Cette étude décrit un protocole combiné d’imagerie par résonance magnétique (IRM) et d’ultrasons focalisés pulsés (FUS) de faible intensité, utilisant des rats vivants avec cathétérisme de la veine jugulaire pour surveiller l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique (BHE).
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Surveillance de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique chez le rat à l’aide d’un système d’échographie focalisée préclinique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cerveau possède une barrière sanguine semi-perméable hautement sélective, appelée barrière hémato-encéphalique (BHE), qui empêche l’administration d’agents macromoléculaires thérapeutiques au cerveau. L’intégration d’ultrasons focalisés pulsés de faible intensité (FUS) guidés par IRM avec pré-injection de microbulles est une technique prometteuse pour la modulation non invasive et non toxique de la BHE L’IRM peut offrir un contraste supérieur des tissus mous et diverses évaluations quantitatives, telles que la perméabilité vasculaire, la perfusion et la distribution spatio-temporelle des agents de contraste IRM. Notamment, les techniques d’IRM avec des agents de contraste IRM à base de gadolinium se sont avérées être la référence pour détecter les ouvertures de la BHE. Cette étude décrit une méthodologie complète impliquant des protocoles d’IRM et des procédures animales pour surveiller l’ouverture de la BHE dans un modèle de rat. Le modèle de rat offre l’avantage supplémentaire de l’utilisation d’un cathéter de la veine jugulaire, ce qui facilite l’administration rapide des médicaments. Un transducteur FUS préclinique guidé par stéréotaxie facilite le raffinement et la rationalisation des procédures animales et des protocoles d’IRM. Les méthodes qui en résultent se caractérisent par leur reproductibilité et leur simplicité, éliminant ainsi le besoin d’une expertise chirurgicale spécialisée. Cette recherche vise à contribuer à l’optimisation des procédures précliniques avec des modèles de rats et à encourager la poursuite des recherches sur la modulation de la BHE afin d’améliorer les interventions thérapeutiques dans les troubles neurologiques.
Introduction
La BHE régule le mouvement des ions, des molécules et des cellules entre les vaisseaux sanguins et les tissus cérébraux1. Cette fonction permet le maintien de la fonction neuronale et de la santé tout en empêchant l’administration d’agents macromoléculaires thérapeutiques aux tissus cérébraux. La perméabilité limitée de la BHE peut entraîner une diminution de l'efficacité et de l'efficacité des traitements pour les tumeurs cérébrales et les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie d'Alzheimer2. Par conséquent, diverses approches, telles que l’administration assistée par convection, les injections intracrâniennes directes, la perturbation osmotique et la conception améliorée de médicaments, ont été étudiées pour contourner la BHE pour l’administration contrôlée d’agents thérapeutiques3,4,5.
Cependant, ces approches ont des limites intrinsèques telles que l’invasivité, le risque d’infection, le risque d’hémorragie, l’hétérogénéité et l’efflux rapide de médicaments. Les ultrasons focalisés pulsés (FUS) de faible intensité avec injection de microbulles sont une technique non invasive prometteuse permettant une perturbation localisée et réversible de la BHE. Les effets mécaniques des ultrasons couplés aux microbulles peuvent modifier transitoirement la perméabilité de la BHE (c’est-à-dire l’ouverture de la BHE 6,7. Pour d’autres progrès dans les applications de traitement utilisant l’ouverture de la BHE, des expériences in vivo sur de petits animaux sont essentielles.
