Article de méthode

Bio-impression intégrée de structures tissulaires à l’aide d’un milieu sous-microgel κ-carraghénane

DOI :

10.3791/66806

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3 mai 2024

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1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude présente un nouveau bain suspendu sous-microgel κ-carraghénane, présentant des propriétés de transition réversibles remarquables de brouillage-déblocage. Ces attributs contribuent à la construction de tissus et d’organes biomimétiques dans la bio-impression 3D intégrée. L’impression réussie de tissus de type cœur/œsophage avec une résolution élevée et une croissance cellulaire démontre des applications de bio-impression et d’ingénierie tissulaire de haute qualité.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La bio-impression tridimensionnelle (3D) intégrée utilisant un bain de support d’hydrogel granulaire est apparue comme une technique essentielle pour créer des échafaudages biomimétiques. Cependant, la conception d’un milieu de suspension de gel approprié qui équilibre le dépôt précis de bio-encre avec la viabilité et la fonction cellulaires présente de multiples défis, en particulier pour obtenir les propriétés viscoélastiques souhaitées. Ici, un nouveau bain de support de gel κ-carraghénane est fabriqué grâce à un processus de broyage mécanique facile à utiliser, produisant des particules homogènes à l’échelle submicroscopique. Ces sous-microgels présentent un comportement d’écoulement typique de Bingham avec une faible contrainte d’élasticité et des propriétés d’amincissement par cisaillement rapide, ce qui facilite le dépôt en douceur des bio-encres. De plus, la transition gel-sol réversible et les capacités d’auto-guérison du réseau de microgels κ-carraghénane garantissent l’intégrité structurelle des constructions imprimées, permettant la création de structures tissulaires complexes et multicouches avec des caractéristiques architecturales définies. Après l’impression, les sous-microgels κ-carraghénane peuvent être facilement éliminés par un simple lavage salin tamponné au phosphate. D’autres bio-encres avec des bio-encres chargées de cellules démontrent que les cellules à l’intérieur des constructions biomimétiques ont une viabilité élevée de 92 % et étendent rapidement les pseudopodes, tout en maintenant une prolifération robuste, ce qui indique le potentiel de cette stratégie de bio-impression pour la fabrication de tissus et d’organes. En résumé, ce nouveau milieu sous-microgel κ-carraghénane apparaît comme une voie prometteuse pour la bio-impression intégrée d’une qualité exceptionnelle, ayant de profondes implications pour le développement in vitro de tissus et d’organes modifiés.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les échafaudages d’ingénierie tissulaire, y compris les fibres électro-filées, les éponges poreuses et les hydrogels polymères, jouent un rôle central dans la réparation et la reconstruction des tissus et des organes endommagés en fournissant un cadre structurel soutenant la croissance cellulaire, la régénération des tissus et la restauration de la fonction des organes 1,2,3. Cependant, les échafaudages traditionnels rencontrent des difficultés pour reproduire avec précision les structures des tissus natifs, ce qui entraîne un décalage entre les tissus modifiés et les tissus naturels. Cette limitation entrave la cicatrisation efficace des tissus défectueux, soulignant le besoin urgent de faire progresser la conception des échafaudages pour obtenir un biomimétisme plus précis. La bio-impression tridimensionnelle (3D) est une technique de fabrication innovante qui permet de construire avec précision des structures complexes de tissus biologiques, couche par couche, à l’aide de biomatériaux, d’encres et de cellules4. Parmi divers biomatériaux, les hydrogels polymères apparaissent comme des bio-encres idéales avec leur réseau distinctif qui facilite l’encapsulation in situ des cellules et soutient de manière cruciale leur croissance 5,6. Néanmoins, de nombreux hydrogels mous et hautement hydratés ont tendance à induire un flou ou un effondrement rapide des structures d’échafaudage imprimées pendant le processus d’impression lorsqu’ils sont utilisés comme bio-encres. Pour relever ce défi, la technologie de bio-impression 3D intégrée utilise un bain de microgel comme matériau de support, permettant un dépôt précis de bio-encre douce. Lors de la gélification des bio-encres d’hydrogel, des échafaudages bioniques raffinés avec des structures complexes sont obtenus en retirant le bain de microgel. Des matériaux tels que la gélatine 7,8, l’agarose9 et la gomme gellane10,11 ont été utilisés pour créer des bains de microgels pour la bio-impression 3D intégrée, faisant progresser considérablement l’application des hydrogels souples dans l’ingénierie tissulaire. Cependant, la taille des particules au micron et non uniforme de ces gels particulaires a un impact négatif sur la résolution et la fidélité de l’impression 3D 12,13,14. Il est urgent de fabriquer un flotteur en suspension semblable à un gel avec de petites particules uniformément dispersées, offrant des avantages dans la réalisation d’une bio-impression haute fidélité.

