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Article de méthode

Bio-impression intégrée de structures tissulaires à l’aide d’un milieu sous-microgel κ-carraghénane

2.1K vues

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DOI :

10.3791/66806

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3 mai 2024

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1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente un nouveau bain suspendu sous-microgel κ-carraghénane, présentant des propriétés de transition réversibles remarquables de brouillage-déblocage. Ces attributs contribuent à la construction de tissus et d’organes biomimétiques dans la bio-impression 3D intégrée. L’impression réussie de tissus de type cœur/œsophage avec une résolution élevée et une croissance cellulaire démontre des applications de bio-impression et d’ingénierie tissulaire de haute qualité.

Résumé

La bio-impression tridimensionnelle (3D) intégrée utilisant un bain de support d’hydrogel granulaire est apparue comme une technique essentielle pour créer des échafaudages biomimétiques. Cependant, la conception d’un milieu de suspension de gel approprié qui équilibre le dépôt précis de bio-encre avec la viabilité et la fonction cellulaires présente de multiples défis, en particulier pour obtenir les propriétés viscoélastiques souhaitées. Ici, un nouveau bain de support de gel κ-carraghénane est fabriqué grâce à un processus de broyage mécanique facile à utiliser, produisant des particules homogènes à l’échelle submicroscopique. Ces sous-microgels présentent un comportement d’écoulement typique de Bingham avec une faible contrainte d’élasticité et des propriétés d’amincissement par cisaillement rapide, ce qui facilite le dépôt en douceur des bio-encres. De plus, la transition gel-sol réversible et les capacités d’auto-guérison du réseau de microgels κ-carraghénane garantissent l’intégrité structurelle des constructions imprimées, permettant la création de structures tissulaires complexes et multicouches avec des caractéristiques architecturales définies. Après l’impression, les sous-microgels κ-carraghénane peuvent être facilement éliminés par un simple lavage salin tamponné au phosphate. D’autres bio-encres avec des bio-encres chargées de cellules démontrent que les cellules à l’intérieur des constructions biomimétiques ont une viabilité élevée de 92 % et étendent rapidement les pseudopodes, tout en maintenant une prolifération robuste, ce qui indique le potentiel de cette stratégie de bio-impression pour la fabrication de tissus et d’organes. En résumé, ce nouveau milieu sous-microgel κ-carraghénane apparaît comme une voie prometteuse pour la bio-impression intégrée d’une qualité exceptionnelle, ayant de profondes implications pour le développement in vitro de tissus et d’organes modifiés.

Introduction

Les échafaudages d’ingénierie tissulaire, y compris les fibres électro-filées, les éponges poreuses et les hydrogels polymères, jouent un rôle central dans la réparation et la reconstruction des tissus et des organes endommagés en fournissant un cadre structurel soutenant la croissance cellulaire, la régénération des tissus et la restauration de la fonction des organes 1,2,3. Cependant, les échafaudages traditionnels rencontrent des difficultés pour reproduire avec précision les structures des tissus natifs, ce qui entraîne un décalage entre les tissus modifiés et les tissus naturels. Cette limitation entrave la cicatrisation efficace des tissus défectueux, soulignant le besoin urgent de faire progresser la conception des échafaudages pour obtenir un biomimétisme plus précis. La bio-impression tridimensionnelle (3D) est une technique de fabrication innovante qui permet de construire avec précision des structures complexes de tissus biologiques, couche par couche, à l’aide de biomatériaux, d’encres et de cellules4. Parmi divers biomatériaux, les hydrogels polymères apparaissent comme des bio-encres idéales avec leur réseau distinctif qui facilite l’encapsulation in situ des cellules et soutient de manière cruciale leur croissance 5,6. Néanmoins, de nombreux hydrogels mous et hautement hydratés ont tendance à induire un flou ou un effondrement rapide des structures d’échafaudage imprimées pendant le processus d’impression lorsqu’ils sont utilisés comme bio-encres. Pour relever ce défi, la technologie de bio-impression 3D intégrée utilise un bain de microgel comme matériau de support, permettant un dépôt précis de bio-encre douce. Lors de la gélification des bio-encres d’hydrogel, des échafaudages bioniques raffinés avec des structures complexes sont obtenus en retirant le bain de microgel. Des matériaux tels que la gélatine 7,8, l’agarose9 et la gomme gellane10,11 ont été utilisés pour créer des bains de microgels pour la bio-impression 3D intégrée, faisant progresser considérablement l’application des hydrogels souples dans l’ingénierie tissulaire. Cependant, la taille des particules au micron et non uniforme de ces gels particulaires a un impact négatif sur la résolution et la fidélité de l’impression 3D 12,13,14. Il est urgent de fabriquer un flotteur en suspension semblable à un gel avec de petites particules uniformément dispersées, offrant des avantages dans la réalisation d’une bio-impression haute fidélité.

