PyOKR : une méthode semi-automatisée pour quantifier la capacité de suivi du réflexe optocinétique

Résumé

Nous décrivons ici PyOKR, une méthode d’analyse quantitative semi-automatisée qui mesure directement les mouvements oculaires résultant des réponses visuelles au mouvement d’une image bidimensionnelle. Une interface utilisateur et un algorithme d’analyse basés sur Python permettent un débit plus élevé et des mesures quantitatives plus précises des paramètres de suivi oculaire que les méthodes précédentes.

Résumé

L’étude des réponses comportementales aux stimuli visuels est un élément clé de la compréhension du fonctionnement du système visuel. Une réponse notable est le réflexe optocinétique (OKR), un comportement inné hautement conservé nécessaire à la stabilisation de l’image sur la rétine. L’OKR fournit une lecture robuste de la capacité de suivi d’image et a été largement étudié pour comprendre les circuits et la fonction du système visuel chez les animaux de différents antécédents génétiques. L’OKR se compose de deux phases : une phase de suivi lente lorsque l’œil suit un stimulus jusqu’au bord du plan visuel et une phase rapide compensatoire qui réinitialise la position de l’œil sur l’orbite. Les méthodes précédentes de suivi de la quantification des gains, bien que fiables, nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et peuvent être subjectives ou dérivées arbitrairement. Pour obtenir une quantification plus rapide et reproductible de la capacité de suivi oculaire, nous avons développé un nouveau programme d’analyse semi-automatisé, PyOKR, qui permet de quantifier le mouvement bidimensionnel du suivi oculaire en réponse à tout stimulus directionnel, en plus d’être adaptable à tout type d’équipement de vidéo-oculographie. Cette méthode permet le filtrage automatisé, la sélection des phases de suivi lent, la modélisation des vecteurs oculaires verticaux et horizontaux, la quantification des gains de mouvement oculaire par rapport à la vitesse du stimulus et l’organisation des données résultantes dans une feuille de calcul utilisable pour des comparaisons statistiques et graphiques. Ce pipeline d’analyse quantitative et rationalisé, facilement accessible via l’importation PyPI, fournit une mesure rapide et directe des réponses OKR, facilitant ainsi l’étude des réponses comportementales visuelles.

Introduction

La stabilisation d’image repose sur des réponses oculomotrices précises pour compenser le flux optique global qui se produit pendant l’auto-mouvement. Cette stabilisation est principalement entraînée par deux réponses motrices : le réflexe optocinétique (OKR) et le réflexe vestibulo-oculaire (VOR)^1,2,3. Le mouvement global lent à travers la rétine induit l’OKR, qui provoque une rotation réflexe des yeux dans la direction correspondante pour stabiliser l’image ^1,2. Ce mouvement, connu sous le nom de phase lente, est interrompu par des saccades compensatoires, appelées phase rapide, dans lesquelles l’œil se réinitialise rapidement dans la direction opposée pour permettre une nouvelle phase lente. Ici, nous définissons ces saccades de phase rapide comme des mouvements de suivi oculaire (ETM). Alors que le VOR s’appuie sur le système vestibulaire pour provoquer des mouvements oculaires afin de compenser les mouvements de la tête³, l’OKR est initié dans la rétine par le déclenchement de l’ON et la signalisation ultérieure au système optique accessoire (AOS) dans le mésencéphale ^4,5. En raison de sa dépendance directe aux circuits rétiniens, l’OKR a été fréquemment utilisé pour déterminer la capacité de suivi visuel dans les contextes de recherche et cliniques ^6,7.

L’OKR a été largement étudié en tant qu’outil d’évaluation des capacités visuelles de base ^2,6,8, du développement DSGC ^9,10,11,12, des réponses oculo-motrices¹³ et des différences physiologiques entre les fonds génétiques⁷. L’OKR est évalué chez des animaux ayant la tête fixe et présentant un stimulus en mouvement¹⁴. Les réponses oculomotrices sont généralement capturées à l’aide d’une variété d’outils vidéo, et les mouvements de suivi oculaire sont capturés sous forme de formes d’onde OKR dans les directions horizontale et verticale⁹. Pour quantifier la capacité de suivi, deux paramètres principaux ont été décrits : le gain de suivi (la vitesse de l’œil par rapport à la vitesse du stimulus) et la fréquence ETM (le nombre de saccades de phase rapides sur une période donnée). Le calcul du gain a été utilisé historiquement pour mesurer directement la vitesse angulaire de l’œil afin d’estimer la capacité de suivi ; Cependant, ces calculs demandent beaucoup de main-d’œuvre et peuvent être arbitrairement dérivés sur la base de méthodes de collecte de vidéo-oculographie et de quantification ultérieure. Pour une évaluation plus rapide des OKR, le comptage de la fréquence ETM a été utilisé comme méthode alternative pour mesurer l’acuité de suivi⁷. Bien que cela fournisse une estimation assez précise de la capacité de suivi, cette méthode repose sur une métrique indirecte pour quantifier la réponse en phase lente et introduit un certain nombre de biais. Il s’agit notamment d’un biais de l’observateur dans la détermination de la saccade, d’une dépendance à l’égard de réponses saccadiques temporellement cohérentes sur une époque donnée et d’une incapacité à évaluer l’ampleur de la réponse de phase lente.

