Modélisation avancée de l’anévrisme de l’aorte abdominale chez la souris par l’association de l’élastase topique et du ß-aminopropionitrile oral

Résumé

Ce protocole décrit une approche chirurgicale méthodique pour modéliser les anévrismes avancés de l’aorte abdominale chez la souris en combinant l’application directe d’élastase sur l’aorte infrarénale et l’administration de ß-aminopropionitrile dans l’eau de boisson.

Résumé

Le modèle murin topique d’élastase abdominale (AAA) est amélioré lorsqu’il est combiné avec de l’eau potable supplémentée en ß-aminopropionitrile (BAPN) pour produire de manière fiable de véritables anévrismes infrarénaux avec des comportements qui imitent les AAA humains. L’application topique d’élastase sur l’adventice de l’aorte infrarénale provoque des dommages structurels aux couches élastiques de la paroi aortique et initie la dilatation anévrismale. L’administration concomitante de BAPN, un inhibiteur de la lysyl oxydase, favorise la dégénérescence soutenue de la paroi en réduisant la réticulation du collagène et de l’élastine. Cette combinaison se traduit par de grands AAA qui se dilatent progressivement, forment un thrombus intraluminal et sont capables de se rompre. Des techniques chirurgicales raffinées, telles que l’isolement circonférentiel de l’ensemble du segment aortique infrarénal, peuvent aider à normaliser la procédure pour une application cohérente et approfondie de l’élastase pancréatique porcine malgré les différents opérateurs et les variations anatomiques entre les souris. Par conséquent, le modèle élastase/BAPN est une approche raffinée pour induire chirurgicalement l’AAA chez la souris, ce qui pourrait mieux récapituler les anévrismes humains et offrir des opportunités supplémentaires pour étudier la croissance et le risque de rupture de l’anévrisme.

Introduction

Un anévrisme est défini comme une dilatation pathologique d’un vaisseau sanguin supérieure à 50 %^{du diamètre 1} du vaisseau sain. Bien que les anévrismes de l’aorte abdominale (AAA) soient une affection fréquemment rencontrée dans la population vieillissante, avec une incidence d’environ >5 % des hommes > 65 ans, il n’existe pas de stratégies thérapeutiques dirigées pour traiter l’AAA¹. La prise en charge actuelle de l’AAA se limite à la réduction des facteurs de risque et à la réparation chirurgicale par chirurgie ouverte ou endovasculaire basée sur le diamètre de l’aorte ou le taux de croissance². Le plus grand danger de l’AAA est la rupture de l’anévrisme, qui est mortelle si elle n’est pas traitée, et la réparation dans ce contexte d’urgence peut entraîner des risques de mortalité supérieurs à 90 %¹.

La physiopathologie de l’AAA est compliquée, multifactorielle et mal comprise³. Les caractéristiques de l’AAA humain comprennent une véritable dilatation anévrismale de la paroi aortique avec une infiltration de cellules inflammatoires, la présence de thrombus intraluminaux et une dilatation progressive qui conduit à une rupture éventuelle ^3,4. De plus, les AAA sont associés à un âge avancé, ont une prédominance sexuelle masculine/féminine de 9:1 et se produisent le plus souvent dans l’aorte infrarénale⁵. Modéliser toutes les caractéristiques et tous les comportements des AAA humains chez les animaux reste un défi permanent⁶.

La modélisation actuelle de l’AAA est principalement réalisée chez la souris, et les anévrismes sont généralement induits à l’aide de l’une des trois méthodes suivantes : par perfusion d’angiotensine II (AngII) via une pompe osmotique implantée par voie sous-cutanée, et par application directe de chlorure de calcium (CaCl₂) ou d’élastase sur l’aorte⁷. Dans cette dernière méthode, l’élastase pancréatique porcine (EPI) est appliquée sur un segment de l’aorte infrarénale et provoque la dégradation enzymatique des fibres d’élastine dans la lamelle élastique de la tunique média. Ces dommages structurels entraînent l’affaiblissement de la paroi aortique et la dilatation anévrismale vers l’extérieur. Cependant, l’utilisation de l’élastase topique seule produit des anévrismes infrarénaux relativement petits, qui ne s’élargissent pas progressivement ou ne se rompent pas au fil du temps. Plus récemment, Lu et al. ont amélioré ce modèle en administrant en plus du β-aminopropionitrile (BAPN), un inhibiteur irréversible de la lysyl oxydase, à leurs souris traitées à l’élastase⁸. En empêchant la réticulation des fibres d’élastine et de collagène, la supplémentation en BAPN provoque la dilatation progressive des aortes endommagées par l’élastase jusqu’au point de rupture. Le modèle élastase/BAPN a en outre un taux d’incidence d’AAA plus élevé que le modèle élastase topique, et les anévrismes produits sont également plus grands et contiennent un thrombus intraluminal⁸.