Dans ce protocole, un nouveau bain suspendu sacrificiel de granulés κ-carraghénane avec un niveau submicronique uniforme est présenté pour l’impression 3D intégrée. Ce comportement innovant de bain sub-microgel de transition rapide de blocage-déblocage facilite la fabrication précise d’échafaudages d’hydrogel biomimétiques avec une haute fidélité structurelle15. À l’aide de ce nouveau support de suspension, une série de tissus et d’organes biomimétiques présentant des structures tissulaires multicouches sont imprimés avec succès, à l’aide d’une bio-encre composite composée de méthacrylate de gélatine et de fibrométhacrylate de soie. Dans cette étude, nous avons choisi l’œsophage comme objet biomimétique de bio-impression 3D, principalement parce que l’œsophage a non seulement une structure tissulaire multicouche, mais aussi que sa couche musculaire présente une structure de stratification complexe circulaire interne et longitudinale externe. Assurer un alignement et une organisation corrects de ces couches est essentiel pour la régénération fonctionnelle des tissus. Par conséquent, nous désirons vivement reproduire l’architecture multicouche de l’œsophage. Plus important encore, nous avons utilisé des sous-microgels κ-carraghénane comme bain de suspension et GelMA/SFMA comme bio-encre pour concevoir et construire un échafaudage biomimétique pour l’ingénierie tissulaire. L’œsophage imprimé peut être facilement libéré par un lavage salin tamponné au phosphate répété. De plus, le bain sous-microgel κ-carraghénane est exempt de substances cytotoxiques, assurant une cytocompatibilité élevée15. Les cellules musculaires lisses chargées dans les échafaudages anisotropes présentent une activité d’étalement notable. Ce milieu de suspension submicrogel uniforme offre une nouvelle voie pour la fabrication de tissus et d’organes complexes grâce à la bio-impression 3D intégrée.

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Protocole

1. Préparation du bain de suspension sous-microgel κ-carraghénane

  1. Préparez 500 ml de bain suspendu de κ-carraghénane (0,35 % poids/vol) en ajoutant 1,75 g de poudre de κ-carraghénane dans 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) dans une bouteille en verre de 1 000 ml.
  2. Introduisez une barre d’agitation magnétique de 70 mm dans la bouteille en verre pour mélanger le mélange aqueux. Serrez le bouchon de la bouteille en verre, puis desserrez-le d’un demi-tour.
  3. Placez la bouteille en verre dans un bain-marie à 70 °C et chauffez-la. Allumez l’agitateur magnétique à une vitesse de 300 tr/min, placez la bouteille et remuez jusqu’à ce que le polymère soit complètement dissous.
  4. Prenez une autre bouteille en verre et placez-la dans un autoclave pour la stérilisation, à 121 °C pendant 30 min.
  5. Une fois que le stérilisateur haute pression a refroidi à 80 °C, retirez le flacon du stérilisateur et transférez-le sur l’établi ultra-propre pour une manipulation ultérieure.
  6. Filtrez la solution de κ-carraghénane complètement dissoute dans le flacon en verre stérilisé à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    REMARQUE : Effectuez une filtration rapide pendant que la solution est chaude pour éviter que le κ-carraghénane ne refroidisse et n’obstrue le filtre.
  7. Conserver la solution de κ-carraghénane à 4 °C pour induire une gélification cationique réticulée pendant 12 h.
  8. Broyer mécaniquement les hydrogels κ-carraghénane à l’aide d’un agitateur magnétique de 60 mm avec une vitesse d’agitation de 1200 tr/min à 25 °C jusqu’à ce qu’il se transforme avec succès en un état liquide, ce qui prend environ 60 min.
    REMARQUE : Conservez les hydrogels κ-carraghénane entre 25 et 37 °C pour éviter la gélification à basse température ou la dissolution à haute température.

