Method Article

Isolement et cryoconservation de cellules mononucléées du sang périphérique humain hautement viables à partir de sang total : un guide pour les débutants

DOI:

10.3791/66794

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October 25th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole présente un guide accessible pour la collecte, le stockage et la décongélation des cellules mononucléées du sang périphérique, adapté aux analyses en aval et aux flux de travail tels que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN. Des collections de plasma et de couche leucocytaire sont également présentées.

Abstract

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Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont couramment utilisées dans la recherche biomédicale sur le système immunitaire et sa réponse aux maladies et aux agents pathogènes. Ce protocole détaillé décrit l’équipement, les fournitures et les étapes permettant d’isoler, de cryoconserver et de décongeler des PBMC de haute qualité et hautement viables à partir de cellules sanguines totales adaptées à des applications en aval telles que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN. Des protocoles de traitement du plasma et de la couche leucocytaire à partir du sang entier en parallèle et en même temps que les PBMC sont également décrits. Ce protocole étape par étape facile à suivre, qui utilise la centrifugation par gradient de densité pour isoler les PBMC, est accompagné d’une liste de contrôle des fournitures, de l’équipement et des étapes de préparation. Ce protocole convient aux personnes ayant une expérience préalable des techniques de laboratoire et peut être mis en œuvre dans des laboratoires cliniques ou de recherche. La viabilité cellulaire et le séquençage de l’ARN de haute qualité ont résulté de PBMC collectés par des opérateurs sans expérience préalable en laboratoire de l’utilisation de ce protocole.

Introduction

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Ce protocole fait la démonstration d’une méthode et d’un flux de travail accessibles pour l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang total. Ce protocole s’adresse particulièrement aux techniciens de recherche novices, aux étudiants et au personnel de laboratoire clinique dans le but de faciliter la collecte et la cryoconservation des PBMC sans supposer une formation préalable en techniques de laboratoire.

Ce protocole utilise la centrifugation pour séparer les composants du sang total par densité. Le sang total se compose de quatre composants principaux classés par ordre décroissant de densité : les globules rouges/érythrocytes (~45 % du volume), les globules blancs (<1 % du volume), les plaquettes (<1 % du volume) et le plasma (~55 % du volume)1,2,3,4,5,6. Les globules blancs peuvent être subdivisés en deux catégories en fonction des caractéristiques de leur noyau : rond ou multinucléé6. Les PBMC sont définis comme des globules blancs à noyaux ronds et se composent des types de cellules suivants : lymphocytes (lymphocytes T, lymphocytes B, cellules NK), cellules dendritiques et monocytes6. Les globules blancs multinucléés comprennent les granulocytes, qui se composent des types de cellules suivants : neutrophiles, basophiles et éosinophiles6. Les globules blancs multinucléés sont plus denses que les PBMC6. Les densités de chaque composant du sang total sont détaillées dans le tableau 1.

Dans ce protocole, le sang total est collecté dans des tubes de centrifugation à gradient de densité. Ces tubes contiennent un milieu à gradient de densité pré-emballé qui a une densité de 1,077 g/mL. Après la centrifugation, les cellules plus denses, y compris les globules blancs multinucléés et les érythrocytes, sont séparées des PBMC et des plaquettes par le milieu à gradient de densité (Figure 1A)6,7. La PBMC et la fraction plaquettaire sont ensuite recueillies, lavées et centrifugées pour éliminer les plaquettes. Les PBMC purifiés qui en résultent sont collectés et stockés à -80 °C ou dans de l’azote liquide. Les PBMC cryoconservés peuvent être décongelés de manière viable et directement utilisés dans les analyses en aval ou traités en outre pour isoler des types de cellules constitutives spécifiques.