Dans le modèle élastase/BAPN, le degré de dissection chirurgicale et l’exposition de l’aorte à l’élastase peuvent avoir un impact sur le succès et la reproductibilité de ce modèle. Dans ce manuscrit, nous décrivons que l’administration concomitante d’eau potable BAPN et l’application topique d’élastase sur l’aorte après l’isolement circonférentiel de l’ensemble du segment aortique infrarénal améliorent la reproductibilité, tiennent compte des différences anatomiques entre les animaux et entraînent une augmentation du taux d’induction de l’AAA, de la taille des anévrismes et de l’incidence des ruptures. Dans cet article, nous décrirons une approche standardisée pour induire de manière fiable des anévrismes avancés de l’aorte abdominale chez la souris en utilisant une combinaison d’eau topique supplémentée en élastase et en BAPN.

Protocole

Les protocoles pour les animaux sont approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison (M005792).

1. Entretien des animaux

1. Élevez des souris avec de la nourriture d’entretien standard. Utilisez des souris adultes ou de jeunes souris adultes (âgées de 8 à 12 semaines).
   REMARQUE : L’utilisation d’adultes permet de s’assurer que les animaux ont atteint leur pleine maturité et limite tout risque que les changements de diamètre aortique puissent être liés à la croissance de l’animal. Pour cette étude, nous avons utilisé des souris C57BL/6J mâles et femelles âgées de 22 à 24 semaines au moment de l’opération. Lu et ses collègues n’ont pas observé de différences significatives dans la réponse anévrysmale entre les souris plus jeunes et plus âgées⁸. De plus, alors que la plupart des modélisations d’anévrisme sont effectuées chez les souris mâles, ce modèle induit avec succès des AAA chez les souris mâles et femelles⁹.
2. Déterminez la durée de l’étude et affectez les animaux à des groupes de traitement ou de simulation (témoins). Administrer de l’eau potable BAPN à 0,2 % aux souris du groupe de traitement et les soumettre à une intervention chirurgicale avec application topique d’élastase active dans l’aorte infrarénale. Administrer de l’eau non traitée aux animaux témoins et les soumettre à une intervention chirurgicale avec l’application d’élastase dénaturée sur l’aorte infrarénale.

2. Initiation à l’utilisation d’eau potable supplémentée en B-aminopropionitrile (BAPN)

1. Deux jours avant la chirurgie, commencez le traitement des souris avec de l’eau potable BAPN à 0,2 %. Préparez de l’eau BAPN en plus grandes quantités et conservez-la dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à 28 jours. Assurez-vous que l’eau BAPN atteint la température ambiante avant de la donner aux souris.
   REMARQUE : Nous recommandons que l’eau BAPN soit remplacée dans les cages tous les 7 jours pendant toute la durée de l’étude.

3. Préparation du matériel le jour de l’intervention

1. Coupez les gants chirurgicaux en bandes de 5 mm x 10 mm, qui seront utilisées plus tard pour aider à isoler l’aorte avant le traitement à l’élastase. Préparez un champ chirurgical en découpant un ovale de ~ 1,5 cm x 3 cm au centre d’un champ chirurgical. Dépliez la gaze de 2 po x 2 po et coupez-la en deux pour créer des bandes de gaze d’environ 2,5 cm x 10 cm à utiliser plus tard pour la rétraction du contenu abdominal. Autoclave tous les instruments chirurgicaux (voir la Table des matières) et mise en place d’un champ opératoire stérile comme le montre l’exemple de la figure 1.

