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Article de méthode

Modélisation in vitro du dépôt de graisse dans la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique

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DOI :

10.3791/66810

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19 juillet 2024

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1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit l’utilisation de cellules HepG2 induites par l’acide oléique comme modèle de maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique.

Résumé

La prévalence de la maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) a augmenté en raison de changements dans les modèles économiques et de mode de vie, entraînant d’importants problèmes de santé. Des rapports antérieurs ont étudié l’établissement de modèles animaux et cellulaires pour la MASLD, mettant en évidence les différences entre eux. Dans cette étude, un modèle cellulaire a été créé en induisant l’accumulation de graisse dans le MASLD. Les cellules HepG2 ont été stimulées avec l’acide oléique, un acide gras insaturé, à diverses concentrations (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) pour émuler le MASLD. L’efficacité du modèle a été évaluée à l’aide de tests du kit de comptage cellulaire 8, de la coloration Oil Red O et de l’analyse de la teneur en lipides. Cette étude visait à créer un modèle cellulaire simple à utiliser pour les cellules MASLD. Les résultats des tests du kit de comptage cellulaire 8 ont montré que la survie des cellules HepG2 dépendait de la concentration d’acide oléique, avec un IG50 de 1,875 mM. La viabilité cellulaire dans les groupes 0,5 mM et 1 mM était significativement plus faible que dans le groupe témoin (P < 0,05). De plus, la coloration au rouge d’huile O et l’analyse de la teneur en lipides ont examiné les dépôts de graisse à diverses concentrations d’acide oléique (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) sur les cellules HepG2. La teneur en lipides des groupes 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM était significativement plus élevée que celle du groupe témoin (P < 0,05). De plus, les taux de triglycérides dans les groupes OA étaient significativement plus élevés que ceux du groupe témoin (P < 0,05).

Introduction

La maladie hépatique stéatotique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) englobe une gamme d’affections, notamment la stéatose simple, la stéatohépatite non alcoolique (NASH), la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire 1,2,3,4,5,6, toutes attribuées à des facteurs autres que la consommation d’alcool 7. La MASLD est la maladie hépatique la plus répandue causée par des lésions métaboliques du foie, affectant près d’un quart de la population mondiale 8,9,10,11,12. Bien que la pathogenèse précise de la MASLD n’ait pas encore été élucidée, diverses théories tentent d’expliquer son développement. Une notion dominante suggère un abandon de la théorie classique des « deux coups » vers un modèle « à coups multiples »1. Au cœur de ces hypothèses se trouve le rôle de la résistance à l’insuline, qui serait essentielle dans la pathogenèse de la MASLD13. La recherche indique que la résistance à l’insuline dans les hépatocytes entraîne une augmentation des niveaux d’acides gras libres, formant par la suite des triglycérides stockés dans le foie14,15.

Les chercheurs ont utilisé des modèles in vivo et in vitro pour simuler le dépôt de graisse dans le MASLD ; Pourtant, reproduire pleinement son mécanisme pathologique reste un défi. Malgré cette limitation, ces modèles ont joué un rôle déterminant dans l’étude de cibles thérapeutiques potentielles pour la MASLD. Cependant, le développement d’un modèle stable de MASLD est crucial. Bien que les modèles animaux soient efficaces, ils prennent du temps et coûtent cher, ce qui souligne l’intérêt croissant pour les modèles cellulaires in vitro . Ces modèles utilisent souvent un ou plusieurs acides gras libres tels que l’acide oléique (OA) et l’acide palmitique pour recréer le MASLD induit par l’alimentation. Parmi ceux-ci, la lignée cellulaire de l’hépatoblastome humain HepG2 est souvent utilisée pour établir des modèles cellulaires in vitro de MASLD.

L’induction de l’OA stimule les cellules HepG2 à répliquer le dépôt graisseux semblable à la MASLD, une méthode dont l’histoire est bien établie. Le but de cette étude était de démontrer la viabilité, la coloration au rouge d’huile (ORO), la teneur en lipides et le taux de triglycérides (TG) des cellules HepG2 traitées avec 0,25 mM d’OA. L’objectif de cette expérience était de fournir des preuves supplémentaires pour le développement d’études de modélisation MAFLD.

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Protocole

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Culture cellulaire

  1. Cultiver des cellules HepG2 dans des flacons de culture contenant du milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM) (contenant 10 % de sérum de bovin fœtal, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Maintenir les flacons de culture à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .

2. Effet de l’acide oléique sur la viabilité cellulaire mesurée par le kit de comptage cellulaire-8

  1. Dissoudre un volume spécifique d’OA dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour obtenir une concentration de 200 mM. Conservez la solution à -20 °C pour une utilisation future.
  2. Amorcez des cellules HepG2 dans une plaque de 96 puits à une densité cellulaire de 6 × 103 cellules par puits. Ajouter 100 μL de DMEM dans chaque puits. Incuber et cultiver les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 24 h. Divisez les cellules de l’hépatite G2 en deux groupes :
    1. Groupe témoin : ajouter un milieu de culture cellulaire.
    2. Groupe OA : ajouter OA au milieu de culture cellulaire pour obtenir des concentrations finales de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM.
  3. Après 24 h d’incubation initiale, jeter le surnageant de chaque puits et ajouter de l’OA selon le groupe spécifié, en ajoutant 100 μL par puits. Pour le groupe témoin, ajouter 100 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits. Continuez à incuber les cellules pendant encore 24 heures.
    REMARQUE : Assurez-vous que chaque groupe dispose de six puits répliqués. Pour éviter l’évaporation, ajoutez 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans l’anneau extérieur des puits de la plaque à 96 puits.
  4. Après 24 h d’incubation, ajouter 10 μL de kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) dans chaque puits, mélanger doucement et incuber pendant 2 h dans l’obscurité. Retirez la plaque à 96 puits de l’incubateur, placez-la dans le lecteur de microplaques et mesurez la valeur d’absorbance à 450 nm (A450). Les valeurs IG50 ont été comptées en fonction de la DO.

3. Coloration au rouge O à l’huile pour observer la formation de gouttelettes lipidiques intracellulaires

  1. Ensemencer les cellules HepG2 dans des plaques de culture cellulaire à 6 puits à une densité de 5 × 10 à5 cellules par puits et cultiver les plaques dans un incubateur à température constante pendant 24 h. Reportez-vous à la figure 1 pour une représentation visuelle des étapes décrites.
  2. Après 24 h de culture cellulaire, ajouter 2 mL de milieu de culture cellulaire contenant de l’OA dans chaque puits, jusqu’à ce que les concentrations finales soient de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM. Après 24 heures supplémentaires, retirez le milieu de culture cellulaire de chaque puits et lavez-le deux fois avec du PBS. Ajouter 1 mL de fixateur ORO dans chaque puits et incuber pendant 30 min.
  3. Préparez la solution de coloration ORO en mélangeant la solution de coloration A avec la solution de coloration B dans un rapport de 3:2. Laissez le mélange reposer à température ambiante pendant 10 min, puis filtrez-le une fois à travers un filtre de 0,45 μm. Conservez la solution filtrée dans un tube à centrifuger à l’abri de la lumière jusqu’à l’utilisation.
  4. Jetez le fixateur et lavez-le deux fois à l’eau distillée. Ajouter 1 mL d’isopropanol à 60 % dans chaque puits et incuber pendant 30 s. Jeter 60 % de la solution d’isopropanol et ajouter 1 mL de solution de coloration ORO fraîchement préparée dans chaque puits avant l’incubation pendant 20 min. Jeter la solution de coloration ORO, ajouter 1 mL d’isopropanol à 60 % dans chaque puits et incuber pendant 30 s. Lavez 5 fois à l’eau pour enlever l’excès de colorant.
  5. Couvrez les cellules avec de l’eau distillée et observez au microscope. Une fois les images recueillies, jetez le liquide dans la plaque et laissez-le sécher. Ensuite, ajoutez 2 ml d’isopropanol dans chaque puits et secouez la plaque sur un agitateur orbital pendant 10 min. Transférez le liquide dans une nouvelle plaque de 96 puits, avec 16 puits dans chaque groupe, en ajoutant 100 μL par puits. Calculer la teneur en lipides en mesurant la densité optique (DO) de chaque puits à l’aide d’un lecteur de microplaques à 510 nm (A510).