Ce protocole a été optimisé pour un séquençage d’ARN de haute qualité à partir de PBMC hautement viables. Dans cet article, des PBMC ont été isolés et cryoconservés chez des patients dans une clinique externe. Par la suite, les monocytes ont été isolés des PBMC par FACS et analysés par séquençage de l’ARN. Cependant, le protocole peut être largement adapté à d’autres besoins expérimentaux tels que la culture cellulaire, l’édition de gènes, les études fonctionnelles ex-vivo, les analyses de cellules uniques, le phénotypage par cytométrie en flux ou cytométrie par temps de vol, l’isolement d’ADN/ARN ou de protéines, les lames pour l’immunohistochimie, entre autres 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

En plus de la collecte PBMC à partir de tubes de centrifugation à gradient de densité, ce protocole examine comment collecter le plasma et la couche leucocytaire par centrifugation à l’aide d’un tube EDTA. Après centrifugation, le sang total est séparé en plasma, en érythrocytes et en une fine couche d’interface appelée couche leucocytaire contenant des leucocytes (Figure 1B)6. La couche leucocytaire est couramment utilisée pour l’extraction de l’ADN et les analyses génomiques ultérieures19,20. La couche de plasma contient les composants acellulaires du sang total et peut être utilisée pour les tests de biomarqueurs21,22.

Protocol

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Le protocole d’étude a été approuvé par le programme de protection humaine de l’UCSD et du KUMC et est conforme à la Déclaration d’Helsinki. Toutes les personnes ont donné leur consentement éclairé pour la participation et la collecte de sang.

1. Traitement et cryoconservation des PBMC

  1. La veille du prélèvement sanguin, imprimez la liste de contrôle des matériaux et des réactifs énumérés au tableau 2 , puis préparez et étiquetez en conséquence.
    REMARQUE : Ce protocole a été conçu pour la collecte de 6 tubes de centrifugation à gradient de densité. Chaque tube produit environ 12 millions de PBMC, dont environ 50 % et 20 % seront respectivement des lymphocytes et des monocytes vivants. Adaptez-vous en conséquence aux besoins expérimentaux. Notez que le nombre absolu de cellules peut différer considérablement entre les patients ou les conditions de traitement.
  2. En utilisant la technique de phlébotomie standard, prélever du sang total dans 6 tubes de centrifugation à gradient de densité et 1 tube EDTA jusqu’à ce qu’ils soient remplis, soit environ 6 ml de volume.
    REMARQUE : Si des échantillons provenant de plusieurs patients ou conditions de traitement sont nécessaires, les tubes collectés peuvent être stockés jusqu’à 4 h, puis traités simultanément.
  3. Après le prélèvement, centrifugez tous les tubes à 1 800 x g pendant 20 min à température ambiante.
    REMARQUE : Reportez-vous à la vidéo supplémentaire 1 pour une démonstration du fonctionnement d’une centrifugeuse.
  4. Après la centrifugation, ouvrez avec précaution le tube de centrifugation à gradient de densité. À l’aide d’une pipette de transfert, vous pourrez retirer et jeter la couche jaune translucide contenant du plasma. Ne dérangez pas la couche brumeuse de cellules directement au-dessus du milieu à gradient de densité. Péchez par excès de prudence, en laissant l’excès de plasma plutôt que de jeter les PBMC. Répétez l’opération pour tous les tubes.
    REMARQUE : Après centrifugation du tube contenant le milieu à gradient de densité, le plasma et les PBMC seront au-dessus du milieu à gradient de densité ; Les érythrocytes et les granulocytes se déposent au fond. Reportez-vous à la figure 1A pour une visualisation.
  5. À l’aide d’une nouvelle pipette de transfert, pipetez doucement le volume restant contenant les cellules et le plasma résiduel dans chaque tube vers le haut et vers le bas plusieurs fois au-dessus du milieu à gradient de densité.
  6. Après la remise en suspension, pipetez le contenu du tube remis en suspension dans un tube conique de 50 ml étiqueté. Répétez l’opération pour tous les tubes.
  7. Verser la solution 1 (RPMI Medium) dans le tube de 50 mL jusqu’à ce qu’elle atteigne la conduite de 50 mL.
  8. Répétez les étapes 1.4 à 1.7 pour chaque patient ou condition de traitement si nécessaire.
    REMARQUE : Assurez-vous que différents échantillons ne sont pas mélangés et utilisez une pipette de transfert neuve pour éviter toute contamination.
  9. Centrifugez le tube de 50 mL à 300 x g pendant 10 min à température ambiante.
    REMARQUE : Le protocole de collecte de plasma et de buffy détaillé à la section 2 peut être complété pendant cette période.
  10. Jeter autant de surnageant que possible. Tapotez au besoin pour éliminer les gouttes résiduelles.
    REMARQUE : Après centrifugation, la pastille contient des PBMC, et le surnageant contient des plaquettes et du plasma résiduel.
  11. Verser un tube de 15 mL de la solution 2 (RPMI Medium + 12,5 % d’albumine sérique humaine + 1 μM de flavopiridol) dans le tube conique de 50 mL contenant la pastille de PBMC. Retournez doucement le tube pour remettre en suspension la pastille de cellule.
  12. Aspirer 15 mL de la solution 3 (RPMI Medium + 11,25 % d’albumine sérique humaine + 1 μM de flavopiridol + 10 % de DMSO) à l’aide d’une pipette de transfert. Ajouter goutte à goutte dans le tube de 50 ml.
    REMARQUE : La solution 3 contient du DMSO, qui est toxique pour les cellules à température ambiante. N’ajoutez pas la solution 3 avant qu’elle ne soit prête à être traitée immédiatement.
  13. Retournez doucement le tube 3 fois pour mélanger.
  14. Remplissez chaque cryoflacon pré-étiqueté et pré-réfrigéré avec 1 mL de PBMC à l’aide d’une pipette multi-distributions.
    REMARQUE : Reportez-vous à la vidéo supplémentaire 2 pour une démonstration du fonctionnement d’une pipette à distribution multiple.
  15. Placez les cryoflacons dans un récipient de congélation pré-réfrigéré. Ensuite, placez le récipient dans un congélateur à -80 °C.
  16. Répétez les étapes 1.9 à 1.13 pour chaque patient ou condition de traitement si nécessaire.
  17. Conservez les cryoflacons à l’intérieur du récipient de congélation pendant au moins 12 h, puis transférez-les dans une boîte de stockage étiquetée à -80 °C.
    REMARQUE : Vous pouvez également transférer les cryoflacons congelés dans de l’azote liquide (<-135 °C) pour un stockage à long terme.