Dans cette étude, nous avons introduit des protocoles d’IRM et des procédures animales pour surveiller l’ouverture de la BHE dans un modèle de rat. Le protocole comprenait un modèle de rat avec un cathéter de veine jugulaire canulé par une organisation commerciale (voir la table des matériaux). Un modèle de cathétérisme de la veine jugulaire chez le rat présente les avantages potentiels d’une administration rapide de médicaments, de tests de surveillance hémodynamique et d’un cathétérisme stable. L’ouverture de la BHE a été réalisée à l’aide d’un système FUS préclinique. Spécialement conçu pour l’ouverture de la BHE dans les petits modèles d’animaux tels que les rats et les souris, ce système intègre des composants essentiels, tels qu’un système de paillasse, un ordinateur de contrôle, un transducteur, un dégazeur d’eau et les accessoires qui l’accompagnent. L’utilisation de ce système FUS préclinique guidé par stéréotaxie améliore non seulement la précision, mais rationalise également les procédures animales et les protocoles IRM, contribuant ainsi à la reproductibilité et à la simplicité du protocole expérimental global.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les expériences sur les animaux de cette étude ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à San Francisco (UCSF). Des rats Sprague-Dawley mâles (200-250 g) ont été utilisés dans cette étude. Les rats ont été logés et soignés selon le Bureau des directives de soin et d’utilisation des animaux des National Institutes of Health chez les souris et les rats. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation des animaux
REMARQUE : Pour les procédures internes, les animaux ont été transportés à la salle de préparation et les procédures ont été menées comme suit :
- Placez les rats individuellement dans une chambre en lucite et exposez l’isoflurane (2 % à 3 %) mélangé à de l’oxygène extrait d’une bouteille d’oxygène médical jusqu’à ce qu’ils soient inconscients (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement).
REMARQUE : L’anesthésie à l’isoflurane permet la mise en place d’un protocole d’IRM à long terme. - Retirez les rats de la chambre et rasez les poils des zones antérieure et postérieure du cou à l’aide d’une crème dépilatoire.
- Appliquez une pommade lubrifiante sur les yeux.
- Placez le nez dans le cône nasal pour maintenir l’anesthésie avec respiration spontanée (vaporisateur d’isoflurane entre 2 % et 2,5 %, débitmètre d’oxygène à 1-1,5 L / min).
- Placez le rat anesthésié sur une table d’opération chauffée et confirmez par une pincement de l’orteil.
REMARQUE : Le protocole IRM comprenait des séquences améliorées par contraste, telles que l’imagerie par écho de gradient pondéré en T1 et l’imagerie par écho de spin pondéré en T2. Ces séquences ont été réalisées avant et après l’injection d’agents de contraste à base de gadolinium (GAD) afin d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il s’agit d’administrer des agents de contraste GAD pendant que le rat est dans un scanner IRM7. Pour faciliter ce processus, un tube de cathéter s’étendant du cathéter canulé chez le rat a été utilisé. L’extension comprenait un connecteur de cathéter et un tube en polyéthylène de 30 cm. Pour assurer la perméabilité et prévenir les fuites, la tubulure d’extension a été rincée avec du glycérol hépariné (250 UI d’héparine/1 mL de glycérol).
2. Système d’échographie focalisée guidée par stéréotaxie
NOTE : Les animaux ont été transférés et placés sur une table dans un système FUS stéréotaxique. Le nez du rat a été placé dans le cône nasal pour maintenir l'anesthésie. Le système FUS se compose d’un générateur de fonctions, d’un amplificateur RF et d’un oscilloscope. Avant de mettre en place le transducteur, nous nous sommes assurés de la bonne connexion de tous les appareils avec le système. La configuration de la sonde a été effectuée à l’aide des étapes suivantes :
- Placez un pointeur pointu à la position du Bregma dans le crâne et enregistrez la position. La position de Bregma peut être identifiée en pointant l’emplacement de 9,0 mm en avant de Lambda sur la ligne médiane8. Le Lambda se trouve au centre de la ligne entre les tympans bilatéraux9.
- Placez du gel à ultrasons sur la tête du rat, le sac de couplage d'eau et le transducteur (fréquence 1 MHz). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air entre la peau du rat, le sac de couplage d'eau et le transducteur.
- Connectez un câble BNC coaxial du transducteur à l’entrée du module système FUS.
- Dans un ordinateur de contrôle) Cliquez sur charger pour des images de rats pré-enregistrées ; Un certain nombre de points focaux et de pression acoustique sont choisis.
- Dans un ordinateur de contrôle) Cliquez sur le test de mouvement dans le module de traitement pour vous assurer que le transducteur peut se déplacer entre les points au cours d’une période de rafale.
- Configurez les paramètres de sonication décrits à l’étape 3.
3. Infusion de microbulles et sonication
- Activez le fichier microbubble.
REMARQUE : La microbulle utilisée dans cette étude a été caractérisée par un diamètre de 1,7 μm et une concentration de 0,2 × 109 particules par millilitre10. Le flacon de microbulles a été activé sur la base des instructions de prescription fournies par le fournisseur et d’un rapport publié précédemment 11.- Préparez une seringue de 5 ml avec un embout Luer Lock et remplissez-la de 5 ml de chlorure de sodium injecté à 0,9 % sans additif.