Dans ce protocole, un nouveau bain suspendu sacrificiel de granulés κ-carraghénane avec un niveau submicronique uniforme est présenté pour l’impression 3D intégrée. Ce comportement innovant de bain sub-microgel de transition rapide de blocage-déblocage facilite la fabrication précise d’échafaudages d’hydrogel biomimétiques avec une haute fidélité structurelle15. À l’aide de ce nouveau support de suspension, une série de tissus et d’organes biomimétiques présentant des structures tissulaires multicouches sont imprimés avec succès, à l’aide d’une bio-encre composite composée de méthacrylate de gélatine et de fibrométhacrylate de soie. Dans cette étude, nous avons choisi l’œsophage comme objet biomimétique de bio-impression 3D, principalement parce que l’œsophage a non seulement une structure tissulaire multicouche, mais aussi que sa couche musculaire présente une structure de stratification complexe circulaire interne et longitudinale externe. Assurer un alignement et une organisation corrects de ces couches est essentiel pour la régénération fonctionnelle des tissus. Par conséquent, nous désirons vivement reproduire l’architecture multicouche de l’œsophage. Plus important encore, nous avons utilisé des sous-microgels κ-carraghénane comme bain de suspension et GelMA/SFMA comme bio-encre pour concevoir et construire un échafaudage biomimétique pour l’ingénierie tissulaire. L’œsophage imprimé peut être facilement libéré par un lavage salin tamponné au phosphate répété. De plus, le bain sous-microgel κ-carraghénane est exempt de substances cytotoxiques, assurant une cytocompatibilité élevée15. Les cellules musculaires lisses chargées dans les échafaudages anisotropes présentent une activité d’étalement notable. Ce milieu de suspension submicrogel uniforme offre une nouvelle voie pour la fabrication de tissus et d’organes complexes grâce à la bio-impression 3D intégrée.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation du bain de suspension sous-microgel κ-carraghénane

  1. Préparez 500 ml de bain suspendu de κ-carraghénane (0,35 % poids/vol) en ajoutant 1,75 g de poudre de κ-carraghénane dans 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) dans une bouteille en verre de 1 000 ml.
  2. Introduisez une barre d’agitation magnétique de 70 mm dans la bouteille en verre pour mélanger le mélange aqueux. Serrez le bouchon de la bouteille en verre, puis desserrez-le d’un demi-tour.
  3. Placez la bouteille en verre dans un bain-marie à 70 °C et chauffez-la. Allumez l’agitateur magnétique à une vitesse de 300 tr/min, placez la bouteille et remuez jusqu’à ce que le polymère soit complètement dissous.
  4. Prenez une autre bouteille en verre et placez-la dans un autoclave pour la stérilisation, à 121 °C pendant 30 min.
  5. Une fois que le stérilisateur haute pression a refroidi à 80 °C, retirez le flacon du stérilisateur et transférez-le sur l’établi ultra-propre pour une manipulation ultérieure.
  6. Filtrez la solution de κ-carraghénane complètement dissoute dans le flacon en verre stérilisé à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
    REMARQUE : Effectuez une filtration rapide pendant que la solution est chaude pour éviter que le κ-carraghénane ne refroidisse et n’obstrue le filtre.
  7. Conserver la solution de κ-carraghénane à 4 °C pour induire une gélification cationique réticulée pendant 12 h.
  8. Broyer mécaniquement les hydrogels κ-carraghénane à l’aide d’un agitateur magnétique de 60 mm avec une vitesse d’agitation de 1200 tr/min à 25 °C jusqu’à ce qu’il se transforme avec succès en un état liquide, ce qui prend environ 60 min.
    REMARQUE : Conservez les hydrogels κ-carraghénane entre 25 et 37 °C pour éviter la gélification à basse température ou la dissolution à haute température.

2. Préparation de bio-encres composites méthacrylate/méthacrylate de soie

  1. Préparez des bio-encres composites en combinant 10 % (poids/vol) de méthacrylate de gélatine (GelMA) et 6 % (poids/vol) de méthacrylate de fibroïne de soie (SFMA) dans une solution de PBS (pH 7,4). Pesez séparément 2,0 g de poudres GelMA et 1,2 g de poudres SFMA.
  2. Ajouter lentement les poudres dans deux tubes à centrifuger de 50 ml. Ajouter 10 ml de solution PBS séparément dans les tubes à centrifuger de 50 ml.
  3. Ajoutez un agitateur magnétique de 10 mm à chacun et remuez et chauffez constamment dans un bain-marie à 45 °C. Laissez les poudres GelMA et SFMA se dissoudre complètement, ce qui prend environ 30 min.
  4. Mélanger les solutions GelMA et SFMA en un volume égal sous agitation continue à 45 °C. Filtrez les bio-encres composites à l’aide d’un filtre de 100 μm de taille de pore.
  5. Stérilisez les bio-encres composites GelMA/SFMA par irradiation UV dans une enceinte de biosécurité pendant 12 h.
    REMARQUE : Préparez et utilisez les bio-encres immédiatement pour éviter la gélification prématurée de la SFMA par auto-assemblage.