Afin de répondre à ces préoccupations avec les approches actuelles d’évaluation des OKR et de permettre une quantification approfondie à haut débit des paramètres OKR, nous avons développé une nouvelle méthode d’analyse pour quantifier les formes d’onde des OKR. Notre approche utilise une plate-forme logicielle accessible basée sur Python appelée « PyOKR ». À l’aide de ce logiciel, la modélisation et la quantification des réponses en phase lente des OKR peuvent être étudiées plus en profondeur et avec une paramétrisation accrue. Le logiciel fournit des évaluations quantitatives accessibles et reproductibles des réponses à une myriade de stimuli visuels, ainsi qu’un suivi visuel bidimensionnel en réponse à des mouvements horizontaux et verticaux.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux effectuées à la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins (JHUSOM) ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la JHUSOM. Toutes les expériences réalisées à l’Université de Californie à San Francisco (UCSF) ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le programme institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’UCSF.

1. Collecte de données comportementales

1. Enregistrez les mouvements oculaires OKR à l’aide de la méthode de vidéo-oculographie de votre choix pour générer des données d’ondes (c’est-à-dire une série chronologique de l’angle du regard de l’œil en coordonnées sphériques).
   REMARQUE : Les données représentatives recueillies à JHUSOM ont été obtenues à l’aide de la chirurgie d’implantation du pilier de tête et de la vidéo-oculographie, comme décrit précédemment ^9,13 (Figure 1). Les données représentatives recueillies auprès de l’UCSF ont été obtenues par la chirurgie d’implantation du poste de tête et la méthode de vidéo-oculographie, comme décrit précédemment^{au point 10} (Figure 7).
   1. Notez les paramètres du stimulus et de l’enregistrement : fréquence d’images d’enregistrement, vitesse et direction du stimulus, et durées entre et après les époques du stimulus. Pour les stimuli sinusoïdaux, notez également l’amplitude et la fréquence de l’onde de stimulus.
2. Exportez les données de vague collectées sous forme de fichier . Fichier CSV contenant des données d’ondes horizontales et verticales (azimut et élévation).
   1. Organisez les données de vague sous forme de fichiers . Fichier CSV à deux colonnes contenant des données horizontales (epxWave) et verticales (epyWave).

2. Installation d’un logiciel d’analyse

1. Téléchargez et installez Python.
   1. Pour la supervision des graphes, installez Spyder via Anaconda.
   2. Pour vous assurer que les graphiques fonctionnent correctement dans Spyder, allez dans Outils > Préférences > la console Ipython > Graphics > Graphics Backend. Réglez Inline sur Automatique.
2. Créez un nouvel environnement Anaconda avec Python.
3. Installez PyOKR via PyPi avec pip install PyOKR pour installer la version la plus récente ainsi que les dépendances de paquets (Fichier de Codage Supplémentaire 1 et Fichier de Codage Supplémentaire 2)
4. Si un ordinateur Windows est utilisé, exécutez à partir de PyOKR import OKR_win comme o puis o.run().
5. Si un ordinateur Mac est utilisé, exécutez à partir de PyOKR import OKR_osx comme o puis o.run().