2. Préparation de bio-encres composites méthacrylate/méthacrylate de soie

  1. Préparez des bio-encres composites en combinant 10 % (poids/vol) de méthacrylate de gélatine (GelMA) et 6 % (poids/vol) de méthacrylate de fibroïne de soie (SFMA) dans une solution de PBS (pH 7,4). Pesez séparément 2,0 g de poudres GelMA et 1,2 g de poudres SFMA.
  2. Ajouter lentement les poudres dans deux tubes à centrifuger de 50 ml. Ajouter 10 ml de solution PBS séparément dans les tubes à centrifuger de 50 ml.
  3. Ajoutez un agitateur magnétique de 10 mm à chacun et remuez et chauffez constamment dans un bain-marie à 45 °C. Laissez les poudres GelMA et SFMA se dissoudre complètement, ce qui prend environ 30 min.
  4. Mélanger les solutions GelMA et SFMA en un volume égal sous agitation continue à 45 °C. Filtrez les bio-encres composites à l’aide d’un filtre de 100 μm de taille de pore.
  5. Stérilisez les bio-encres composites GelMA/SFMA par irradiation UV dans une enceinte de biosécurité pendant 12 h.
    REMARQUE : Préparez et utilisez les bio-encres immédiatement pour éviter la gélification prématurée de la SFMA par auto-assemblage.

3. Caractérisation rhéologique du bain de suspension sub-microgel κ-carraghénane

  1. Démarrer et préparer l’équipement lié à la rhéologie.
    1. Allumez le compresseur d’air pendant 30 minutes et assurez-vous que la pression atteint 30 psi. Retirez la pince de roulement en tournant la tige de traction dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Fixez le couvercle noir en dessous et tournez l’axe du bouton sur le dessus de l’instrument dans le sens des aiguilles d’une montre.
    2. Allumez le rhéomètre et laissez-le s’initialiser. Allumez l’interrupteur de circulation d’eau et laissez la température atteindre 15 °C.
    3. Ouvrez le logiciel de contrôle du rhéomètre pour établir la connexion en ligne.
  2. Calibrez le rhéomètre et installez la géométrie de la plaque parallèle.
    1. Effectuer l’étalonnage de l’instrument dans le logiciel de contrôle, ce qui implique principalement le réglage de la trajectoire d’inertie de l’instrument d’étalonnage. Montez une géométrie de plaque parallèle de 40 mm de diamètre à l’extrémité de la tige de traction. Maintenez le bouton de verrouillage enfoncé pendant 3 secondes pour déplacer l’arbre du moteur en position d’origine pour un placement cohérent de la géométrie.
    2. Sélectionnez le gestionnaire d’étalonnage dans le logiciel de contrôle, puis cliquez sur l’inertie, l’étalonnage de friction et la cartographie de rotation pour étalonner la géométrie de la plaque parallèle.
  3. Mettez à zéro la hauteur de l’espace du rhéomètre en effectuant une procédure standard de mise à zéro de l’écart pour assurer une mesure précise.
  4. Configurez les étapes expérimentales, y compris une rampe d’écoulement allant de 0,01 à 1000 taux de cisaillement 1/s, un balayage d’amplitude allant de 0,1 % à 100 % de déformation à 10 rad/s, un balayage à temps d’oscillation à plusieurs niveaux d’une durée de 60 s avec des déformations alternées de 1 % et 100 % à 10 rad/s, et un balayage Peak Hold à plusieurs étapes d’une durée de 120 s avec un taux de cisaillement alternatif de 0,1 1/s et 10 1/s.
  5. Déposez 2 ml de suspensions de κ-carraghénane à 0,35 % sur la plaque Peltier du rhéomètre.
  6. Positionnez l’espace géométrique à 510 μm et retirez tout trop-plein excessif sur le bord du dispositif de serrage. Réglez l’écart de l’échantillon sur 500 μm pour permettre à l’échantillon de s’étendre légèrement au-delà du bord de la pince.
  7. Effectuez une expérience d’écoulement en sélectionnant la rampe d’écoulement dans les options de conception expérimentale.
    1. Choisissez le test Flow Ramp dans le plan d’expérience. Réglez les taux de cisaillement de 0,001 à 10 1/s à une température de 25 °C.
    2. Effectuez l’étape 3.5 et l’expérience Flow Ramp sur l’échantillon ajouté.
  8. Effectuez un test cyclique de maintien de la crête pour évaluer les performances de récupération du matériau.
    1. Choisissez le balayage Peak Hold dans le plan d’expérience et réglez 5 expériences consécutives avec un temps de 120 s à 25 °C.
    2. Réglez le taux de cisaillement sur 0,01 1/s pour les premier, troisième et cinquième pas et sur 10 1/s pour les deuxième et quatrième pas.
    3. Ajouter un nouvel échantillon de 2 ml. Effectuez l’étape 3.5 et le test de récupération cyclique.
  9. Effectuer une analyse de viscoélasticité pour évaluer la transition potentielle gel-sol du bain de suspension κ-carraghénane.
    1. Choisissez le test Amplitude Sweep dans le plan expérimental. Réglez la contrainte d’oscillation de 0,1 % à 100 % à une température de 25 °C. Cliquez sur Démarrer pour effectuer l’expérience Amplitude Sweep sur l’échantillon ajouté.
  10. Effectuez une analyse de déformation alternative pour évaluer les performances de récupération élastique du matériau.
    1. Choisissez Oscillation Time Sweep dans le plan d’expérience et définissez 5 expériences consécutives avec un temps de 60 s à 25 °C.
    2. Réglez la tension à 1 % pour les première, troisième et cinquième étapes et à 100 % pour les deuxième et quatrième étapes.
    3. Ajouter un nouvel échantillon de 2 ml. Effectuez l’étape 3.5 et le test de récupération cyclique continue.
      REMARQUE : Nettoyez la plaque géométrique et la plaque Peltier après chaque essai et ajoutez un nouvel échantillon de 2 ml.