2. Traitement du plasma et de la couche leucocytaire à partir de tubes EDTA

  1. Centrifugeuse à 1 800 x g pendant 10 min à température ambiante.
    REMARQUE : Après centrifugation, la couche supérieure est constituée de plasma, la couche inférieure contient des érythrocytes et l’interface sera la couche leucocytaire. Voir la figure 1B pour une visualisation.
  2. À l’aide d’une pipette de transfert neuve, prélevez autant de plasma que possible sans perturber la couche de leucoty. Ensuite, versez des aliquotes de 0,5 ml dans des cryoflacons pré-étiquetés. Aspirez la couche leucocytaire et transférez-la dans le cryoflacon correctement étiqueté.
    REMARQUE : Une partie du plasma et des érythrocytes peuvent contaminer la collection de couche leucocytaire.
  3. Répétez l’étape 2.2 pour chaque patient ou condition de traitement au besoin.
  4. Après le prélèvement, conservez les cryoflacons dans un congélateur à -80 °C.
    REMARQUE : Vous pouvez également stocker dans de l’azote liquide (<-135 °C) pour un stockage à long terme.

3. Décongélation des PBMC

  1. Un jour avant la décongélation, imprimez une liste de contrôle des matériaux et des réactifs énumérés au tableau 3 , puis préparez et étiquetez en conséquence.
    REMARQUE : Ce protocole a été conçu pour la décongélation de 1 tube de 1,5 mL contenant 1 mL de PBMC. Chaque tube produit environ 2 millions de PBMC, dont environ 50 % et 20 % seront des lymphocytes et des monocytes vivants, respectivement. Adaptez-vous en conséquence aux besoins expérimentaux. Notez que le nombre absolu de cellules peut différer considérablement entre les patients ou les conditions de traitement.
  2. Transférez les PBMC congelés de l’entreposage à l’aide de glace sèche et décongelez-les dans un incubateur à 37 °C pendant 4 minutes, ou juste avant la dernière décongélation des cristaux de glace.
    REMARQUE : Si vous le souhaitez, une aliquote peut être prélevée pour le comptage des cellules et les mesures de viabilité, comme détaillé à la section 4.
  3. Après la décongélation, ajouter 1 mL de la solution 4 (PBS + 2 mM d’EDTA) dans chaque flacon cryogénique. Ensuite, versez le contenu dans un tube pré-étiqueté de 50 ml contenant 10 ml de solution 4 pour chaque tube PBMC décongelé. Tapotez pour éliminer les gouttes résiduelles.
  4. Placez la crépine cellulaire sur le tube vide de 50 ml, puis versez la suspension cellulaire à travers la crépine cellulaire.
    REMARQUE : Si nécessaire, tapotez légèrement pour briser la tension superficielle.
  5. Centrifuger chaque tube contenant les cellules filtrées à 400 x g pendant 7 min à température ambiante.
  6. Après la centrifugation, versez le surnageant contenant du DMSO. Tapotez au besoin pour éliminer les gouttes résiduelles.
  7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu souhaité adapté aux besoins expérimentaux en aval (p. ex., milieu de culture cellulaire, cocktail d’anticorps de cytométrie en flux, etc.).