3. Analyse des données des vagues

1. Initialisation de l’analyse et importation des fichiers
   1. Exécutez o.run() dans un script .py pour ouvrir l’interface utilisateur.
   2. Sous Fichier, utilisez la fonction Ouvrir ou la commande Ctrl+O [commande iOS] pour ouvrir un navigateur qui permettra à l’utilisateur de sélectionner le fichier wave souhaité.
   3. Sous Fichier, utilisez le bouton Exporter le dossier ou la commande Ctrl+E pour ouvrir un navigateur de dossiers qui permettra la sélection d’un dossier de sortie vers lequel les analyses finales seront exportées.
   4. Entrez le nom du fichier d’analyse final sous le fichier de sortie dans un format recommandé, tel que AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Définissez le programme pour un animal individuel à l’aide de la commande Définir le sujet sous Fichier ou de la commande Ctrl+S pour initialiser l’ensemble de données d’un animal individuel.
2. Définition des paramètres du fichier d’onde
   1. Pour commencer à définir les paramètres de stimulus, définissez la directionnalité sous Sélectionner la direction du stimulus en sélectionnant l’une des quatre directions cardinales. Pour les stimuli sinusoïdaux, choisissez-en un qui contient (Horizontal) ou (Vertical) en conséquence, la direction cardinale définissant la direction initiale de l’onde sinusoïdale.
   2. Définissez le type de stimulus sous Sélectionner le type de stimulus comme Unidirectionnel, Oscillatoire ou Oblique.
   3. Après avoir défini la directionnalité, importez soit votre propre ensemble de données de position de stimulus (Importer vos propres données de vecteur de stimulus), soit générez automatiquement un vecteur basé sur des paramètres (Générer un vecteur de stimulus à partir de paramètres). Si vous importez un vecteur de stimulus, passez à la section 3.2.3.1, puis passez à l’étape 3.3. Si vous générez un vecteur de stimulus, passez aux étapes suivantes.
      1. Si vous importez vos propres données vectorielles, importez les valeurs de distance du stimulus (c’est-à-dire une série chronologique décrivant la distance parcourue par le stimulus entre chaque trame d’acquisition adjacente) dans le même format que celui décrit à l’étape 3.2.1. De plus, analysez l’ensemble de l’ensemble de données comme une seule époque plutôt que de le diviser en époques individuelles, car la fonctionnalité permettant de sous-définir la valeur de stimulus importée n’a pas été ajoutée à partir de PyOKR v1.1.2.
   4. Sous Paramètres de stimulus, définissez les paramètres du stimulus utilisé pour la collecte de données.
      1. Définissez la durée de l’absence de stimulus au début (tête) et à la fin (queue) d’un essai donné avec Head and Tail.
      2. Définissez la durée pendant laquelle un stimulus est affiché, la durée pendant laquelle aucun stimulus n’a été suivi et le nombre total d’époques au sein d’un essai donné avec Durée de l’époque, Durée du post-stimulus et Nombre d’époques, respectivement.
      3. Pour les stimuli unidirectionnels et obliques, réglez la vitesse du stimulus en degrés par seconde avec la vitesse horizontale et la vitesse verticale.
      4. Définissez la fréquence de capture de la caméra de collection à l’aide de l’option Capturer la fréquence d’images.
      5. Pour les stimuli sinusoïdaux, générez l’onde sinusoïdale pour modéliser les stimuli oscillatoires avec la fréquence et l’amplitude.
   5. Après le paramétrage, créez le modèle approprié à partir des informations de stimulus saisies ci-dessus avec Générer un vecteur de stimulus à partir des paramètres.
   6. Sélectionnez une époque donnée pour le stimulus saisi à l’aide de l’option Sélectionner l’époque pour parcourir le fichier d’onde totale.
3. Sélection supervisée des phases de suivi
   1. Pour identifier les régions de suivi lent, sélectionnez automatiquement les saccades de phase rapides avec ajustement préliminaire en cliquant sur Données non filtrées ou Données filtrées, ce qui étiquetera les saccades potentielles en fonction des changements de vitesse maximaux.
   2. Sous Données non filtrées, vérifiez que les saccades sont correctement sélectionnées à l’aide d’un point bleu. Si la sélection automatique n’est pas précise, supprimez manuellement des points avec le bouton gauche de la souris (LMB) ou ajoutez des points avec le bouton droit de la souris (RMB). Lorsque les saccades de phase rapide sont correctement sélectionnées, enregistrez les points avec le bouton central de la souris (MMB) et fermez le graphique.
   3. Si vous souhaitez un filtrage automatique, définissez un seuil de score Z et cliquez sur Données filtrées pour filtrer automatiquement les saccades. Si nécessaire, utilisez la même supervision manuelle que celle décrite à l’étape 3.3.2 pour éliminer tout bruit.
   4. Une fois la saccade correctement sélectionnée, appuyez sur Point Adjustment pour sélectionner la région à supprimer. Modifiez les points supérieur et inférieur à l’aide d’un schéma de contrôle similaire à celui décrit précédemment à l’étape 3.3.2. Modifiez les points supérieurs (verts) avec le LMB ou le RMB et modifiez les points inférieurs (rouges) avec Shift+LMB ou Shift+RMB. Lorsque les points sont correctement placés, utilisez le MMB pour enregistrer les points.
      REMARQUE : si vous utilisez un Mac, le réglage des points inférieur et supérieur se fait sur deux boutons distincts et suit le même schéma de contrôle que décrit à l’étape 3.3.2.
4. Analyse des phases de slow-tracking
   1. Définissez l’ordre du modèle polynomial à l’aide de l’option Définir l’ordre polynomial pour définir le modèle polynomial qui sera ajusté aux phases lentes individuelles.
      REMARQUE : Pour les stimuli unidirectionnels ou obliques, la valeur par défaut est 1 car la linéarité est nécessaire pour calculer le gain de suivi. Pour les stimuli sinusoïdaux, un ordre supérieur est nécessaire pour modéliser la courbe de l’onde, avec une valeur par défaut de 15.
   2. Pour analyser la trace, sélectionnez Analyse finale pour générer les modèles de phase lente (Figure 2) pour les phases lentes sélectionnées (voir Figure 2A-D) et calculer les distances, les vitesses et les gains de suivi moyennés sur l’époque (Figure 2E).
   3. Pour afficher le graphique bidimensionnel (2D) ou tridimensionnel (3D) des régions sélectionnées, sélectionnez Afficher le graphique 2D ou Afficher le graphique 3D , respectivement.
   4. Sélectionnez Ajouter une époque pour enregistrer les valeurs collectées générées à l’étape 3.4.2. Pour afficher toutes les valeurs ajoutées pour un animal donné ainsi que les moyennes des essais collectés, sélectionnez Afficher l’ensemble de données actuel.
   5. Une fois qu’une époque a été ajoutée, parcourez le reste du fichier avec Sélectionner une époque, en suivant les étapes 3.3.1 à 3.4.4.
   6. Une fois qu’un fichier d’onde est entièrement analysé, répétez ce processus pour tous les autres fichiers pour un animal donné en ouvrant de nouveaux fichiers, en définissant les paramètres appropriés et en les analysant en conséquence. En répétant les étapes 3.2.1 à 3.4.5 pour chaque fichier, générez un ensemble de données final contenant toutes les données d’onde pour un animal donné.
5. Exportation finale des données
   1. Une fois l’analyse des données terminée pour un animal donné, avec toutes les directions ou stimuli analysés, exportez l’ensemble de données via Exporter les données.
      REMARQUE : L’ensemble de données brutes sera exporté en fonction du nom du fichier de sortie et enregistré le long du chemin d’accès défini par le dossier de sortie sous la forme d’un fichier CSV contenant des données d’époque individuelles avec la moyenne totale pour chaque paramètre de stimulus.
   2. Après avoir exporté un animal individuel, réinitialisez l’ensemble de données avec Ctrl+S, puis répétez toutes les étapes précédentes pour analyser un nouvel animal.
   3. Si nécessaire, réorganisez toutes les données de sortie collectées pour plusieurs animaux afin de faciliter l’analyse à l’aide de la commande Trier les données sous l’onglet Analyse .
      REMARQUE : Cette fonction compilera et triera toutes les valeurs moyennes pour tous les fichiers d’animaux analysés stockés dans le dossier de sortie afin de faciliter la génération de graphiques et de comparaisons statistiques. Le tri dépend du nommage des fichiers à partir de la v1.1.2. Utilisez le schéma de dénomination recommandé décrit à l’étape 3.1.4 pour chaque fichier (par exemple, WT_123_Analysis).