4. Impression d’échafaudages d’hydrogel biomimétique à l’aide d’une bio-imprimante de micro-extrusion conçue sur mesure

  1. Concevez des cubes au format STL à l’aide d’un logiciel de graphisme 3D et téléchargez des modèles ressemblant à des tissus à partir de la base de données 3D (www.thingiverse.com ; https://3d. nih.gov/.).
    1. Importez les modèles au format STL dans le logiciel PANGO et saisissez les paramètres d’impression. Définissez les coordonnées X, Y et Z spécifiques du modèle dans l’espace 3D, entrez la taille de mise à l’échelle attendue du modèle en millimètres (mm), ajustez la taille et le rapport de mise à l’échelle de l’objet sur les axes X, Y et Z, et ajustez l’angle de rotation du modèle dans l’espace si nécessaire.
    2. Entrez le diamètre estimé du filament (généralement autour de 200-500 μm pour la plupart des bio-encres) dans le champ d’épaisseur de la couche pour déterminer l’épaisseur de l’axe Z de chaque couche. Réglez la vitesse d’impression en fonction de l’épaisseur de ligne attendue (environ 10-90 mm/s) et réglez la densité de remplissage à 30%-80%.
    3. Exportez les paramètres finaux sous forme de code G sur une carte SD.
  2. Faites fonctionner la bio-imprimante et la pompe de micro-extrusion.
    1. Allumez le contrôleur de la pompe de micro-extrusion, sélectionnez le volume de seringue correspondant (5 ml) et réglez le taux d’extrusion à 0,08 ml/min et la durée de l’extrusion en coordination avec le temps d’impression souhaité obtenu en divisant le volume d’hydrogel par le taux d’extrusion.
    2. Insérez la seringue à l’aide d’une aiguille d’un diamètre intérieur de 210 μm dans la fente de la seringue de la bio-imprimante.
    3. Ajustez le contrôleur de seringue pour vous assurer que le piston de la seringue est en contact étroit avec la vis.
    4. Placer 3 ml de bain suspendu dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm. Positionnez l’antenne sur la plate-forme en fonction des paramètres du code et vérifiez que la tête d’impression se trouve à 1 mm au-dessus du bas de l’antenne.
      REMARQUE : Effectuez un pré-test pour vous assurer de la précision des positions des plats sur la plate-forme d’impression pendant l’impression.
    5. Insérez la carte SD contenant le code dans la bio-imprimante 3D, activez le fichier de code, démarrez la bio-imprimante et cliquez sur le bouton Démarrer du contrôleur.
  3. Traitement des constructions
    1. Exposez la construction imprimée à une lumière bleue de 405 nm pendant 1 min pour initier la photoréticulation.
    2. Retirer le gel de κ-carraghénane à l’aide d’une pipette de 1 mL, puis ajouter 3 mL de PBS (pH 7,4) pour le lavage et le retrait ultérieur. Répétez ce processus pour un lavage en profondeur.
      REMARQUE : Effectuez le processus de lavage en douceur pour éviter d’endommager les constructions imprimées.