4. Comptage et viabilité des cellules

  1. Immédiatement après la décongélation des PBMC congelés à l’étape 3.2, pipeter 20 μL de cellules dans un tube de 1,5 mL. Ajoutez un volume égal de solution de bleu de trypan à 0,4 % et pipetez doucement de haut en bas 3 à 4 fois pour mélanger.
  2. À l’aide d’un compteur de cellules automatisé, suivez le protocole du fabricant pour compter les cellules et évaluer la viabilité. Assurez-vous que le facteur de dilution de 2 est pris en compte.
    REMARQUE : Comme décrit ailleurs, un hémocytomètre peut être utilisé comme méthode alternative pour évaluer le nombre et la viabilité des cellules23.

Results

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Après la collecte et la cryoconservation des PBMC, la viabilité des PBMC, des monocytes et des lymphocytes décongelés de 56 échantillons uniques a été évaluée par cytométrie en flux à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 4 conformément aux instructions du fabricant (figure 2A-F). Une viabilité moyenne ± SD des PBMC, des monocytes et des lymphocytes de 94 ± 4,0 %, 98 ± 1,1 % et 93 ± 5,6 %, respectivement, a été obtenue (figure 2G). La mesure de la viabilité par exclusion du bleu trypan a donné une viabilité moyenne de 88 ± 7,5 % et un nombre de cellules de 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. L’analyse par cytométrie en flux a également démontré que les monocytes vivants représentaient 17 ± 5,9 % et les lymphocytes 53 ± 13,0 % du total des PBMC.

Par la suite, les monocytes ont été triés à partir de PBMC décongelés à partir de 59 échantillons uniques par cytométrie en flux et soumis à la préparation de banques et au séquençage de l’ARN comme décrit ailleurs24. Un nombre total moyen de séquences ± SD de 18,0 ± 16,3 millions a été atteint avec un alignement de lecture de 93 ± 6,3 % et un contenu GC de 49,6 ± 1,4 % (figure 3A-B). Un pourcentage moyen de lectures ± SD cartographié de manière unique de 88 ± 3,6 % a été trouvé avec un sous-ensemble de 56 échantillons uniques. Ces paramètres démontrent que des PBMC hautement viables adaptés aux applications en aval, y compris le séquençage d’ARN de haute qualité, peuvent être obtenus par des opérateurs de tout niveau de formation en laboratoire utilisant ce protocole.

ComposantDensitéCitation
Plasma1,022 g/mL à 1,026 g/mL1
Plaquettes<1,061 g/mL à 1,070 g/mL >2
PBMC<1,077 g/mL6
Neutrophiles de faible densité*<1,077 g/mL3
Granulocytes (neutrophiles*, basophiles et éosinophiles)>1,077 g/mL6
Érythrocytes1,11 g/mL4

Tableau 1 : Composants du sang total classés par ordre de densité décroissante.