3. Caractérisation rhéologique du bain de suspension sub-microgel κ-carraghénane

  1. Démarrer et préparer l’équipement lié à la rhéologie.
    1. Allumez le compresseur d’air pendant 30 minutes et assurez-vous que la pression atteint 30 psi. Retirez la pince de roulement en tournant la tige de traction dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Fixez le couvercle noir en dessous et tournez l’axe du bouton sur le dessus de l’instrument dans le sens des aiguilles d’une montre.
    2. Allumez le rhéomètre et laissez-le s’initialiser. Allumez l’interrupteur de circulation d’eau et laissez la température atteindre 15 °C.
    3. Ouvrez le logiciel de contrôle du rhéomètre pour établir la connexion en ligne.
  2. Calibrez le rhéomètre et installez la géométrie de la plaque parallèle.
    1. Effectuer l’étalonnage de l’instrument dans le logiciel de contrôle, ce qui implique principalement le réglage de la trajectoire d’inertie de l’instrument d’étalonnage. Montez une géométrie de plaque parallèle de 40 mm de diamètre à l’extrémité de la tige de traction. Maintenez le bouton de verrouillage enfoncé pendant 3 secondes pour déplacer l’arbre du moteur en position d’origine pour un placement cohérent de la géométrie.
    2. Sélectionnez le gestionnaire d’étalonnage dans le logiciel de contrôle, puis cliquez sur l’inertie, l’étalonnage de friction et la cartographie de rotation pour étalonner la géométrie de la plaque parallèle.
  3. Mettez à zéro la hauteur de l’espace du rhéomètre en effectuant une procédure standard de mise à zéro de l’écart pour assurer une mesure précise.
  4. Configurez les étapes expérimentales, y compris une rampe d’écoulement allant de 0,01 à 1000 taux de cisaillement 1/s, un balayage d’amplitude allant de 0,1 % à 100 % de déformation à 10 rad/s, un balayage à temps d’oscillation à plusieurs niveaux d’une durée de 60 s avec des déformations alternées de 1 % et 100 % à 10 rad/s, et un balayage Peak Hold à plusieurs étapes d’une durée de 120 s avec un taux de cisaillement alternatif de 0,1 1/s et 10 1/s.
  5. Déposez 2 ml de suspensions de κ-carraghénane à 0,35 % sur la plaque Peltier du rhéomètre.
  6. Positionnez l’espace géométrique à 510 μm et retirez tout trop-plein excessif sur le bord du dispositif de serrage. Réglez l’écart de l’échantillon sur 500 μm pour permettre à l’échantillon de s’étendre légèrement au-delà du bord de la pince.
  7. Effectuez une expérience d’écoulement en sélectionnant la rampe d’écoulement dans les options de conception expérimentale.
    1. Choisissez le test Flow Ramp dans le plan d’expérience. Réglez les taux de cisaillement de 0,001 à 10 1/s à une température de 25 °C.
    2. Effectuez l’étape 3.5 et l’expérience Flow Ramp sur l’échantillon ajouté.
  8. Effectuez un test cyclique de maintien de la crête pour évaluer les performances de récupération du matériau.
    1. Choisissez le balayage Peak Hold dans le plan d’expérience et réglez 5 expériences consécutives avec un temps de 120 s à 25 °C.
    2. Réglez le taux de cisaillement sur 0,01 1/s pour les premier, troisième et cinquième pas et sur 10 1/s pour les deuxième et quatrième pas.
    3. Ajouter un nouvel échantillon de 2 ml. Effectuez l’étape 3.5 et le test de récupération cyclique.
  9. Effectuer une analyse de viscoélasticité pour évaluer la transition potentielle gel-sol du bain de suspension κ-carraghénane.
    1. Choisissez le test Amplitude Sweep dans le plan expérimental. Réglez la contrainte d’oscillation de 0,1 % à 100 % à une température de 25 °C. Cliquez sur Démarrer pour effectuer l’expérience Amplitude Sweep sur l’échantillon ajouté.
  10. Effectuez une analyse de déformation alternative pour évaluer les performances de récupération élastique du matériau.
    1. Choisissez Oscillation Time Sweep dans le plan d’expérience et définissez 5 expériences consécutives avec un temps de 60 s à 25 °C.
    2. Réglez la tension à 1 % pour les première, troisième et cinquième étapes et à 100 % pour les deuxième et quatrième étapes.
    3. Ajouter un nouvel échantillon de 2 ml. Effectuez l’étape 3.5 et le test de récupération cyclique continue.
      REMARQUE : Nettoyez la plaque géométrique et la plaque Peltier après chaque essai et ajoutez un nouvel échantillon de 2 ml.

4. Impression d’échafaudages d’hydrogel biomimétique à l’aide d’une bio-imprimante de micro-extrusion conçue sur mesure

  1. Concevez des cubes au format STL à l’aide d’un logiciel de graphisme 3D et téléchargez des modèles ressemblant à des tissus à partir de la base de données 3D (www.thingiverse.com ; https://3d. nih.gov/.).
    1. Importez les modèles au format STL dans le logiciel PANGO et saisissez les paramètres d’impression. Définissez les coordonnées X, Y et Z spécifiques du modèle dans l’espace 3D, entrez la taille de mise à l’échelle attendue du modèle en millimètres (mm), ajustez la taille et le rapport de mise à l’échelle de l’objet sur les axes X, Y et Z, et ajustez l’angle de rotation du modèle dans l’espace si nécessaire.
    2. Entrez le diamètre estimé du filament (généralement autour de 200-500 μm pour la plupart des bio-encres) dans le champ d’épaisseur de la couche pour déterminer l’épaisseur de l’axe Z de chaque couche. Réglez la vitesse d’impression en fonction de l’épaisseur de ligne attendue (environ 10-90 mm/s) et réglez la densité de remplissage à 30%-80%.
    3. Exportez les paramètres finaux sous forme de code G sur une carte SD.
  2. Faites fonctionner la bio-imprimante et la pompe de micro-extrusion.
    1. Allumez le contrôleur de la pompe de micro-extrusion, sélectionnez le volume de seringue correspondant (5 ml) et réglez le taux d’extrusion à 0,08 ml/min et la durée de l’extrusion en coordination avec le temps d’impression souhaité obtenu en divisant le volume d’hydrogel par le taux d’extrusion.
    2. Insérez la seringue à l’aide d’une aiguille d’un diamètre intérieur de 210 μm dans la fente de la seringue de la bio-imprimante.
    3. Ajustez le contrôleur de seringue pour vous assurer que le piston de la seringue est en contact étroit avec la vis.
    4. Placer 3 ml de bain suspendu dans une boîte de culture cellulaire de 35 mm. Positionnez l’antenne sur la plate-forme en fonction des paramètres du code et vérifiez que la tête d’impression se trouve à 1 mm au-dessus du bas de l’antenne.
      REMARQUE : Effectuez un pré-test pour vous assurer de la précision des positions des plats sur la plate-forme d’impression pendant l’impression.
    5. Insérez la carte SD contenant le code dans la bio-imprimante 3D, activez le fichier de code, démarrez la bio-imprimante et cliquez sur le bouton Démarrer du contrôleur.
  3. Traitement des constructions
    1. Exposez la construction imprimée à une lumière bleue de 405 nm pendant 1 min pour initier la photoréticulation.
    2. Retirer le gel de κ-carraghénane à l’aide d’une pipette de 1 mL, puis ajouter 3 mL de PBS (pH 7,4) pour le lavage et le retrait ultérieur. Répétez ce processus pour un lavage en profondeur.
      REMARQUE : Effectuez le processus de lavage en douceur pour éviter d’endommager les constructions imprimées.