5. Bio-impression 3D intégrée d’analogues de la couche musculaire de l’œsophage

  1. Culture de cellules musculaires lisses de l’œsophage de lapin (eSMC).
    1. Amorcer la culture dans des flacons T75 avec 2 x 106 cellules à l’aide de 15 mL de milieu DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine.
    2. Maintenir les eSMC à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 et de 95 % d’air jusqu’à ce qu’ils atteignent 80 % de confluence.
  2. Préparation de la couche musculaire de l’œsophage bioink
    1. Aspirez le milieu dès la confluence et lavez les eSMC avec 5 mL de 1x PBS.
    2. Ajouter 2 ml de trypsine-EDTA à 0,2 % dans le ballon et incuber pendant 2 minutes pour digérer les cellules. Tapotez le flacon pour détacher les cellules du mur.
    3. Terminez la digestion en ajoutant 2 ml de DMEM et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml. Mesurez la densité cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules avec 10 μL de suspension cellulaire.
    4. Centrifuger à 675 x g pendant 3 min, aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans les bio-encres composites GelMA/SFMA (comme préparé à l’étape 2.1). Ajustez la concentration finale des cellules pour obtenir une densité de 10 x 106 cellules/mL dans la bio-encre, optimisant ainsi les conditions pour les applications ultérieures de bio-impression 3D.
  3. Préparation de la bio-imprimante 3D et des matériaux associés
    1. Autoclavez les instruments d’impression essentiels, y compris les aiguilles de seringue, les pinces, un agitateur magnétique et une bouteille en verre de silicate de 1000 ml, dans des conditions de stérilisation standard (121 °C pendant 30 min) afin d’assurer un environnement aseptique pour le processus d’impression.
    2. Placez la bio-imprimante à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité et stérilisez-la à la lumière ultraviolette (UV) pendant une durée de 30 minutes pour maintenir la stérilité.
    3. Préparez 50 mL de κ-carraghénane stérile et 5 mL de bio-encres composites GelMA/SFMA stériles, comme décrit à l’étape 1 et à l’étape 2, respectivement.
    4. Concevez le modèle, définissez les paramètres souhaités et préparez la bio-imprimante comme indiqué à l’étape 4.1.
  4. Lancement du processus de bio-impression
    1. Effectuez les procédures décrites aux étapes 4.2 et 4.3 pour bio-imprimer la couche musculaire œsophagienne en 3D, suivie d’un lavage et d’un remplacement du PBS.
    2. Effectuez l’impression cellulaire avec des techniques stériles tout au long du processus d’impression afin de minimiser le risque de contamination cellulaire de la structure imprimée.
  5. Remplacement du milieu de culture cellulaire après l’impression
    1. Aspirez soigneusement le PBS et remplacez-le par 3 ml de DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine. Assurez-vous que les constructions imprimées sont entièrement immergées pour fournir des conditions de croissance cellulaire optimales.
    2. Incuber la boîte de culture cellulaire contenant les constructions imprimées dans un incubateur réglé à 37 °C avec 5% de CO2. Remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu frais tous les jours, en utilisant 3 ml à chaque fois, et surveillez l’état des cellules à l’intérieur des constructions à l’aide de la microscopie optique.