Reagant/MatériauQuantité (par 6 tubes CPT et 1 tube EDTA)PourboireMises en garde
CPT Tubes6Étiqueter en fonction de l’ID du patient ou de l’échantillon.
EDTA Tube1Étiqueter en fonction de l’ID du patient ou de l’échantillon.
Tube conique de 50 mL2En plus de l’identification du patient ou de l’échantillon, étiquetez 1 tube pour les PBMC et 1 pour les déchets.
Cryoflacons39Étiquette 30 pour les PBMC, 8 pour le plasma EDTA et 1 pour la couche leucocytaire. Tous les cryoflacons ne peuvent pas être utilisés.
M. Frosty2Remplissez jusqu’à mi-cuisson avec de l’isopropanol et pré-refroidissez toute la nuit à -20°C.L’isopropanol est un irritant inflammable. Tenir à l’écart des étincelles/flammes. Évitez d’inhaler et manipulez avec des gants et des précautions.
Flavopiridol100 μL de stock 1000XPour préparer un stock de flavopiridol 1000X, suspendre 5 mg de flavopiridol dans 1,14 mL de DMSO pour une concentration de 10 mM. Aliquote 200 μL dans des récipients individuels puis congélation. Pour l’utiliser, décongelez les aliquotes individuelles et diluez 1:10 dans de l’eau distillée sans DNase/RNase, puis utilisez-la comme solution 1000X.Le flavopiridol est un irritant. Manipuler avec des gants et des soins.
Solution 150 mlRPMI Moyen.
Pour préparer 50 ml de solution mère, utilisez 50 ml de milieu RPMI.
Solution 215 mlRPMI Medium + 12,5 % d’albumine sérique humaine + 1 μM de flavopiridol.
Pour préparer 50 ml de solution mère, utilisez 25 ml de milieu RPMI + 25 ml d’albumine sérique humaine + 50 μL de flavopirido 1000X.		Le flavopiridol est un irritant. Manipuler avec des gants et des soins.
Solution 315 mlRPMI Medium + 11,25 % d’albumine sérique humaine + 1 μM de flavopiridol + 10 % de DMSO.
Pour préparer 50 mL de solution mère, utilisez 22,5 mL de PMRP moyen + 22,5 mL de HSA + 5 mL de DMSO + 50 μL de flavopiridol 1000X.		Le flavopiridol est un irritant et le DMSO est toxique et est facilement absorbé par la peau. Manipuler avec des gants et des soins.

Tableau 2 : Liste de contrôle des réactifs et des matériaux à préparer et à étiqueter pour la collecte et la cryoconservation des PBMC.

Reagant/MatériauQuantité (par tranche aliquote de 1 mL de PBMC congelés)PourboireMises en garde
Solution 410 mlPBS + 2 mM EDTA

Pour préparer 50 ml de solution mère, utilisez 5 ml de PBS 10X + 200 μL d’EDTA 0,5 M + 44,8 ml d’eau distillée sans DNase/RNase
Tube conique de 50 mL3En plus de l’identification du patient ou de l’échantillon, étiquetez 1 tube pour les PBMC pré-contraints, 1 pour les PBMC post-contraints et 1 pour les déchets. Remplissez le tube étiqueté pour les PBMC pré-colorés avec 9 mL de solution à raison de 4 par mL de PBMC congelés
Tube de 1,5 mL1Pour le comptage cellulaire ; étiquette avec l’identification du patient ou de l’échantillon
0,4 % de Trypan Blue Solution20 μLPour le comptage cellulaire ; peut être ajouté au tube de 1,5 mL à l’avance la veille.Le bleu trypan est cancérigène. Manipuler avec des gants et des soins.

Tableau 3 : Liste de contrôle des réactifs et des matériaux à préparer et à étiqueter pour la décongélation et le comptage des PBMC.

Réactif/MatériauQuantité (par million de cellules)
Teinture vivante5 μL
Confiance humainedans FcX5 μL
Anticorps CD35 μL
Anticorps CD195 μL
Anticorps CD565 μL
Anticorps CD66b5 μL
Anticorps HLA-DR5 μL
Anticorps CD145 μL
Anticorps CD162,5 μL
ARNsine100 unités

Tableau 4 : Tableau des réactifs pour l’isolement des monocytes des PBMC par cytométrie en flux.