5. Bio-impression 3D intégrée d’analogues de la couche musculaire de l’œsophage

  1. Culture de cellules musculaires lisses de l’œsophage de lapin (eSMC).
    1. Amorcer la culture dans des flacons T75 avec 2 x 106 cellules à l’aide de 15 mL de milieu DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine.
    2. Maintenir les eSMC à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 et de 95 % d’air jusqu’à ce qu’ils atteignent 80 % de confluence.
  2. Préparation de la couche musculaire de l’œsophage bioink
    1. Aspirez le milieu dès la confluence et lavez les eSMC avec 5 mL de 1x PBS.
    2. Ajouter 2 ml de trypsine-EDTA à 0,2 % dans le ballon et incuber pendant 2 minutes pour digérer les cellules. Tapotez le flacon pour détacher les cellules du mur.
    3. Terminez la digestion en ajoutant 2 ml de DMEM et transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml. Mesurez la densité cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules avec 10 μL de suspension cellulaire.
    4. Centrifuger à 675 x g pendant 3 min, aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans les bio-encres composites GelMA/SFMA (comme préparé à l’étape 2.1). Ajustez la concentration finale des cellules pour obtenir une densité de 10 x 106 cellules/mL dans la bio-encre, optimisant ainsi les conditions pour les applications ultérieures de bio-impression 3D.
  3. Préparation de la bio-imprimante 3D et des matériaux associés
    1. Autoclavez les instruments d’impression essentiels, y compris les aiguilles de seringue, les pinces, un agitateur magnétique et une bouteille en verre de silicate de 1000 ml, dans des conditions de stérilisation standard (121 °C pendant 30 min) afin d’assurer un environnement aseptique pour le processus d’impression.
    2. Placez la bio-imprimante à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité et stérilisez-la à la lumière ultraviolette (UV) pendant une durée de 30 minutes pour maintenir la stérilité.
    3. Préparez 50 mL de κ-carraghénane stérile et 5 mL de bio-encres composites GelMA/SFMA stériles, comme décrit à l’étape 1 et à l’étape 2, respectivement.
    4. Concevez le modèle, définissez les paramètres souhaités et préparez la bio-imprimante comme indiqué à l’étape 4.1.
  4. Lancement du processus de bio-impression
    1. Effectuez les procédures décrites aux étapes 4.2 et 4.3 pour bio-imprimer la couche musculaire œsophagienne en 3D, suivie d’un lavage et d’un remplacement du PBS.
    2. Effectuez l’impression cellulaire avec des techniques stériles tout au long du processus d’impression afin de minimiser le risque de contamination cellulaire de la structure imprimée.
  5. Remplacement du milieu de culture cellulaire après l’impression
    1. Aspirez soigneusement le PBS et remplacez-le par 3 ml de DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline/streptomycine. Assurez-vous que les constructions imprimées sont entièrement immergées pour fournir des conditions de croissance cellulaire optimales.
    2. Incuber la boîte de culture cellulaire contenant les constructions imprimées dans un incubateur réglé à 37 °C avec 5% de CO2. Remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu frais tous les jours, en utilisant 3 ml à chaque fois, et surveillez l’état des cellules à l’intérieur des constructions à l’aide de la microscopie optique.

6. Évaluation de la viabilité des eSMC au sein des constructions imprimées via la coloration par dosage Live/Dead

  1. Retirer le milieu de culture cellulaire après 5 h d’incubation et laver les constructions chargées de cellules avec du PBS.
  2. Ajouter 2 mL de la solution standard de calcéine-AM/iodure de propidium (1:1000) dans les constructions chargées de cellules imprimées et incuber.
  3. Lavez les constructions 3 fois avec du PBS après une incubation de 45 minutes, puis ajoutez un milieu de culture cellulaire frais.
  4. Observez les cellules vivantes et mortes et capturez des images fluorescentes à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM).