Figure 1 : Exemple de configuration de chirurgie stérile en préparation du modèle murin d’AAA en élastase/BAPN. Abréviations : BAPN = ß-aminopropionitrile ; AAA = anévrisme de l’aorte abdominale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Préparez une cage de récupération postopératoire en plaçant une cage propre sous une lampe chauffante et placez une solution saline près de la lampe pour la réchauffer à la température corporelle (37 °C). Assurez-vous que la lampe chauffante est positionnée de manière à ce que la cage de récupération et le sérum physiologique soient chauds, mais ne dépassent pas 37 °C. Allumez la pompe à eau pour commencer à faire circuler de l’eau chaude à travers le coussin chauffant.

4. Préparation de l’animal pour la chirurgie

1. Placez les souris dans une chambre d’induction et anesthésiez-les avec de l’isoflurane à 5 % à 200 ml/min à l’aide d’un vaporisateur électronique à faible débit. Pendant l’anesthésie, pesez chaque souris et administrez 0,6 mg/kg de buprénorphine ER et 20 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée pour l’analgésie. Utilisez des tondeuses à cheveux électriques pour couper la fourrure sur l’abdomen, du bas de l’abdomen à l’inférieur du processus xyphoïde. Utilisez de la gaze ou une lingette de laboratoire pour brosser l’excès de poils. Remettez les souris dans leur cage et attendez au moins 20 minutes pour que l’analgésie fasse effet avant de procéder à la chirurgie.
2. Après au moins 20 minutes depuis l’administration de l’analgésie, placez la souris dans une chambre d’induction d’anesthésie et administrez à nouveau de l’isoflurane à 5 % à 200 ml/min à l’aide d’un vaporisateur électronique à faible débit jusqu’à ce que la souris soit sous sédation.
3. Retirez la souris sous sédation de la chambre d’induction et placez-la en décubitus dorsal sur le champ opératoire. Appliquez du gel pour les yeux et fixez le cône nasal avec du ruban chirurgical. Réduire l’isoflurane inhalé à un taux de maintien de 1 à 2 % à 50 mL/min. Fixez les pattes avant et arrière de la souris avec du ruban chirurgical.
4. Examinez le bas-ventre de la souris à la recherche de la vessie. Appliquez doucement une pression externe sur la vessie entre le pouce, l’index et le majeur pour induire la miction ; Pendant ce temps, utilisez un morceau de gaze pour évacuer l’urine.
   REMARQUE : Veillez à ne pas contaminer le champ opératoire.
5. Commencez à désinfecter l’abdomen en appliquant un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine et d’alcool à 70 % avec des cotons-tiges. Commencez au centre de l’abdomen et travaillez vers l’extérieur dans un mouvement circulaire 3x. Laissez la zone sécher brièvement entre les applications.
6. Vérifiez s’il n’y a pas de réponse par pincement des orteils pour vous assurer que l’anesthésie est adéquate. Assurez-vous que le cône nasal et les membres sont bien fixés. Placez un champ chirurgical sur la souris, avec l’ouverture directement sur l’abdomen préparé chirurgicalement.
   REMARQUE : Ne faites pas glisser le rideau sur la souris pour éviter une contamination potentielle.