Séparation des composants sanguins dans le diagramme de centrifugation à gradient de densité ; plasma, PBMC, couches de couche leucocytaire.
Figure 1 : Composants du sang total séparés par centrifugation dans des tubes de centrifugation à gradient de densité ou EDTA. (A) La centrifugation du sang total dans des tubes de centrifugation à gradient de densité entraîne la séparation du plasma, des plaquettes et des PBMC au-dessus du milieu à gradient de densité avec des érythrocytes multinucléés et des érythrocytes en dessous du milieu à gradient de densité. (B) La centrifugation du sang total dans les tubes EDTA entraîne la séparation du plasma dans la couche supérieure, des érythrocytes dans la couche inférieure et de la couche leucocytaire à l’interface. Créé avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nuages de points de cytométrie en flux ; PBMC, monocytes, lymphocytes ; analyse de viabilité, graphique de type de cellule.
Figure 2 : La viabilité des PBMC cryoconservés décongelés a été évaluée par coloration en flux vivant/mort et cytométrie en flux. (A) Les débris, signalés par un astérisque *, sont exclus des PBMC par des barrières de diffusion avant et latérale. (B) Analyse représentative vivante/morte de PBMC entiers (C) Les panmonocytes sont contrôlés comme HLA-DR positifs et négatifs pour les antigènes de surface suivants marqués par FITC : CD3, CD19, CD56 et CD66b. (D) Analyse représentative vivante/morte des monocytes. (E) Lymphocytes bloqués par les antigènes de surface marqués FITC suivants : CD3, CD19, CD56 et CD 66b. (F) Analyse représentative des lymphocytes vivants/morts. (G) Pourcentage de viabilité de chaque type de cellule quantifié à partir de 56 échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphiques d’analyse de données FastQC ; Million de séquences vs alignable, distribution de contenu GC.
Figure 3 : Qualité du séquençage de l’ARN des monocytes triés à partir de PBMC cryoconservés. 56 échantillons uniques ont été séquencés et une moyenne ± SD 18,0 ± 16,3 millions de séquences totales ont été générées. (A) L’alignement était élevé, avec 92,5 % ± 6,3 % des séquences alignées avec le génome de référence. (B) La teneur en GC de ces séquences était de 49,6 ± 1,4 %. Créé avec FastQC25. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Démonstration de l’utilisation de la centrifugeuse Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 2 : Démonstration du fonctionnement d’une pipette multidistributeur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole de collecte et de cryoconservation des PBMC a été mis en œuvre avec succès par des personnes avec ou sans formation préalable en laboratoire de recherche. Dans notre application, le FACS et le séquençage de l’ARN de monocytes hautement viables purifiés à partir de PBMC stockés ont permis d’obtenir des séquences de haute qualité.

L’une des principales forces de ce protocole est son accessibilité. La technique présentée dans le protocole utilise des tubes pré-remplis d’un milieu à gradient de densité solide. Par conséquent, le sang total peut être prélevé directement dans le tube, puis immédiatement traité pour isoler les PBMC. Un nombre relativement faible de solutions préfabriquées et d’équipements spécialisés est nécessaire, ce qui facilite la collaboration entre le laboratoire de recherche, où les réactifs peuvent être préparés, et le laboratoire clinique, où les échantillons sont collectés et traités. Les protocoles écrits et vidéo s’adressent aux opérateurs de tous niveaux de formation.

Bien que ce protocole utilise du sang total frais pour isoler les PBMC et, par conséquent, ait un rendement et une pureté attendus relativement élevés de >90 %, il peut ne pas convenir à des applications nécessitant des puretés exceptionnellement élevées de >98 %26,27. De plus, les tubes de centrifugation à gradient de densité peuvent être coûteux à obtenir, surtout si un grand nombre d’échantillons doivent être collectés.

Les méthodes alternatives de collecte PBMC comprennent l’utilisation d’un milieu à gradient de densité liquide ou l’appauvrissement immunomagnétique28,29. En bref, le premier consiste à superposer un milieu à gradient de densité préfabriqué sous du sang total héparinisé, suivi d’une centrifugation. Ce dernier utilise des anticorps marqués magnétiquement pour marquer les non-PBMC, qui sont ensuite conservés dans une colonne magnétique tandis que les PBMC non marqués passent à travers sans être affectés.

