BioRad1861096
Testage microARN Taqman MTOMED 20 (ID du test : 000389)Biosystèmes appliqués4440887Séquence de cible : UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

Références

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