5. Induction chirurgicale de l’AAA

1. Entrée dans la cavité abdominale :
   1. Lavez-vous les mains et portez des gants chirurgicaux propres en nitrile ou stériles. Avant d’entrer en contact avec le champ opératoire, vaporisez toujours des gants contenant 70 % d’EtOH et frottez les mains gantées ensemble jusqu’à ce qu’elles soient sèches.
   2. Utilisez une pince émoussée pour taper la peau dans la ligne médiane de l’abdomen. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une petite entaille dans la peau, puis prolongez l’incision longitudinalement, d’environ 2 à 3 cm de longueur.
   3. Utilisez une pince pour soulever les muscles droits afin d’identifier la linea alba translucide. Utilisez des ciseaux pour pénétrer dans la cavité abdominale par la linea alba, puis étendez-la le long de la linea alba proximale et distale.
2. Exposition de l’aorte abdominale :
   1. Humidifiez une bande de gaze et deux cotons-tiges avec une solution saline réchauffée. Créez un rouleau abdominal en roulant fermement une extrémité de la gaze à mi-chemin, en laissant une queue généreuse.
   2. Utilisez un écarteur cutané pour rétracter la paroi abdominale droite.
   3. À l’aide d’écouvillons humides à bout de coton, effectuez une rotation viscérale médiale droite en balayant doucement l’intestin grêle et le gros intestin vers le quadrant supérieur gauche et visualisez l’aorte et la veine cave inférieure (CVI). Utilisez un rouleau abdominal pour rétracter l’intestin hors de vue - rentrez l’extrémité roulée de la gaze sous l’intestin, puis amenez l’extrémité de la queue autour et hors du corps pour emmailloter doucement l’intestin. Appliquez une légère tension sur la queue de la gaze pour maintenir l’intestin hors du champ de vision. Ajustez le rouleau abdominal et l’écarteur cutané pour obtenir une vue optimale des organes rétropéritonéaux, comme le montre la figure 2A.
      REMARQUE : Le rouleau abdominal aide à garder l’intestin humide et à le protéger contre les dommages accidentels causés par des instruments chirurgicaux. Assurez-vous que la gaze reste humide pendant la procédure pour éviter que l’intestin ne se dessèche. Veillez à ne pas rétracter l’intestin avec force, car cela peut provoquer un pliage de l’artère mésentérique supérieure et un système vasculaire intestinal, ce qui peut potentiellement causer des lésions ischémiques. De plus, lors du balayage initial de l’intestin grêle, faites attention à une fine attache translucide entre le gros intestin et le foie inférieur (ligament hépatocolique), qui, si vous n’y prenez garde, peut facilement arracher la capsule hépatique et provoquer des saignements. S’il y a une tension sur ce ligament lors de la rétraction, divisez-le brusquement avec des ciseaux.