Par rapport au protocole présenté, l’utilisation d’un milieu à gradient de densité liquide est à la fois moins coûteuse et nécessite beaucoup moins de matériau en raison de l’absence de tubes de centrifugation à gradient de densité ; L’isolement PBMC peut être effectué dans un tube standard de 50 mL8. Cependant, cette technique est plus élaborée, a un temps de traitement plus long et peut être sujette à un risque d’erreur utilisateur plus élevé. L’héparine doit être ajoutée avec précision pour éviter une sur-dilution et le milieu à gradient de densité doit être soigneusement stratifié dans les bonnes quantités pour assurer une bonne séparation PBMC26.

Par rapport au protocole présenté, l’utilisation de la déplétion immunomagnétique offre un rendement et une pureté plus élevés, une manipulation réduite en raison de l’absence de centrifugation, un temps de traitement plus rapide et nécessite beaucoup moins de matériau 30,31,32. Cependant, le principal inconvénient est que cette méthode est la plus coûteuse des trois méthodes décrites, en particulier à grande échelle.

Bien que ce protocole soit robuste, certaines étapes critiques peuvent nécessiter une attention supplémentaire. Tout au long du protocole, assurez-vous que les échantillons ne sont pas mélangés et qu’ils sont placés dans les tubes correctement étiquetés, en particulier lorsque vous travaillez avec plusieurs patients ou affections simultanément. Pour l’étape 1.4, assurez-vous qu’aucun PBMC n’est jeté ; l’excès de plasma ne fera que diminuer la concentration de PBMC, ce qui est moins critique pour maintenir la viabilité et la qualité de l’échantillon. Par ailleurs, la présence de précipités dans les PBMC collectés suggère que des morceaux du milieu à gradient de densité ont été délogés. Pipetez plus doucement à l’étape 1.5 pour éviter ce problème. Aux étapes 1.10 et 3.6, assurez-vous que la pastille de cellule centrifugée n’est pas jetée. Il est essentiel de travailler rapidement pour les étapes 1.12 et 3.3, car la solution 3 contient du DMSO, qui est toxique pour les cellules à température ambiante33. Il est également important de noter que le stockage des PBMC dans de l’azote liquide est recommandé plutôt qu’à -80°C. Le stockage à long terme à -80°C a été associé à une diminution de la viabilité cellulaire et à une altération de l’expression des gènes34,35.

Ce protocole peut être adapté en fonction des besoins expérimentaux. L’ajout de flavopiridol, un inhibiteur de la synthèse de l’ARN polymérase et de l’ARNm, dans les solutions 2 et 3 vise à prévenir toute manipulation et tout artefact induit par le stress avec le séquençage de l’ARN36. Cependant, le flavopiridol peut être omis si des études fonctionnelles ou ex vivo utilisant des PBMC sont souhaitées.

Le plasma prélevé dans les tubes EDTA sera contaminé par l’EDTA, un agent chélateur. Par conséquent, le plasma EDTA ne convient pas aux dosages impliquant la coagulation ou les ions calcium37,38. Si vous le souhaitez, la couche de plasma dans les tubes de milieu à gradient de densité après la centrifugation peut être collectée à l’étape 1.4. Ces tubes contiennent de l’héparine de sodium comme anticoagulant qui peut être éliminé avec l’ajout d’héparinase39. Notamment, l’héparine inhibe la transcriptase inverse et l’amplification de la PCR, ce qui rend le plasma collecté inadapté aux expériences de PCR sans l’ajout d’un agent bloquant l’héparine40.

La couche leucocytaire recueillie dans les tubes EDTA n’est pas stockée dans une solution contenant du DMSO ou du flavopiridol. Le DMSO est important dans la réduction de la formation de cristaux de glace et de la mort cellulaire41. Le flavopiridol est important pour l’inhibition de la synthèse de l’ARN36. Ainsi, la couche leucocytaire est impropre aux analyses ex vivo et transcriptomiques. Si vous le souhaitez, les étapes 1.6 à 1.15 peuvent être effectuées à l’aide d’une couche leucocytaire collectée afin de maximiser la viabilité cellulaire et d’inhiber la synthèse de l’ARN.