4. Effets de différentes concentrations d’acide oléique sur les triglycérides totaux dans le surnageant des cellules HepG2

  1. Équilibrez le kit à température ambiante pendant 20 min et préparez les plaques requises pour l’expérience.
  2. Prélever le surnageant cellulaire et centrifuger à 1 570 × g pendant 10 min. Définir des puits standard et tester des puits d’échantillons. Ajouter 50 μL de concentration étalon (concentration [S0 → S5] suivie de : 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol/L) dans les puits étalons. En plus des puits blancs et standard, ajoutez 10 μL d’échantillons différents dans les puits d’échantillons, puis ajoutez 40 μL de diluant d’échantillon dans chaque puits. Ajouter 100 μL d’anticorps de détection de raifort peroxydase dans chaque puits, sceller avec une membrane à plaque et incuber à 37 °C pendant 1 h dans un four à température constante.
  3. Jetez le surnageant, séchez-le sur du papier sans poussière et lavez-le bien avec 1 solution de lavage. Laisser reposer à température ambiante pendant 1 min. Répétez le processus de lavage 5 fois.
  4. Ajouter 50 μL de substrat A et 50 μL de substrat B dans chaque puits. Mélangez délicatement et laissez incuber pendant 15 min à 37 °C. Ajouter 50 μL de solution de terminaison dans chaque puits et mesurer la valeur de DO de chaque puits à 450 nm (A450) en 15 min.
  5. Tracez la concentration de l’étalon le long de l’axe des x et la valeur d’absorbance (OD) correspondante le long de l’axe des y pour effectuer une régression linéaire et dérivez l’équation de la courbe pour calculer la valeur de concentration de chaque échantillon.

5. Analyse statistique

  1. Déterminer les différences significatives dans les données quantitatives.
  2. Calculez la moyenne ± l’écart-type (ET) et représentez graphiquement les données. Considérez que P < 0,05 est statistiquement significatif.

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Résultats

Effet de l’acide oléique sur la viabilité cellulaire
Les cellules HepG2 ont été exposées à des concentrations variables d’OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), ce qui a entraîné une diminution des taux de survie cellulaire à 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM et 1 mM par rapport à 0 mM. Une signification statistique a été observée à 0,5 mM (P < 0,05) et 1 mM (P < 0,05) par rapport à 0 mM. Les résultats de l’impact de l’OA sur la viabilité cellulaire, tels qu’évalués par le kit CCK...

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Discussion

Le MASLD est un syndrome clinicopathologique caractérisé par un dépôt excessif de graisse intracellulaire dans les hépatocytes en raison de facteurs autres que l’alcool et d’autres agents hépatiques établis18. Le MASLD est étroitement lié au stress métabolique acquis, aux lésions hépatiques, notamment associées à la résistance à l’insuline et à la susceptibilité génétique. Pour étudier et dépister efficacement les médicaments pour la MASLD, il est crucial de sélectionner un modèle expérimental app...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

L’étude actuelle a été financée par « Étude sur les questions clés de l’effet curatif de Koumiss sur les maladies régionales de la médecine mongole » en 2018 Projet soutenu du programme de science et de technologie du Département de la science et de la technologie de la région autonome de Mongolie intérieure.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 et micro ; m filtreMillex
0,25 % Trypsine-EDTA (1x) Trypsine-EDTAGibco25200-056
0,45 & micro ; Filtre mMillex
2 mL Crygenic VialsCORNING430659
25 cm2 Flacon de culture cellulaireCORNING430639
Plaque de culture cellulaire 6 puitsCORNING3516
Plaque de culture cellulaire 96 puitsCORNING3599
Plaque de numération globulaireShanghai Jing Jing Réactif biochimique & Instrument Co.
Cell Counting Kit-8 testsBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  ;CA1210-1000T
Incubateur CO2NUAIRENU-5710E
  ; DMSO DiméthylsulfoxydeBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  ;D8371
Dulbecco’s Modified Eagle MediumGibco8122691
Équipement de marquage enzymatiqueTecanSpark
Sérum de veau fœtal, Lignée deGibco10099141
HepG2Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC221031
Triglycérides humains (TG) ELISA Institutde bio-ingénierie Nanjing Jiacheng20170301
Microscope inversé pour la culture cellulaireLeicaDMi1  ;
IsopropanolTianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.Kit de
coloration rouge à l’huile 2021030141, pour cellules cultivéesBeijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  ;G1262
Acide oléique  ;Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Pénicilline StreptomycineGibco15140122
SPSS 24.0Logiciel
02270113 cellules qualifiée A502071 de statistiques

Références

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