- Retirez le capuchon vert et connectez la seringue à la goupille de distribution ventilée (voir tableau des matériaux) en la vissant dans le sens des aiguilles d’une montre.
- Retirez la goupille de protection et placez-la au centre du bouchon en caoutchouc du flacon. Appuyez fermement jusqu’à ce que la pointe soit complètement insérée dans le bouchon.
- Videz la seringue de 5 ml entière dans le flacon en appuyant sur la tige du piston.
- Agitez vigoureusement le flacon pendant 20 secondes pour mélanger tout le contenu. Un liquide blanc et laiteux constant montrera que des microsphères lipidiques d’hexafluorure de soufre se sont formées.
- Pour obtenir la dose requise, retournez la seringue et prélevez lentement le volume prévu de la suspension dans une seringue de 5 ml.
- Utiliser une pompe à perfusion.
REMARQUE : L’approche par perfusion 12 a été utilisée pour administrer des microbulles aux rats à l’aide d’un pousse-seringue. Une seringue contenant des microbulles a été reliée à un connecteur de cathéter inséré dans le rat. Les microbulles ont été transférées à travers un tube en polyéthylène, et le débit de la pompe de perfusion a été réglé à 0,66 mL/min. Ce débit de perfusion permet l’injection de 2 mL de microbulles à partir d’une seringue de 3 mL pendant 3 min. La perfusion a commencé avant la sonication pendant 1 min et s’est poursuivie tout au long de la période de sonication de 2 min. - Effectuer sonication.
REMARQUE : Dans cette étude, les impulsions FUS ont été choisies avec les paramètres suivants : (1) Région cible : hippocampe gauche ; (2) Nombre de taches : 6 pour couvrir l’hippocampe dans le cerveau ; (3) Durée de la rafale : 10 ms ; (4) Période de rafale : 1200 ms ; (5) Pression acoustique : 0,65 MPa ; (6) « Mode rafale » dans le menu du mode de sonication du système FUS ; (7) Temps de sonication : 120 s.
4. Procédure d’IRM à l’aide d’un scanner préclinique 3T
- Après la sonication, transférez les animaux sur une table dans un scanner préclinique 3T sans cryogène.
- Placez les rats en position couchée. Maintenez la température du coussin chauffant dans le scanner et surveillez la fréquence respiratoire à l’aide d’un capteur d’oreiller pneumatique. Effectuez le protocole IRM pour tester différents types d’imagerie IRM (Tableau 1).
- Inclure d’autres techniques d’imagerie quantitative, telles que l’imagerie pondérée en diffusion (DWI), la cartographie T2*, la cartographie T1 et l’IRM dynamique avec contraste amélioré (DCE), en plus de l’IRM avec contraste, afin de démontrer son potentiel pratique pour diverses études d’imagerie. Voir le tableau 1 pour les protocoles d’IRM utilisés dans cette étude.
- Injecter des agents de contraste IRM à base de GAD (Gadavist, 1 mmol/kg) après la séquence d’écho de gradient MR pondérée T1, et acquérir des images post-GAD.
REMARQUE : Pour un rat de 200 g, nous avons injecté 200 μL de l’agent de contraste IRM et l’avons suivi d’une solution saline de 200 μL pour rincer la tubulure.
5. Examen macroscopique du cerveau du rat
REMARQUE : Après l’IRM, 2 ml de solution bleue d’Evans (diluée à 2 % avec une solution saline tamponnée au phosphate) ont été injectés, et le rat a été laissé au repos pendant au moins 30 minutes pour permettre à la solution de se répandre et de circuler dans tout le corps. Par la suite, les rats ont été euthanasiés à l’aide d’une surdose d’isoflurane (5 %) pour un examen macroscopique du cerveau (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Pour confirmer l’euthanasie, il a fallu donner un coup de poing aux orteils et observer l’arrêt de la respiration de l’animal pendant au moins 1 min. La procédure de perfusion a été effectuée, suivie d’un examen du cerveau du rat. La procédure de perfusion est résumée comme suit :
- Effectuez une thoracotomie à l’aide d’un ciseau chirurgical pour exposer les organes de la poitrine et visualiser la région cardiaque.