Bien que ce protocole ait été conçu pour le séquençage de l’ARN, d’autres applications potentielles des PBMC collectées et cryopréservées à l’aide de ce protocole comprennent la culture cellulaire, l’édition de gènes, les études fonctionnelles ex-vivo, les analyses de cellules uniques, le phénotypage par cytométrie en flux ou cytométrie par temps de vol, l’isolement d’ADN/ARN ou de protéines, les lames pour l’immunohistochimie, entre autres.

Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun intérêt financier ou non financier pertinent à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier les patients qui ont donné leur consentement, leur temps et leur don d’échantillons de sang. Nous remercions également le Dr Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton et Mark McClellen du Centre médical de l’Université du Kansas pour leur collaboration et pour la mise en œuvre de ce protocole sur un site distant. CY a reçu un soutien à la recherche de la subvention NIH 1K08HL150271.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000 et micro ; L EmboutsGilsonF174501Environ 3 embouts nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat Tube
15 mLBiopioneeerCNT-15Pour contenir Solutions 2/3
2 nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Environ 40 cryoflacons nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 & micro ; L EmboutsGilsonF174201Pour une utilisation dans le comptage cellulaire ; le volume nécessaire dépend de la méthode de comptage cellulaire utilisée. 1 embout est nécessaire pour 1 mL de PBMC congelés non regroupés à décongeler
50 mL Tube coniqueCEM Corporation50-187-76832 nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 nécessaires par 1 mL de PBMC congelés non regroupés à décongeler
CD14 AntibodyBiolegend325621
Biolegend d’anticorps CD16360723
Biolegendd’anticorps CD19363007
Biolegendd’anticorps CD3300405
Biolegendd’anticorps CD56318303
Biolegendd’anticorps CD66b305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 nécessaire par 1 ml de PBMC congelés non regroupés à décongeler
Tube de préparation de cellules mononucléées CPTBD Biosciences3627536 tubes nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Peut contenir 81 tubes
1 nécessaire par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryotube RackFisherbrand05-669-45Peut contenir jusqu’à 50 cryoflacons
DMSOInvitrogen15575020Environ 2,5 mL nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat
Eau distillée sans DNase/RNaseInvitrogen10977015Environ 2 mL nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat
Environ 9 mL nécessaires par 1 mL de PBMC congelés à décongeler
EDTA TubesBD Biosciences3666431 tube nécessaire par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DRAntibody Biolegend307609
Human Serum AlbuminGeminiBio800-120Environ 25 mL nécessaires par patient ou condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanolSigma-AldrichW292912-1KG-KPour une utilisation dans l’imprimante d’étiquettes Mr. Frosty
PhomemoM110-WH
Live-Dead StainBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Peut contenir jusqu’à 18 tubes.
2 M. Frostys nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/plasma/Buffy Coat
Pipette multidistributionBrandtech705110
Pointes de pipettemultidistribution Brandtech705744Environ 3 pointes nécessaires par patient/condition de traitement pour la pipette PBMC/plasma/Buffy Coat Collection
P1000GilsonF144059M
P20 PipetteGilsonF144056MPour une utilisation dans le comptage cellulaire ; le volume nécessaire dépend de la méthode de comptage cellulaire utilisée.
Imprimantes ÉtiquettesPhomemoPM-M110-3020Environ 45 étiquettes nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat
Environ 5 étiquettes nécessaires par 1 mL de PBMC congelés non regroupés à décongeler
EDTA sans RNase (0,5 M)InvitrogenAM9260GEnviron 40 µ ; L nécessaire pour 1 mL de PBMC congelés à décongeler
RNase-Free PBS (10X)InvitrogenAM9625Environ 1 mL nécessaire pour 1 mL de PBMC congelés à décongeler
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVEnviron 80 mL nécessaires par patient ou par condition de traitement pour la collection PBMC/plasma/Buffy coat
Pipettes de transfertFisherbrand13-711-7MEnviron 5 nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/plasma/couche leucocytaire
Support de tubeEndicott-Seymour14-781-15Peut contenir jusqu’à 80 tubes CPT/EDTA
de

References

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Peripheral Blood MononuclearPBMC IsolationDensity Gradient CentrifugationCell CryopreservationBuffy CoatEDTA PlasmaFlow CytometryRNA SequencingCell ViabilityMonocyte Sorting

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