Résultats

Pour valider la méthode d’analyse décrite ci-dessus, nous avons quantifié le gain de suivi OKR sur des traces d’ondes collectées chez des souris de type sauvage et un mutant knock-out conditionnel avec un déficit de suivi connu. De plus, pour tester l’applicabilité plus large de notre méthode d’analyse, nous avons analysé des traces dérivées d’une cohorte distincte de souris de type sauvage acquises à l’aide d’une méthode de collecte de vidéo-oculographie différente. Le filtrage automatique des saccades facilite le traitement et l’analyse des données OKR (Figure 3). À l’aide d’enregistrements de stimuli unidirectionnels et sinusoïdaux (Figure 1D), nous avons calculé les gains de suivi OKR dans les quatre directions cardinales (Figure 2F) pour les animaux de type sauvage (n = 13) par rapport aux stimuli unidirectionnels, ainsi que les gains de suivi en réponse aux stimuli sinusoïdaux horizontaux et verticaux (Figure 4). La disparité de la capacité de suivi par rapport à la direction du stimulus pour les stimuli unidirectionnels et sinusoïdaux est systématiquement observée chez toutes les souris de type sauvage, avec des réponses horizontales tout aussi robustes qui démontrent des gains de suivi significativement plus élevés que les réponses verticales, comme cela a été décrit². De plus, des gains de suivi asymétriques entre les réponses ascendantes et descendantes sont également observés chez les souris de type sauvage utilisant les deux méthodes de collecte par vidéo-oculographie, comme cela a été signalé précédemment ^2,10. Les amplitudes relatives et la cohérence des gains de suivi par rapport à la caractérisation publiée des réponses OKR indiquent que les gains de suivi calculés à l’aide du logiciel reflètent avec précision la capacité de suivi. En plus des calculs de gain unidirectionnel, les mouvements oculaires horizontaux et verticaux peuvent être modélisés simultanément (Figure 5), ce qui permet une reconstruction tridimensionnelle des mouvements oculaires en réponse à un stimulus donné. Cela fournit une capacité de quantification supplémentaire qui est utile pour les études futures portant sur les réponses horizontales et verticales couplées⁹.

Pour valider l’utilité du logiciel pour identifier les changements de comportement significatifs dans différentes conditions expérimentales, nous avons réanalysé nos données publiées⁹ pour confirmer que les déficits de suivi vertical évalués dans cette étude par comptage manuel des saccades de phase rapide se reflètent dans les gains de suivi en utilisant la méthodologie présentée ici. Des travaux antérieurs montrent que l’inactivation génétique dans la rétine du facteur de transcription T-box Transcription Factor 5 (Tbx5) par knockout conditionnel à l’aide de la protocadhérine 9-Cre (Pcdh9-Cre) provoque une perte spécifique de cellules ganglionnaires sélectives de direction ON accordées vers le haut (up-oDSGCs), et que Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f) ; Les mutants Pcdh9-Cre présentent une perte spécifique de suivi OKR vertical⁹. L’analyse quantitative utilisant la méthode décrite ici montre que Tbx5f/f ; Les animaux Pcdh9-Cre conservent des gains de suivi horizontaux normaux (Figure 6A), similaires à ceux décrits précédemment et obtenus par comptage manuel des saccades de phase rapides (ETM) (Figure 2F) ; cependant, ces souris montrent une perte significative de suivi vertical, avec des gains proches de zéro en réponse aux stimuli ascendants et descendants (Figure 6B,C). De plus, l’analyse des réponses sinusoïdales confirme que les animaux Tbx5 cKO présentent des gains de suivi horizontal plus importants tout en montrant une diminution significative du suivi vertical (Figure 6D-F). Une réanalyse de ce phénotype précédemment décrit à l’aide de PyOKR démontre la précision et la sensibilité de cette nouvelle méthodologie, qui permet des comparaisons quantitatives des réponses OKR chez des souris de différentes souches génétiques.