7. Observation des eSMC au sein des constructions imprimées via coloration FITC-Phalloidin/DAPI

  1. Teindre les constructions imprimées à l’aide de la phalloïdine (verte) marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour la F-actine et de la 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, bleu) pour le nucléaire après 5 jours d’incubation.
  2. Préparation de la solution de fixation
    1. Combinez 4 ml de 1x PBS avec 0,16 ml de paraformaldéhyde (PFA) dans un tube de polyéthylène (PE) de 5 ml, en obtenant une concentration finale de 4 %.
    2. Placez la boîte de culture contenant les constructions bio-imprimées sur une surface propre. Retirez le milieu et recouvrez délicatement les constructions avec la solution PFA, assurant ainsi leur immersion complète. Laissez la fixation se poursuivre à température ambiante pendant 20 minutes avant de jeter la solution.
      REMARQUE : Manipulez les liquides avec soin pendant les processus d’ajout et de retrait afin de préserver l’intégrité structurelle des constructions bio-imprimées.
    3. Introduisez 2,5 ml de 1x PBS dans la boîte de culture, en immergeant complètement les constructions pour éliminer tous les réactifs de coloration résiduels.
  3. Perméabilisation de la membrane cellulaire
    1. Formuler une solution de Triton X-100 à 0,5 % en ajoutant 20 μL de Triton X-100 à 4 mL de 1x PBS dans un tube PE de 5 mL.
    2. Administrez la solution de Triton X-100 aux constructions pendant 30 minutes à température ambiante pour imprégner les membranes cellulaires, puis retirez la solution.
    3. Introduisez 2,5 ml de 1x PBS dans la boîte de culture, en immergeant complètement les constructions pour éliminer tous les réactifs de coloration résiduels.
  4. Blocage des liaisons non spécifiques
    1. Créez une solution bloquant l’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % dans un tube PE de 5 mL en ajoutant 0,12 mL de BSA à 4 mL de PBS 1x.
    2. Introduire la solution BSA dans les constructions pendant 30 min à température ambiante pour bloquer les sites non spécifiques, puis jeter la solution.
  5. Coloration de l’actine avec FITC-Phalloïdine
    1. Préparez une solution de FITC-phalloïdine à 0,2 % dans un tube PE de 5 mL avec 4 mL de 1x PBS et 8 μL de réactif de coloration.
    2. Immergez les constructions dans cette solution pendant 60 minutes à température ambiante dans l’obscurité, puis jetez la solution.
    3. Ajoutez 2,5 ml de 1x PBS dans la boîte de culture, en immergeant complètement les constructions pour éliminer les réactifs de coloration résiduels.
  6. Coloration nucléaire au DAPI
    1. Appliquez 4 mL de solution de coloration DAPI sur les constructions, en assurant une couverture complète.
    2. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 20 min avant de retirer la solution DAPI.
  7. Lavage final et immersion dans le PBS : Ajouter 2,5 ml de 1 x PBS dans la boîte de culture, en immergeant complètement les constructions pour éliminer les réactifs de coloration résiduels.
    REMARQUE : Préparez les solutions de coloration à l’avance et manipulez-les doucement. À aucun moment, les cellules ne doivent subir de dessiccation dans le récipient de culture.
  8. Observez à l’aide d’un microscope confocal : Inspectez et imagez les constructions colorées à l’aide de la microscopie confocale pour évaluer la croissance cellulaire, garantissant ainsi une documentation complète des résultats.

8. Évaluation de la prolifération des eSMC dans les constructions imprimées à l’aide du test CCK-8

  1. Retirer le milieu de culture des constructions les jours 7 et 14. Lavez les constructions avec du PBS pour éliminer le milieu résiduel et les cellules détachées.
  2. Ajouter la solution CCK-8 à chaque construction en suivant les instructions du fabricant. Assurez-vous que le volume de la solution CCK-8 est suffisant pour couvrir complètement chaque construction.
  3. Incuber les constructions avec la solution CCK-8 à 37 °C pendant 2 h. Après l’incubation, transférez soigneusement le surnageant dans une nouvelle plaque à 96 puits.
  4. Mesurez l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le bain de gel granulaire κ-carraghénane a été généré en brisant mécaniquement les hydrogels en vrac en une suspension de gel particulaire. L’étude la plus récente a démontré que les particules de κ-carraghénane présentaient un diamètre moyen d’environ 642 ± 65 nm avec des morphologies uniformes à 1000 tr/min de mélange mécanique15, significativement plus petites que les dimensions des microgels précédemment rapportées dans la littérature 16,17,18. Des temps de rupture plus longs et des vitesses plus élevées permettent d’obtenir des microparticules de plus petite taille, avec un temps de mélange de 60 min à 1200 tr/min, ce qui donne des sous-microparticules d’un diamètre moyen de 565 ± 86 nm dans cette étude (figure supplémentaire 1). Une telle taille de particule devrait améliorer la résolution des processus d’impression. Ces particules s’assemblent en un gel granulaire via la formation de liaisons hydrogène et d’interactions cationiques (Figure 1A). Lorsqu’il est soumis à des contraintes, le sub-microgel κ-carraghénane présente des comportements caractéristiques tels que la souplesse, l’amincissement par cisaillement et une transition réversible de blocage-déblocage, qui sont tous essentiels pour une bio-impression 3D intégrée réussie. La figure 1B montre le comportement d’élasticité représentatif et l’amincissement par cisaillement de gels granulaires de κ-carraghénane lors d’un essai de rampe d’écoulement. Avec l’augmentation du taux de cisaillement de 0,001 à 10 s-1, les contraintes de cisaillement pour les gels granulaires de κ-carraghénane à 0,35 % (poids/vol) restent relativement inchangées à des taux de cisaillement inférieurs à 0,3 s-1, indiquant une faible limite d’élasticité de 3,5 Pa. Par la suite, on observe que les contraintes de cisaillement augmentent linéairement avec les taux de cisaillement, suggérant un comportement d’écoulement ressemblant à celui d’un fluide de Bingham. De plus, les mesures rhéologiques par balayage de déformation des sous-microgels κ-carraghénane révèlent une transition distinctive du gel au sol. Ces gels cèdent à des souches supérieures à 10 % et subissent une transition gel-sol à une souche de 35 % (Figure 1C). La faible déformation d’élasticité des gels submicroparticulaires est attribuée au réseau physique établi par les liaisons hydrogène et les interactions cationiques. Un tel comportement de transition gel-sol est réversible. Comme le montre la figure 1D, à une déformation de 100 %, le module de stockage des sous-microgels κ-carraghénane chute de 38 Pa à 6 Pa, inférieur au module de perte, indiquant un état sol. À l’inverse, lors d’une réduction brutale de la déformation à 1 %, le module de stockage revient rapidement à environ 38 Pa. Il dépasse le module de perte en 5 s, ce qui suggère que les sous-microgels κ-carraghénane sont capables de rétablir rapidement les liaisons croisées physiques entre les particules.