6. Évaluation de la viabilité des eSMC au sein des constructions imprimées via la coloration par dosage Live/Dead

  1. Retirer le milieu de culture cellulaire après 5 h d’incubation et laver les constructions chargées de cellules avec du PBS.
  2. Ajouter 2 mL de la solution standard de calcéine-AM/iodure de propidium (1:1000) dans les constructions chargées de cellules imprimées et incuber.
  3. Lavez les constructions 3 fois avec du PBS après une incubation de 45 minutes, puis ajoutez un milieu de culture cellulaire frais.
  4. Observez les cellules vivantes et mortes et capturez des images fluorescentes à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM).

7. Observation des eSMC au sein des constructions imprimées via coloration FITC-Phalloidin/DAPI

  1. Teindre les constructions imprimées à l’aide de la phalloïdine (verte) marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour la F-actine et de la 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, bleu) pour le nucléaire après 5 jours d’incubation.
  2. Préparation de la solution de fixation
    1. Combinez 4 ml de 1x PBS avec 0,16 ml de paraformaldéhyde (PFA) dans un tube de polyéthylène (PE) de 5 ml, en obtenant une concentration finale de 4 %.
    2. Placez la boîte de culture contenant les constructions bio-imprimées sur une surface propre. Retirez le milieu et recouvrez délicatement les constructions avec la solution PFA, assurant ainsi leur immersion complète. Laissez la fixation se poursuivre à température ambiante pendant 20 minutes avant de jeter la solution.
      REMARQUE : Manipulez les liquides avec soin pendant les processus d’ajout et de retrait afin de préserver l’intégrité structurelle des constructions bio-imprimées.
    3. Introduisez 2,5 ml de 1x PBS dans la boîte de culture, en immergeant complètement les constructions pour éliminer tous les réactifs de coloration résiduels.
  3. Perméabilisation de la membrane cellulaire
    1. Formuler une solution de Triton X-100 à 0,5 % en ajoutant 20 μL de Triton X-100 à 4 mL de 1x PBS dans un tube PE de 5 mL.
    2. Administrez la solution de Triton X-100 aux constructions pendant 30 minutes à température ambiante pour imprégner les membranes cellulaires, puis retirez la solution.
    3. Introduisez 2,5 ml de 1x PBS dans la boîte de culture, en immergeant complètement les constructions pour éliminer tous les réactifs de coloration résiduels.
  4. Blocage des liaisons non spécifiques
    1. Créez une solution bloquant l’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % dans un tube PE de 5 mL en ajoutant 0,12 mL de BSA à 4 mL de PBS 1x.
    2. Introduire la solution BSA dans les constructions pendant 30 min à température ambiante pour bloquer les sites non spécifiques, puis jeter la solution.
  5. Coloration de l’actine avec FITC-Phalloïdine
    1. Préparez une solution de FITC-phalloïdine à 0,2 % dans un tube PE de 5 mL avec 4 mL de 1x PBS et 8 μL de réactif de coloration.
    2. Immergez les constructions dans cette solution pendant 60 minutes à température ambiante dans l’obscurité, puis jetez la solution.
    3. Ajoutez 2,5 ml de 1x PBS dans la boîte de culture, en immergeant complètement les constructions pour éliminer les réactifs de coloration résiduels.
  6. Coloration nucléaire au DAPI
    1. Appliquez 4 mL de solution de coloration DAPI sur les constructions, en assurant une couverture complète.
    2. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 20 min avant de retirer la solution DAPI.
  7. Lavage final et immersion dans le PBS : Ajouter 2,5 ml de 1 x PBS dans la boîte de culture, en immergeant complètement les constructions pour éliminer les réactifs de coloration résiduels.
    REMARQUE : Préparez les solutions de coloration à l’avance et manipulez-les doucement. À aucun moment, les cellules ne doivent subir de dessiccation dans le récipient de culture.
  8. Observez à l’aide d’un microscope confocal : Inspectez et imagez les constructions colorées à l’aide de la microscopie confocale pour évaluer la croissance cellulaire, garantissant ainsi une documentation complète des résultats.

