Isolement et cryoconservation de cellules mononucléées du sang périphérique humain hautement viables à partir de sang total : un guide pour les débutants

Résumé

Ce protocole présente un guide accessible pour la collecte, le stockage et la décongélation des cellules mononucléées du sang périphérique, adapté aux analyses en aval et aux flux de travail tels que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN. Des collections de plasma et de couche leucocytaire sont également présentées.

Résumé

Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont couramment utilisées dans la recherche biomédicale sur le système immunitaire et sa réponse aux maladies et aux agents pathogènes. Ce protocole détaillé décrit l’équipement, les fournitures et les étapes permettant d’isoler, de cryoconserver et de décongeler des PBMC de haute qualité et hautement viables à partir de cellules sanguines totales adaptées à des applications en aval telles que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN. Des protocoles de traitement du plasma et de la couche leucocytaire à partir du sang entier en parallèle et en même temps que les PBMC sont également décrits. Ce protocole étape par étape facile à suivre, qui utilise la centrifugation par gradient de densité pour isoler les PBMC, est accompagné d’une liste de contrôle des fournitures, de l’équipement et des étapes de préparation. Ce protocole convient aux personnes ayant une expérience préalable des techniques de laboratoire et peut être mis en œuvre dans des laboratoires cliniques ou de recherche. La viabilité cellulaire et le séquençage de l’ARN de haute qualité ont résulté de PBMC collectés par des opérateurs sans expérience préalable en laboratoire de l’utilisation de ce protocole.

Introduction

Ce protocole fait la démonstration d’une méthode et d’un flux de travail accessibles pour l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) du sang total. Ce protocole s’adresse particulièrement aux techniciens de recherche novices, aux étudiants et au personnel de laboratoire clinique dans le but de faciliter la collecte et la cryoconservation des PBMC sans supposer une formation préalable en techniques de laboratoire.

Ce protocole utilise la centrifugation pour séparer les composants du sang total par densité. Le sang total se compose de quatre composants principaux c....

Protocole

Le protocole d’étude a été approuvé par le programme de protection humaine de l’UCSD et du KUMC et est conforme à la Déclaration d’Helsinki. Toutes les personnes ont donné leur consentement éclairé pour la participation et la collecte de sang.

1. Traitement et cryoconservation des PBMC

1. La veille du prélèvement sanguin, imprimez la liste de contrôle des matériaux et des réactifs énumérés au tableau 2 , puis préparez et étiquetez en conséquence.
   REMARQUE : Ce protocole a été conçu pour la collecte de 6 tubes de centrifugation à gradient de densité. Chaque tube pr....

Résultats

Après la collecte et la cryoconservation des PBMC, la viabilité des PBMC, des monocytes et des lymphocytes décongelés de 56 échantillons uniques a été évaluée par cytométrie en flux à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 4 conformément aux instructions du fabricant (figure 2A-F). Une viabilité moyenne ± SD des PBMC, des monocytes et des lymphocytes de 94 ± 4,0 %, 98 ± 1,1 % et 93 ± 5,6 %, respectivement, a été obtenue (figure 2G<.......

Discussion

Ce protocole de collecte et de cryoconservation des PBMC a été mis en œuvre avec succès par des personnes avec ou sans formation préalable en laboratoire de recherche. Dans notre application, le FACS et le séquençage de l’ARN de monocytes hautement viables purifiés à partir de PBMC stockés ont permis d’obtenir des séquences de haute qualité.

L’une des principales forces de ce protocole est son accessibilité. La technique présentée dans le protocole utilise des.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1000 et micro ; L Embouts	Gilson	F174501	Environ 3 embouts nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat Tube
15 mL	Biopioneeer	CNT-15	Pour contenir Solutions 2/3 2 nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL Cryovials	Globe Scientific	3012	Environ 40 cryoflacons nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 & micro ; L Embouts	Gilson	F174201	Pour une utilisation dans le comptage cellulaire ; le volume nécessaire dépend de la méthode de comptage cellulaire utilisée. 1 embout est nécessaire pour 1 mL de PBMC congelés non regroupés à décongeler
50 mL Tube conique	CEM Corporation	50-187-7683	2 nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 nécessaires par 1 mL de PBMC congelés non regroupés à décongeler
CD14 Antibody	Biolegend	325621
Biolegend d’anticorps CD16		360723
Biolegend	d’anticorps CD19	363007
Biolegend	d’anticorps CD3	300405
Biolegend	d’anticorps CD56	318303
Biolegend	d’anticorps CD66b	305103
Cell Strainer	Biopioneeer	DGN258367	1 nécessaire par 1 ml de PBMC congelés non regroupés à décongeler
Tube de préparation de cellules mononucléées CPT	BD Biosciences	362753	6 tubes nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryo Freezer Box	Southern Labware	SB2CC-81	Peut contenir 81 tubes 1 nécessaire par patient/condition de traitement pour PBMC/Plasma/Buffy Coat
Collection Cryotube Rack	Fisherbrand	05-669-45	Peut contenir jusqu’à 50 cryoflacons
DMSO	Invitrogen	15575020	Environ 2,5 mL nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat
Eau distillée sans DNase/RNase	Invitrogen	10977015	Environ 2 mL nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat Environ 9 mL nécessaires par 1 mL de PBMC congelés à décongeler
EDTA Tubes	BD Biosciences	366643	1 tube nécessaire par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat
Flavopiridol	Sigma-Aldrich	F3055-5MG
HLA-DR	Antibody Biolegend	307609
Human Serum Albumin	GeminiBio	800-120	Environ 25 mL nécessaires par patient ou condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat
Human Trustain FcX	Biolegend	422301
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292912-1KG-K	Pour une utilisation dans l’imprimante d’étiquettes Mr. Frosty
	Phomemo	M110-WH
Live-Dead Stain	Biolegend	423105
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Peut contenir jusqu’à 18 tubes. 2 M. Frostys nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/plasma/Buffy Coat
Pipette multidistribution	Brandtech	705110
Pointes de pipette	multidistribution Brandtech	705744	Environ 3 pointes nécessaires par patient/condition de traitement pour la pipette PBMC/plasma/Buffy Coat Collection
P1000	Gilson	F144059M
P20 Pipette	Gilson	F144056M	Pour une utilisation dans le comptage cellulaire ; le volume nécessaire dépend de la méthode de comptage cellulaire utilisée.
Imprimantes Étiquettes	Phomemo	PM-M110-3020	Environ 45 étiquettes nécessaires par patient/condition de traitement pour la collection PBMC/Plasma/Buffy Coat Environ 5 étiquettes nécessaires par 1 mL de PBMC congelés non regroupés à décongeler
EDTA sans RNase (0,5 M)	Invitrogen	AM9260G	Environ 40 µ ; L nécessaire pour 1 mL de PBMC congelés à décongeler
RNase-Free PBS (10X)	Invitrogen	AM9625	Environ 1 mL nécessaire pour 1 mL de PBMC congelés à décongeler
RNasin	Promega	N2111
RPMI	Corning	10-040-CV	Environ 80 mL nécessaires par patient ou par condition de traitement pour la collection PBMC/plasma/Buffy coat
Pipettes de transfert	Fisherbrand	13-711-7M	Environ 5 nécessaires par patient/condition de traitement pour PBMC/plasma/couche leucocytaire
Support de tube	Endicott-Seymour	14-781-15	Peut contenir jusqu’à 80 tubes CPT/EDTA

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