Les gels granulaires de κ-carraghénane, caractérisés par leurs morphologies petites et homogènes, présentent des propriétés d’amincissement par cisaillement, d’auto-récupération rapide et un comportement aux contraintes d’élasticité, ce qui est avantageux pour leur utilisation dans les applications de bio-impression 3D intégrées. Pour évaluer l’efficacité de la suspension sous-microgel de κ-carraghénane en tant que bain de support pour l’impression intégrée, une bio-encre largement utilisée composée de 10 % (en poids/vol) de méthacrylate de gélatine et de 6 % (en poids/vol) de méthacrylate de fibroïne de soie (GelMA/SFMA) est utilisée pour les essais d’impression dans le milieu κ-carraghénane 19,20. Le GelMA a été marqué à la rhodamine pour une visualisation améliorée21. Comme l’illustre la figure 2A, le bain de gel granulaire κ-carraghénane est très transparent, ce qui facilite le suivi en temps réel du processus d’impression. Les taux de cisaillement générés par la buse varient de 0,66 à 6 s-1 lorsque la vitesse de la buse varie dans la plage de 10 à 90 mm/s. Le bain sous-microgel κ-carraghénane présente toujours un comportement d’auto-guérison en 20 s lors d’un cisaillement cyclique continu à des taux alternés de 6 s-1 et 0,01 s-1 (figure supplémentaire 2). Une structure en grille de 15 x 15 x 2 mm3, avec une épaisseur de couche de 150 μm, a été maintenue dans le bain sous-microgel κ-carraghénane. Notamment, la grille a fait preuve d’une intégrité et d’une résolution remarquables, avec des filaments individuels mesurant environ 200 μm de largeur et un espacement inter-filament d’environ 350 μm, comme vérifié par des images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) (Figure 2B, C). De plus, la structure de la grille 3D comportait un réseau poreux avec des pores interconnectés. Il s’agit d’attributs essentiels qui influencent l’imprimabilité et, en fin de compte, affectent les comportements cellulaires, tels que la survie cellulaire, la prolifération et le potentiel de différenciation.

Pour confirmer davantage l’adéquation du milieu sous-microgel κ-carraghénane pour générer des structures complexes de tissus et d’organes, un modèle de cœur humain et une valve cardiaque à trois feuillets ont été fabriqués à l’aide de l’encre GelMA/SFMA à une densité de remplissage élevée de 80 %. Le modèle cardiaque imprimé reproduit avec précision la forme anatomique 3D, y compris les principales veines et artères (figure 2D), et présente une stabilité mécanique après l’élimination de l’eau (figure 2E). La valve cardiaque à trois feuillets présente des feuillets valvulaires et des structures de soutien distincts (figure 2F). De plus, les filaments à l’intérieur des constructions se décollent facilement (Figure 2G). De plus, un modèle cyclique hiérarchique comme l’œsophage est recréé avec précision. Comme le montrent les figures 2H et 2I, l’œsophage imprimé présente une stratification claire, avec des démarcations distinctes entre les couches individuelles pour reproduire les couches de tissu œsophagien correspondantes, ce qui suggère que le milieu sous-microgel κ-carraghénane soutient la complexité structurelle requise pour l’ingénierie tissulaire. Bien que le modèle actuel ne reproduise pas la pleine fonctionnalité des tissus et organes humains authentiques, le bain sous-microgel κ-carraghénane offre potentiellement une stratégie viable et prometteuse pour la fabrication in vitro de tissus et d’organes complexes, avec des applications potentielles dans la recherche, la thérapie et le diagnostic.

Les échafaudages à grille à anisotropie longitudinale et transversale imitent la couche musculaire de l’œsophage (figures 3A, B), composée d’une couche musculaire circulaire interne distincte et d’une couche musculaire longitudinale externe. Pour reproduire cette architecture anisotrope in vitro, des cellules musculaires lisses de l’œsophage de lapin (eSMC) ont été soigneusement intégrées dans les bio-encres GelMA/SFMA. En utilisant le milieu sous-microgel κ-carraghénane, un échafaudage biomimétique avec des eSMC ressemblant étroitement à la structure musculaire à deux couches de l’œsophage a été réalisé avec succès. La viabilité des cellules encapsulées dans des hydrogels a été évaluée avec la coloration Live/Dead après 5 h de culture. Elle a révélé une présence prédominante de cellules vivantes (colorées en vert) et une proportion minime de cellules mortes (colorées en rouge) au sein des réseaux d’hydrogels, indiquant une viabilité cellulaire élevée (Figure 3C). L’analyse quantitative a montré un taux de survie remarquablement élevé, allant jusqu’à 92 % (figure 3D). Ces résultats indiquent la biocompatibilité du matériau hydrogel, ainsi que l’efficacité des méthodologies d’impression et de réticulation pour préserver l’intégrité cellulaire. Pour examiner plus en détail la morphologie cellulaire dans les constructions GelMA/SFMA, des images de phalloïdine (vert)/DAPI (bleu) ont été capturées après 3 jours de culture cellulaire. Comme le montre la figure 3E, un nombre significatif d’eSMC au sein des constructions biomimétiques ont projeté une abondance de pseudopodes et montré un alignement le long des microfibres, comme le montre après 3 jours de culture. La reconstruction 3D confirme en outre la réplication précise des couches musculaires de l’œsophage (Figure supplémentaire 3). De plus, la prolifération de l’eSMC a été évaluée à l’aide du test CCK-8 aux jours 1, 7 et 14. Les valeurs du degré d’absorbance à 450 nm ont nettement augmenté du jour 1 au jour 7 et au jour 14, reflétant un comportement prolifératif robuste (figure supplémentaire 4). Ces résultats indiquent le potentiel significatif du sub-microgel κ-carraghénane pour faciliter la bio-impression biomimétique de haute qualité.