Enfin, nous avons analysé les traces verticales OKR de type sauvage collectées à l’UCSF pour valider l’utilité de l’application logicielle avec différentes méthodes de vidéo-oculographie et paramètres de stimulus. Les données de l’UCSF ont été recueillies à l’aide d’un système de projection hémisphérique dans lequel des réseaux mobiles sont présentés à la souris par la réflexion d’un projecteur de longueur d’onde de 405 nm sur un hémisphère entourant l’animal¹⁰ à tête fixe (Figure 7A). Des réseaux verticaux unidirectionnels ont été présentés à des souris à une vitesse de 10 degrés par seconde, et les réponses OKR ont été enregistrées sur des intervalles de 60 s (Figure 7B, C). Les traces verticales ont été analysées quantitativement via le PyOKR, et les réponses ascendantes ont été comparées aux réponses descendantes (Figure 7D). Les réponses à la hausse étaient significativement plus fortes qu’à la baisse, comme prévu¹⁰ ; cependant, les gains de suivi ont été légèrement inférieurs par rapport aux traces enregistrées à JHUSOM (Figure 2F). De plus, la quantification des réponses sinusoïdales a été analysée via PyOKR (Figure 7E), et une asymétrie significative dans les réponses verticales aux stimuli se déplaçant sinusoïdalement se reflète dans les gains calculés (Figure 7F). Les différences entre les valeurs de gain collectées à JHUSOM et UCSF peuvent être attribuées à des différences entre les paramètres de stimulus, y compris différentes vitesses, types et longueurs d’onde de stimulus ; cependant, la cohérence globale que nous observons dans notre analyse des données obtenues à l’aide de chaque méthode de collecte montre que notre PyOKR peut être facilement adapté au-delà de notre système de collecte de données JHUSOM OKR et appliqué à d’autres enregistrements OKR, indépendamment des méthodes de vidéo-oculographie. Ces résultats démontrent que la plate-forme logicielle décrite ici est précise et peut être généralement appliquée à l’étude des réponses oculomotrices, permettant des comparaisons quantitatives précises entre des animaux appartenant à différents groupes pour approfondir l’étude des circuits de stabilisation d’image visuelle.