- Inciser (~5 mm) l’oreillette droite.
- Introduire une solution saline dans le ventricule gauche à des fins de perfusion.
- Ouvrez l’os du crâne avec des ciseaux chirurgicaux pour dévoiler et présenter le cerveau.
REMARQUE : Une perfusion adéquate devrait entraîner une apparence uniformément brillante du cerveau, tandis que les zones bleues persistantes indiquent une fuite d’albumine associée à la BHE, comme détectée par le bleu d’Evans.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Cette étude présente un protocole préclinique pour le suivi de l'ouverture de la BHE dans un modèle rat à l'aide d'un système FUS pour animal commercial. Le système FUS a été installé sur un établi ou un chariot de grande taille (Figure 1). Les rats ont été anesthésiés à l'isoflurane mélangé à de l'oxygène par un embout nasal fixé sur le support contenant le porte-transducteur. Un hydrophone résonnant à 500 kHz, destiné à détecter la cavitation acoustique, a été inséré dans le transducteur F...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Un protocole et une procédure animale utilisant un modèle de cathétérisme de la veine jugulaire chez le rat pour les études d’ouverture de la BHE ont été mis au point. Bien qu’il existe de nombreux protocoles précliniques, ce protocole intègre un système FUS disponible dans le commerce et un modèle de rat, minimisant les procédures de préparation des animaux et assurant ainsi la reproductibilité expérimentale.
Dans ce protocole, la sélection des microbulles était basée sur leur stabilité et le...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts pertinent à déclarer.
Remerciements
Cette étude a été partiellement soutenue par le K99DE032397 de subvention de l’Institut national de recherche dentaire et craniofaciale (NIDCR), la subvention de démarrage du département UCSF (n° 7504831), la subvention RAP de l’UCSF (PI : Kazim Narsinh, MD) et la Fondation allemande pour la recherche (DFG, GA 3535/1-1).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Seringue de 1 mL | BD plastipak | ||
| 20 mL, chlorure de sodium 0,9 % | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| Seringue de 3 mL | BD plastipak | ||
| Seringue de 5 mL | BD plastipak | ||
| Aiguille émoussée, 21 G | SAI technologies de perfusion | B21-50 | |
| Connecteur de cathéter, 21 G | de perfusion SAI technologies | CC-25-25 | |
| Solution de verrouillage de cathéter | SAI technologies de perfusion | Réf # HGS-10 | (500 µ ;/mL) Glycérol |
| Evans Blue | Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Israël | ||
| Gadavist | Bayer | 2068062 | |
| GE Vaporisateur d’isoflurane ; | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS Seringue Pompe | Inovenso | IPS-12 | |
| isoflurane USP | Vet one | 501017 | |
| Lumason microbbuble | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| rats Sprague-Dawley mâles (200&ndash ; 250 g) ; | Charles River Laboratories | ||
| Aiguille, 18 G | BD Precisionglide | ||
| Saline tamponnée au phosphate | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Tube en polyéthylène | BD Intramedic | ||
| préclinique 3T sans cryogène Bruker Biospin scanner ; | Bruker | Biospec3T | |
| Rat avec cathétérisme de la veine jugulaire | Charles River Laboratories | ||
| RK-50 ; transducteur à ultrasons focalisés | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 système d’échographie focalisée de paillasse | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, États-Unis | ||
| goupille de distribution ventilée ; | B Braun | 4550560 |
Références
- Daneman, R., Prat, A. The Blood-Brain Barrier. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).
- Meng, Y., et al. Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery. Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).
- Mungur, R., et al. Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment. Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).
- Boado, R. J., et al. Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor. Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).
- Hendricks, B. K., et al. Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers. Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).
- Hynynen, K., et al. Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
- Hynynen, K., et al. Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).
- Yao, X., et al. Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound. J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).
- Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery. IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).
- Kotopoulis, S., et al. SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).
- Bracco Diagnostics Inc. LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).
- Lapin, N. A., et al. Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent. Sci Rep. 10, 16546(2020).
- Vlachos, F., et al. Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI. Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).
- Singh, A., et al. An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D. Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).
- Plaksin, M., et al. Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
- Singh, A., et al. Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping. Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