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Figure 1 : Milieu sous-microgel κ-carraghénane auto-assemblé et son analyse rhéologique. (A) Illustration schématique d’un flotteur de sous-microgel κ-carraghénane formé par liaison hydrogène et interactions cationiques pour la bio-impression 3D intégrée. (B) Rampe d’écoulement sur des sous-microgels de κ-carraghénane coincés à 0,35 % (en poids/vol) à 25 °C. (C) Mesures de la transition gel-sol dans des sous-microgels de κ-carraghénane par un balayage d’amplitude allant de 0,1 % à 100 % à 25 °C. (D) Analyse de l’auto-cicatrisation dans des sous-microgels de κ-carraghénane à 0,35 % (en poids/vol) lors d’un cisaillement cyclique continu à des déformations alternées de 1 % et de 100 % à 25 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Bio-impression 3D intégrée haute fidélité d’encres GelMA/SFMA marquées à la rhodamine à l’aide du bain de suspension sous-microgel κ-carraghénane. (A) Observation en temps réel de l’impression 3D intégrée dans le bain suspendu sous-microgel κ-carraghénane. (B, C) Images confocales au microscope à balayage laser illustrant la reconstruction 3D (B) et la structure interne (C) des grilles imprimées. (D, E) Photographies d’un modèle imprimé en 3D en forme de cœur dans une solution d’eau (D) et à l’état naturel (E). (F) Des images d’une valve cardiaque à trois feuillets et (G) les filaments décollés des constructions. (H) Photographies du haut et (I) vues de face capturant un modèle d’œsophage imprimé avec l’encre GelMA/SFMA, mettant en valeur des structures hiérarchiques à quatre couches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Bio-impression embarquée chargée de cellules à l’aide du bain de suspension sous-microgel κ-carraghénane. (A, B) Diagrammes schématiques de (A) la structure musculaire circulaire interne et longitudinale externe de l’œsophage et (B) un échafaudage biomimétique anisotrope de la couche musculaire œsophagienne produit par bio-impression 3D intégrée. (C) Images de coloration vivantes/mortes et (D) viabilité quantitative des eSMC cultivés dans l’échafaudage GelMA/SFMA à 5 h. (E) Images de projection des eSMC cultivés dans les échafaudages GelMA/SFMA le jour 3. De gauche à droite : le noyau, l’actine F et la vue de fusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : (A) Image de microscopie électronique à balayage montrant la morphologie homogène des sous-microgels de κ-carraghénane. (B) La distribution du diamètre des microparticules κ-carraghénane a été mesurée par un analyseur de taille de particules nanométrique laser. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Analyse d’auto-récupération sur des sous-microgels de κ-carraghénane à 0,35 % (poids/vol) lors d’un cisaillement cyclique continu à des taux alternés de 0,01 s-1 et 6 s-1 à 25 °C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Image de reconstruction 3D des grilles imprimées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : L’activité de prolifération des eSMC encapsulées dans l’hydrogel GelMA/SFMA après 1, 7 et 14 jours a été évaluée à l’aide du test CCK-8 (n = 3). La signification statistique a été analysée par ANOVA à un facteur suivie d’une analyse post-hoc de Tukey entre trois groupes, **p<0,01, ****p < 0,0001. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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La préparation de bains de suspension sub-microgel κ-carraghénane pour une utilisation dans la bio-impression est un processus soigneusement orchestré qui implique plusieurs étapes critiques pour s’assurer que le support résultant présente les propriétés souhaitées pour soutenir les bio-encres. Initialement, une solution de κ-carraghénane est préparée en dissolvant la poudre de κ-carraghénane dans de l’eau désionisée à des températures élevées, créant ainsi un mélange homogène. La concentration de la solution est essentielle et doit être optimisée pour la gélification ultérieure. 0,3-0,6 % (poids/vol) κ-carraghénane a démontré d’excellentes performances dans la bio-impression 3D intégrée15. Une fois refroidie, cette solution se transforme en un gel en vrac.

Le gel en vrac est ensuite soumis à une stratégie de broyage mécanique pour produire des particules sub-microgel. Cela implique des forces mécaniques à haut cisaillement qui décomposent le gel en particules de taille uniforme. Les paramètres du processus de broyage, y compris l’intensité de cisaillement, le temps et la température, sont contrôlés avec précision pour obtenir la distribution granulométrique souhaitée. Après le broyage, les particules de sous-microgel sont stockées à une température de 25 à 37 °C pour éviter l’agrégation ou la dissolution, ce qui est essentiel pour maintenir une suspension uniforme qui prend en charge des tâches de bio-impression complexes. Il est recommandé de préparer et d’utiliser le gel immédiatement.

La production de bains suspendus sous-microgel κ-carraghénane est facile à utiliser, ce qui garantit l’alignement avec les applications industrielles et la demande croissante d’efforts d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative à grande échelle. De plus, les bains de suspension sous-microgel κ-carraghénane utilisent du PBS ou un milieu de culture compatible avec les cellules comme solvant, ce qui garantit une excellente biocompatibilité et en fait un milieu idéal pour soutenir les cellules dans les constructions bio-imprimées. La durée de conservation du gel granulaire est d’environ 1 mois dans des conditions de préparation aseptiques.