Figure 1 : Collecte de données de réponse OKR. (A) Appareil d’arène virtuelle OKR pour la stimulation comportementale, comme décrit précédemment ^9,13. Quatre moniteurs entourent un animal à la tête fixe (1), affichant un stimulus en damier en mouvement continu (2). Le tambour virtuel peut présenter un mouvement unidirectionnel dans les quatre directions cardinales ainsi que des stimuli sinusoïdaux oscillatoires. L’œil gauche de la souris est éclairé par une lumière infrarouge (IR) et enregistré avec une caméra (3) pour enregistrer les réponses visuelles du système reflétées par le suivi oculaire. (B) L’analyse du suivi oculaire se fait en capturant la pupille et une réflexion cornéenne générée par la lumière IR. La collecte de données et le calcul des mouvements oculaires en réponse au tambour virtuel ont été effectués comme décrit précédemment ^9,13. (C) Schéma des vecteurs oculaires se déplaçant verticalement (onde Y) et horizontalement (onde X). (D) Échantillonnez les traces de la réponse de poursuite d’un œil à un mouvement unidirectionnel vers le haut et vers l’arrière, ainsi qu’à un mouvement sinusoïdal vertical et horizontal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse de suivi des réponses visuelles unidirectionnelles. (A-D) Identification et sélection des phases de suivi lentes pour l’analyse de gain. Des exemples de traces unidirectionnelles sont illustrés avec des réponses visuelles aux mouvements vers l’avant (A), vers l’arrière (B), vers le haut (C) et vers le bas (D) par rapport à l’œil de la souris. Les phases lentes sont identifiées par l’ajout de points rouges et verts décrits à l’étape 3 pour supprimer les saccades, et les phases lentes sélectionnées sont mises en évidence en jaune. Les régressions polynomiales sont superposées sur les traces sous forme de lignes. (E) Quantification des traces d’échantillon (A-D) telles qu’organisées dans la lecture PyOKR. Pour chaque trace, les vitesses XY totales et les gains respectifs sont calculés, quelle que soit la directionnalité. Dans les réponses unidirectionnelles, ces vitesses totales reflètent généralement la vitesse individuelle dans une certaine direction ; Cependant, pour les réponses sinusoïdales, cette valeur reflétera la vitesse globale moyenne de l’œil. Les composantes de vitesse horizontales et verticales sont décomposées pour indiquer la vitesse dans chaque direction respective. Le gain est ensuite calculé en fonction des vitesses de stimulus présentées. (F) Gains de suivi calculés des animaux de type sauvage (n = 13) dans les quatre directions cardinales par rapport à leur quantification ETM associée. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Les données sont analysées à l’aide d’une analyse de variance à un facteur avec comparaisons multiples. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.005, ****p<0.0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Le filtrage automatique des saccades facilite le traitement et l’analyse des données OKR. (A-D) Le filtrage automatique des traces de la Figure 2A-D supprime les saccades et modélise uniquement le mouvement de phase lente en supprimant les changements de vitesse rapides et en assemblant les phases lentes ensemble. La pente finale représente le mouvement total de l’œil sur une époque donnée. (E) Quantification des gains à partir de données d’échantillon filtrées, telles qu’organisées dans la lecture PyOKR. (F) La comparaison des valeurs de gain entre les traces oculaires non filtrées et les traces oculaires d’échantillon filtrées ne reflète aucune différence significative. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Données analysées à l’aide d’un test U de Mann-Whitney entre les résultats non filtrés et filtrés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Dérivation des gains de suivi en réponse à des stimuli visuels oscillatoires. (A,B) Les réponses aux mouvements oculaires verticaux (A) et horizontaux (B) à des stimuli se déplaçant sinusoïdalement peuvent être modélisées par rapport à des paramètres de stimulus oscillatoires définis. Les régions sélectionnées sont étiquetées en jaune avec l’approximation polynomiale superposée au-dessus de la trace. Un modèle du stimulus est présenté sous la forme d’une onde sinusoïdale orange derrière la trace pour permettre une référence à ce qu’est le stimulus à chaque point. (C) Les calculs de gain des réponses sinusoïdales de type sauvage (n = 7) reflètent des réponses asymétriques entre la capacité de poursuite horizontale et verticale. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Les données sont analysées à l’aide d’une analyse de variance à un facteur avec comparaisons multiples. **p<0.01,***p<0.005. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Le suivi directionnel peut être modélisé dans ses composantes horizontales et verticales. (A) Composante verticale d’une onde de suivi oculaire en réponse à un stimulus ascendant. (B) Composante horizontale d’une onde de suivi oculaire en réponse à un stimulus ascendant. (C) Trajectoire globale de l’œil dans les directions verticales et horizontales. (D) Modèle tridimensionnel du vecteur de mouvement de l’œil au fil du temps en réponse à un mouvement vers le bas. Les données de trace brutes sont affichées en rouge et le modèle de régression de trajectoire est affiché en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse de l’OKR en Tbx5f/f ; Les souris Pcdh9-Cre présentent des déficits significatifs dans les gains de suivi vertical unidirectionnels. (A) Tbx5f/f ; Les animaux Pcdh9-Cre ne montrent aucun changement significatif du gain de suivi horizontal. (B, C) Tbx5f/f ; Les animaux Pcdh9-Cre montrent une réduction significative du gain dans leurs réponses verticales : vers le haut (B) et vers le bas (C). (D, E) Réponses sinusoïdales de Tbx5f/f ; Pcdh9-Cre en réponse à des stimuli oscillatoires horizontaux (D) et verticaux (E). f) Quantification de Tbx5f/f ; Les réponses oscillatoires Pcdh9-Cre montrent des augmentations significatives des gains de suivi horizontaux, mais montrent des diminutions des réponses verticales. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Données analysées à l’aide d’essais U de Mann-Whitney. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Application de PyOKR à des données acquises à partir d’autres méthodes de vidéo-oculographie. (A) Appareil de stimulation virtuelle par tambour OKR, tel que décrit¹⁰. Un projecteur DLP de longueur d’onde de 405 nm est réfléchi par un miroir convexe sur un hémisphère pour créer un tambour virtuel qui entoure le champ de vision de l’animal. Les mouvements oculaires sont mesurés à l’aide d’une caméra NIR positionnée à l’extérieur de l’hémisphère. Des caillebotis à barres unidirectionnels et sinusoïdales sont montrés à un animal fixé sur la tête dans des directions verticales. (B, C) Les phases de suivi ascendantes (B) et descendantes (C) sont identifiées et sélectionnées pour l’analyse quantitative. Les phases lentes sont surlignées en jaune. (D) Gains de suivi calculés à partir du suivi vertical d’animaux de type sauvage (n=5) à l’aide des méthodes décrites ici. Une capacité de suivi asymétrique est observée, avec une diminution significative du suivi vers le bas. (E) Réponse oscillatoire à des stimuli sinusoïdaux modélisée pour quantifier les gains de suivi chez les animaux de type sauvage (n = 8). Les phases lentes sont surlignées en jaune. (F) La quantification des gains sinusoïdaux révèle une diminution des gains de suivi vers le bas par rapport aux gains vers le haut. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Données analysées à l’aide d’essais U de Mann-Whitney. *p<0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier de codage supplémentaire 1 : PyOKR Windows Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 2 : PyOKR Mac Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

PyOKR offre plusieurs avantages pour étudier les réponses visuelles reflétées dans les mouvements oculaires. Il s’agit notamment de la précision, de l’accessibilité et des options de collecte de données, en plus de la possibilité d’intégrer le paramétrage et des vitesses de stimulus variables.