8. Évaluation de la prolifération des eSMC dans les constructions imprimées à l’aide du test CCK-8

  1. Retirer le milieu de culture des constructions les jours 7 et 14. Lavez les constructions avec du PBS pour éliminer le milieu résiduel et les cellules détachées.
  2. Ajouter la solution CCK-8 à chaque construction en suivant les instructions du fabricant. Assurez-vous que le volume de la solution CCK-8 est suffisant pour couvrir complètement chaque construction.
  3. Incuber les constructions avec la solution CCK-8 à 37 °C pendant 2 h. Après l’incubation, transférez soigneusement le surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits.
  4. Mesurez l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

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Résultats

Le bain de gel granulaire κ-carraghénane a été généré en brisant mécaniquement les hydrogels en vrac en une suspension de gel particulaire. L’étude la plus récente a démontré que les particules de κ-carraghénane présentaient un diamètre moyen d’environ 642 ± 65 nm avec des morphologies uniformes à 1000 tr/min de mélange mécanique15, significativement plus petites que les dimensions des microgels précédemment rapportées dans la littérature 16,17,18

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Discussion

La préparation de bains de suspension sub-microgel κ-carraghénane pour une utilisation dans la bio-impression est un processus soigneusement orchestré qui implique plusieurs étapes critiques pour s’assurer que le support résultant présente les propriétés souhaitées pour soutenir les bio-encres. Initialement, une solution de κ-carraghénane est préparée en dissolvant la poudre de κ-carraghénane dans de l’eau désionisée à des températures élevées, créant ainsi un ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier dans les produits décrits dans ce manuscrit.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par la Fondation des sciences naturelles de Ningbo (2022J121, 2023J159), le projet clé de la Fondation des sciences naturelles de la ville de Ningbo (2021J256), la Fondation ouverte du Laboratoire clé d’État d’ingénierie moléculaire des polymères (Université Fudan) (K2024-35) et le Laboratoire clé de médecine de précision pour les maladies athéroscléreuses de la province du Zhejiang, Chine (2022E10026). Merci pour le soutien technique des installations centrales, Centre des sciences de la santé de l’Université de Ningbo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bio-imprimante 3Dsur mesure
Solarbio Life ScienceC0065prête à l’emploi
EFLXY-WJ01
Compteur de cellulesCorningCyto smart 6749
Microscope confocal à balayage laserLeicaSTELLARIS 5
DMEM hyperglucoseVivaCellC3113-0500Glycémie élevée, avec pyruvate de sodium et L-glutamine
Rhéomètre rotatif dynamiqueTA InstrumentDiscovery HR-20
Cellules musculaires lisses de l’œsophageFourni par le Département de biologie cellulaire et de médecine régénérative, Centre des sciences de la santé, UniversitéCellules primaires de l’œsophage
de lapin Sérum fœtal bovinUEF9070L
Isothiocyanate de fluorescéine marqué à la phalloïdineSolarbio Life ScienceCA1610300T
Méthacrylate de gélatineEFL EFL-GM-6060 % substitution
k-carraghénaneAladdinC121013-100gLithium
Phényle de qualité réactif (2,4,6-triméthylbenzoyl) phosphinateAladdinL157759-1g365~405 nm
Kit Live-DeadbeyotimeC2015M
Lecteur de microplaquesPotenovPT-3502B
ParaformaldéhydeSolarbio Life ScienceP1110  ;4 %
Pénicilline/streptomycineSolarbio Life ScienceMA0110100 &aiguë ;
Solution saline tamponnée au phosphateVivaCellC3580-0500pH 7,2-7,4
Méthacrylate de fibroïne de soieEFLEFL-SilMA-001Substitution de 39
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Trypsine-EDTAVivaCellC100C10,25 %, sans rouge de phénol
4',6-Diamidino-2-Phénylindole conçue Lumière UV 405 nm de Ningbo  %

Références

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