Caractérisé par son comportement d’écoulement plastique de Bingham (Figure 1B), le bain sous-microgel κ-carraghénane présente d’excellentes propriétés d’amincissement par cisaillement associées à des capacités d’auto-guérison rapides (Figure 1C,D), qui sont essentielles pour améliorer la précision des constructions imprimées. L’application de ce bain sub-microgel s’est avérée efficace dans la création de tissus présentant des architectures à plusieurs niveaux (Figure 2), assurant la production de structures avec une fidélité et une résolution élevées. Il convient de noter la capacité d’extension rapide des pseudopodes dans les cellules intégrées dans des bioencres chargées de cellules (Figure 3), soulignant la compatibilité du bain avec les processus cellulaires. Par conséquent, ce bain sous-microgel κ-carraghénane est prometteur pour le domaine de la fabrication de tissus et d’organes in vitro. Il devrait avoir un impact profond sur l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative en permettant le développement de constructions tissulaires plus complexes, viables et fonctionnellement intégratives.

Malgré le potentiel considérable du bain sous-microgel κ-carraghénane pour des applications en bio-impression et en ingénierie tissulaire, plusieurs défis et limites subsistent. L’une des principales préoccupations est que sa composition ressemble beaucoup au milieu de culture cellulaire, ce qui est crucial pour maintenir la viabilité cellulaire lors de l’impression prolongée de grands organes. Les sous-microgels κ-carraghénane sont principalement produits à l’aide de PBS comme solvant, ce qui nécessite l’incorporation de divers milieux de culture cellulaire pour dissoudre le matériau. En plus du PBS, le κ-carraghénane est également gélatinisé à l’aide d’une solution de chlorure de calcium. Cependant, la solution de chlorure de calcium peut provoquer une toxicité pour les cellules ou créer un déséquilibre de la pression osmotique. Par conséquent, l’utilisation d’un milieu de culture cellulaire serait idéale pour les solvants κ-carraghénane et les agents de réticulation. De plus, la production stérile à haut débit de microgels représente un défi de taille. La stérilisation des solutions de κ-carraghénane nécessite une filtration à travers un filtre de 0,22 μm à des températures élevées. Cependant, le rendement du κ-carraghénane stérile est souvent entravé par divers facteurs, notamment la qualité de la solution PBS et le refroidissement du κ-carraghénane pendant le processus de filtration. Chaque lot de filtration ne produit généralement que 20 à 50 ml de κ-carraghénane stérile, ce qui constitue un obstacle important à la production à haut débit de microgels de κ-carraghénane. Par conséquent, les recherches futures se concentreront sur l’optimisation du processus de biofabrication, l’évaluation de la viabilité et de la fonction cellulaires à long terme et l’exploration de l’intégration de tissus imprimés dans des systèmes vivants.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun intérêt financier dans les produits décrits dans ce manuscrit.

Remerciements

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Cette recherche a été soutenue par la Fondation des sciences naturelles de Ningbo (2022J121, 2023J159), le projet clé de la Fondation des sciences naturelles de la ville de Ningbo (2021J256), la Fondation ouverte du Laboratoire clé d’État d’ingénierie moléculaire des polymères (Université Fudan) (K2024-35) et le Laboratoire clé de médecine de précision pour les maladies athéroscléreuses de la province du Zhejiang, Chine (2022E10026). Merci pour le soutien technique des installations centrales, Centre des sciences de la santé de l’Université de Ningbo.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bio-imprimante 3Dsur mesure
Solarbio Life ScienceC0065prête à l’emploi
EFLXY-WJ01
Compteur de cellulesCorningCyto smart 6749
Microscope confocal à balayage laserLeicaSTELLARIS 5
DMEM hyperglucoseVivaCellC3113-0500Glycémie élevée, avec pyruvate de sodium et L-glutamine
Rhéomètre rotatif dynamiqueTA InstrumentDiscovery HR-20
Cellules musculaires lisses de l’œsophageFourni par le Département de biologie cellulaire et de médecine régénérative, Centre des sciences de la santé, UniversitéCellules primaires de l’œsophage
de lapin Sérum fœtal bovinUEF9070L
Isothiocyanate de fluorescéine marqué à la phalloïdineSolarbio Life ScienceCA1610300T
Méthacrylate de gélatineEFL EFL-GM-6060 % substitution
k-carraghénaneAladdinC121013-100gLithium
Phényle de qualité réactif (2,4,6-triméthylbenzoyl) phosphinateAladdinL157759-1g365~405 nm
Kit Live-DeadbeyotimeC2015M
Lecteur de microplaquesPotenovPT-3502B
ParaformaldéhydeSolarbio Life ScienceP1110  ;4 %
Pénicilline/streptomycineSolarbio Life ScienceMA0110100 &aiguë ;
Solution saline tamponnée au phosphateVivaCellC3580-0500pH 7,2-7,4
Méthacrylate de fibroïne de soieEFLEFL-SilMA-001Substitution de 39
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Trypsine-EDTAVivaCellC100C10,25 %, sans rouge de phénol
4',6-Diamidino-2-Phénylindole conçue Lumière UV 405 nm de Ningbo  %

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
  2. Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692(2021).
  3. Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957(2020).
  4. Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616(2023).
  5. Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
  6. Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  7. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  8. Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004(2023).
  9. Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011(2023).
  10. Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013(2023).
  11. Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104(2022).
  12. Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  13. Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
  14. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573(2020).
  15. Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009(2024).
  16. Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  17. Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947(2024).
  18. Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458(2023).
  19. Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657(2021).
  20. Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), eabq6900 (2022).
  21. Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).

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Mots-clés

Microgels de kappa carragh naneBioimpression 3DIng nierie tissulaireBain d hydrogel granulaireD p t de bio encreBroyage m caniqueBio encres charg es de cellulesR ticulation photo induite

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