L’évaluation directe du gain de suivi oculaire fournit une caractérisation précise du mouvement oculaire qui est une mesure quantitative plus directe que le comptage manuel traditionnel des saccades de phase rapides (ETM). Bien qu’utile, le comptage des saccades fournit une évaluation indirecte du mouvement de poursuite réel. La plateforme logicielle PyOKR permet de quantifier directement les vitesses de suivi, en prenant en compte des paramètres supplémentaires tels que les amplitudes des saccades et la durée des phases lentes. De plus, le comptage des saccades en phase rapide repose sur l’évaluation de la fréquence des saccades sur une période de temps déterminée, exigeant que chaque trace ait peu ou pas de bruit, y compris des saccades aléatoires dues au stress des animaux. Ces facteurs rendent de nombreuses traces collectées inutilisables et, par conséquent, ajoutent beaucoup de temps à la collecte de données afin d’évaluer avec précision le suivi oculaire. Cependant, le logiciel décrit ici résout ce problème en quantifiant directement les phases lentes individuelles au sein d’une trace donnée et en calculant les gains à des points instantanés le long de la trace. Il y parvient en comparant la vitesse du mouvement de l’œil à la vitesse du stimulus en un point donné. La fréquence saccadique n’étant plus le paramètre déterminant de l’analyse, le bruit peut être facilement éliminé par la supervision de l’utilisateur, ce qui réduit l’impact du bruit sur la qualité de l’analyse. Cela permet d’obtenir des données collectées plus utilisables et une puissance statistique plus élevée lors de l’analyse de ces données, ce qui augmente la précision et la reproductibilité lors de la quantification du suivi oculaire et de la caractérisation des paramètres OKR pour des souris individuelles et différents groupes de souris. Le filtrage automatisé des saccades basé sur les changements rapides de la vitesse oculaire trouvés via une méthode Z-score a également été utilisé pour caractériser le gain de poursuite¹⁰. Pour intégrer cette méthode de filtrage dans le logiciel, nous avons inclus ce type de filtrage de vélocité mais avec des outils supplémentaires tels que le paramétrage de seuil et la supervision saccadique manuelle pour réduire les erreurs potentielles générées par cette approche. Si les traces brutes sont utilisées pour l’analyse au lieu d’utiliser le filtrage automatisé, les changements rapides des mouvements oculaires causés par les saccades, les clignements ou la détresse de la souris sont identifiés par les changements de vitesse maximale via une estimation de la densité du noyau gaussien de la vitesse de trace. Cela permet la sélection automatique des régions de segmentation et, éventuellement, leur suppression sur la base d’une supervision manuelle de l’utilisateur. La supervision manuelle offre une tolérance plus élevée aux traces bruyantes, ce qui permet aux utilisateurs de corriger rapidement les marques faussement positives ou faussement négatives pour des changements oculaires rapides. De plus, comme PyOKR utilise des approximations polynomiales pour modéliser le mouvement général de l’œil dans une direction donnée, le bruit à des points individuels est lissé, ce qui permet d’évaluer les vitesses de trajectoire avec une certaine tolérance pour le bruit dans la trace. Ce n’est qu’en cas de qualité de données extrêmement médiocre sur l’ensemble de la trace ou d’un mauvais calibrage lors de la collecte des données que le logiciel ne sera pas en mesure de générer une analyse précise des données. Dans l’ensemble, en intégrant la supervision de l’utilisateur, le filtrage et les outils de calcul instantané du gain, l’application logicielle PyOKR décrite ici génère un suivi des gains avec une grande précision et des mesures plus directes que les méthodes précédentes.

PyOKR dispose également de nombreuses fonctionnalités qui permettent de personnaliser les analyses OKR pour répondre aux besoins des utilisateurs. La saisie des paramètres de stimulus, ainsi que des vecteurs de stimulus bruts, permet à l’utilisateur de définir avec précision tout stimulus souhaité. Il peut s’agir de stimuli unidirectionnels, sinusoïdaux ou obliques, que le logiciel peut utiliser pour générer des gains de suivi précis pour les réponses visuelles associées. Grâce au paramétrage du stimulus de cette méthodologie, les gains instantanés calculés à chaque image peuvent être générés de manière fiable et avec une grande précision, quel que soit le stimulus saisi. Bien que les données sur les stimuli obliques n’aient pas été analysées ici, des gains précis peuvent être calculés à l’aide de vecteurs de vitesse XY décomposés pour reconstruire un angle oblique, ce qui permet de calculer avec précision le gain des stimuli obliques. Grâce à une paramétrisation accessible des paramètres de stimuli, notre outil est largement applicable au traçage d’ondes en réponse à tout stimulus visuel. De plus, le logiciel permet un débit plus élevé et une quantification reproductible par rapport aux méthodes précédentes. Le tri des traces OKR prend du temps et demande beaucoup de main-d’œuvre. cependant, l’interface utilisateur simplifiée de PyOKR est capable de filtrer facilement de nombreuses traces à un taux plus élevé qu’auparavant. Cela permet non seulement une quantification plus rapide des traces, mais révèle également des paramètres OKR supplémentaires, notamment la quantification directe des vitesses oculaires, les composantes vectorielles directionnelles du mouvement oculaire et les gains instantanés par rapport au stimulus dans les composantes horizontales et verticales du vecteur de mouvement. De plus, compte tenu de l’identification automatisée des saccades et du calcul des vitesses de suivi permis par notre méthode, le biais potentiel de l’expérimentateur dans l’analyse des données est considérablement réduit par rapport à d’autres méthodes de quantification, telles que le comptage manuel ETM ou le filtrage automatisé des traces, qui peuvent générer des faux négatifs. De plus, de grandes quantités de données comportementales peuvent être générées et compilées automatiquement pour une analyse simplifiée en aval. Grâce aux fonctions d’exportation et de tri des données disponibles dans PyOKR, les données de suivi de plusieurs animaux et conditions peuvent être traitées automatiquement pour permettre un stockage organisé des données ainsi qu’une analyse statistique rapide. Pour mener des expériences qui utilisent plusieurs conditions au cours de la même session d’enregistrement, telles que la manipulation de circuits ou les réponses visuelles, nous recommandons de collecter des données dans des fichiers d’ondes discrètes ou des époques sous-définies qui permettent de stocker des ensembles de données distincts basés sur les variables d’intérêt indépendantes dérivées de cette session d’enregistrement unique. Par exemple, si l’on teste des différences de réponses à différentes fréquences d’ondes sinusoïdales au sein d’un paradigme expérimental, nous recommandons d’enregistrer différents paramètres dans différents fichiers d’ondes pour une analyse distincte, tels que WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis et WT_1_Freq0.3Analysis. Dans la version actuelle, une fois les époques analysées, il n’y a pas de fonctionnalité permettant de sélectionner des valeurs d’époque individuelles dans l’ensemble de données, bien que cela puisse être ajouté à l’avenir si nécessaire.

Enfin, notre méthode est adaptable à plusieurs méthodes de collecte de vidéo-oculographie et fournit une plateforme d’analyse robuste qui peut être facilement adaptée aux besoins spécifiques d’un laboratoire. Grâce à l’analyse de données OKR de type sauvage et de mutants existants, ainsi que de données OKR de type sauvage collectées à l’aide de différentes méthodes et stimuli, nous montrons ici que notre outil d’analyse est capable de a) quantifier le suivi des OKR à partir de n’importe quel stimulus directionnel avec une précision et un débit élevés ; b) l’identification des différences comportementales du système visuel résultant d’une perturbation génétique ; et c) l’évaluation des données de suivi visuel provenant de différentes méthodes de vidéo-oculographie. L’accessibilité et l’adaptabilité générale de notre plateforme d’analyse facilitent l’étude plus approfondie des réponses OKR et amélioreront les études comportementales qui caractérisent l’assemblage et la dynamique des circuits neuronaux dans le contexte des réponses oculomotrices.

Pour obtenir des mesures précises et des analyses de données utiles ultérieures, plusieurs étapes sont nécessaires pour la collecte des données. Nous recommandons de collecter des données OKR sur plusieurs sessions pour permettre à l’animal de s’acclimater à l’appareil de test comportemental et de réduire l’impact du stress animal sur les réponses comportementales ; cependant, un enregistrement excessif peut conduire à une potentialisation de la réponse OKR¹³, il est donc recommandé de faire preuve de prudence lors de la conception des régimes de test. Lors de la collecte de données OKR, un étalonnage correct de l’équipement de vidéo-oculographie est essentiel pour une quantification précise, car la qualité des données analysées est une fonction directe de la trace traitée. Il est important de noter que l’utilisation de l’IDE Spyder est nécessaire pour la supervision des graphes via Matplotlib. Compte tenu de l’accessibilité et de la conception du cadre de notre plateforme, tous les outils nécessaires sont disponibles pour que d’autres puissent étendre les capacités du logiciel et adapter cette plateforme à des paradigmes expérimentaux comportementaux distincts.

En conclusion, nous décrivons ici un nouvel outil accessible et polyvalent pour l’analyse des réponses comportementales OKR de manière plus approfondie et avec plus de puissance quantitative que ce qui est actuellement disponible avec les méthodologies existantes. PyOKR peut être facilement utilisé par les utilisateurs novices de Python et contient un pipeline d’analyse et une interface établis pour l’analyse rapide et précise des ondes OKR avec une rigueur et une reproductibilité accrues. L’adaptabilité de ce logiciel fournit un cadre flexible que les utilisateurs peuvent facilement adapter à leurs besoins spécifiques et aux procédures de collecte de données. Nous prévoyons que cette méthode quantitative fera progresser l’étude des réponses oculomotrices et approfondira notre compréhension du développement et de la fonction des circuits neuronaux qui régissent les comportements du système visuel.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris C57BL/6J  ;	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID : SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID : SCR_001622
Chambre d’enregistrement du réflexe optocinétique - JHUSOM	Custom-built	N/A	Comme décrit dans Al-Khindi et al. (2022)9 et Kodama et al. (2016)13
Chambre d’enregistrement du réflexe optocinétique - UCSF	Sur mesure	N/A	Comme décrit dans Harris et Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID : SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Don de B. Bruneau	N/A	Comme décrit dans Al-Khindi et al.(2022)9nbsp ;
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	Stock # 036084-UCD ; Numéro d’identification : MMRRC_036084-UCD