Figure 2 : Représentation de la rétraction abdominale et vue chirurgicale optimale pour l’exposition de l’aorte infrarénale de la souris. (A) La mise en place d’un rouleau abdominal de gaze aide à rétracter les organes intra-abdominaux, tandis qu’un écarteur opposé aide à visualiser le rétropéritoine. Un champ chirurgical stérile (transparent pour montrer l’orientation de l’animal) est placé sur l’animal anesthésié pour aider à maintenir la stérilité. (B) Le fascia rétropéritonéal (boîte verte) recouvre l’aorte vers l’avant. (C) Exemple de l’aorte infrarénale après dissection du fascia rétropéritonéal. L’isolement de l’aorte par rapport à la VCI peut être réalisé en commençant par un espace potentiel entre l’aorte et la CIV situé juste distal par rapport à la veine rénale gauche lorsqu’elle traverse l’avant (cercle jaune). Abréviation : IVC = veine cave inférieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Dissection circonférentielle et isolement de l’aorte infrarénale :
   1. Confirmez que la VCI et l’aorte infrarénale sont bien visibles. Commencez à exposer l’aorte en entrant et en divisant d’abord le fascia rétropéritonéal (RP) (Figure 2B). Identifiez les artères gonadiques (testiculaires ou ovariennes) qui sont parallèles le long de l’aorte infrarénale antérieure (Figure 2B et Figure 3). À l’aide d’une pince, divisez brusquement le fascia entre les artères gonadiques et continuez longitudinalement pour exposer l’aorte vers l’avant (Figure 2C).
      REMARQUE : Le fascia RP est une fine couche translucide de tissu conjonctif qui contient des lymphatiques et le plexus splanchnique. Il est nécessaire de disséquer à travers le fascia RP pour exposer l’aorte. Cependant, ne disséquez pas à travers le tissu conjonctif de l’adventice aortique. Une déchirure de l’adventice (tissu conjonctif blanc) exposera le média (apparaît en rouge vif), et l’aorte se rompra probablement à cet endroit une fois que l’élastase sera appliquée.
   2. Ensuite, commencez à isoler l’aorte abdominale de la VC. Commencer cette dissection par un petit espace entre la VCI et l’aorte, situé juste en dessous du bord inférieur de la veine rénale gauche lorsqu’elle traverse l’aorte (Figure 2C). Utilisez les pointes des pinces pour écarter doucement les fibres du tissu conjonctif entre l’aorte et la VCI et continuez à travailler circonférentiellement autour de l’aorte à ce niveau.
      REMARQUE : La VCI est à paroi très mince et adhère étroitement à l’aorte par une fine couche de tissu conjonctif fibreux. Veillez à éviter autant que possible de manipuler l’IVC ou de le nettoyer. Disséquer d’abord le côté droit de l’aorte de la VCI (avant de disséquer le côté gauche de l’aorte de la musculature environnante) aidera l’aorte à « se détacher » de la VCI.
   3. Continuez à disséquer brusquement le plan entre l’aorte et la CVI, en travaillant caudalement vers la bifurcation aortique. Arrêter la dissection distale une fois que la bifurcation aortique a été atteinte.
      REMARQUE : Prenez des précautions supplémentaires lors de la dissection autour de l’artère mésentérique inférieure (IMA), qui est généralement située près de la section médiane de l’aorte infrarénale et se déplace latéralement à travers la VCI.
   4. Une fois que le bord droit de l’aorte est séparé de la VCI, retournez proximal au niveau de la veine rénale gauche. Disséquez le fascia RP du bord latéral gauche de l’aorte, en travaillant circonférentiellement autour jusqu’à ce que l’aorte soit complètement isolée. Voir la figure 3 pour l’anatomie pertinente de la dissection rétropéritonéale.
      REMARQUE : Soyez prudent lors de la dissection derrière l’aorte car il existe une grande variabilité dans l’emplacement et le nombre de veines et d’artères lombaires. Voir la figure 4 pour une référence des zones à haut risque de saignement avec cette dissection.
   5. Vérifiez soigneusement que l’aorte est isolée circonférentiellement de la VCI et de la musculature environnante autant que possible, avec une dissection minutieuse autour des segments aortiques attachés par l’IMA et les artères lombaires.
   6. Placez une bande de gant le long des bords droit et gauche de l’aorte, comme illustré à la figure 5A. Essayez de couvrir la plus grande partie possible de l’IVC.
   7. Utilisez des pieds à coulisse portatifs pour mesurer le diamètre aortique le plus large et enregistrez trois mesures. Vaporisez les pointes des étriers avec 70 % d’EtOH avant et après les mesures. Évitez de contacter directement l’aorte avec les pointes de l’étrier pour éviter la contamination.
      REMARQUE : Des photos à l’aide d’un microscope calibré compatible avec un appareil photo peuvent également être utilisées.

Figure 3 : Anatomie de l’apport sanguin au bas-ventre, au bassin et au rétropéritoine de la souris. Abréviations : R = droite ; L = gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Sites à haut risque de blessure et d’hémorragie lors de la dissection rétropéritonéale et de l’isolement circonférentiel de l’aorte infrarénale. Abréviations : L = gauche ; IMA = artère mésentérique inférieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Réponses peropératoires à l’application d’élastase ou au simulacre pendant le modèle AAA murin en élastase/BAPN. (A) Des segments de gant sont placés sur toute la longueur de l’aorte avant l’application d’élastase pour aider à protéger la VCI et l’intestin de l’exposition à l’élastase tout en gardant l’aorte imbibée d’élastase (B) L’application d’élastase dénaturée ne provoque pas de dilatation de l’aorte (boîte bleue). Le diamètre aortique maximal a été mesuré à 0,627 mm au départ, puis à 0,607 mm après 5 min d’élastase dénaturée topique. (C) L’application d’élastase provoque une dilatation de l’aorte après 5 min de traitement. Dans cet exemple, l’aorte (verte) s’est dilatée à 0,953 mm au lieu de 0,607 mm, soit une augmentation de 57 % du diamètre. Abréviations : BAPN = ß-aminopropionitrile ; AAA = anévrisme de l’aorte abdominale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Application de l’élastase :
   1. Utilisez un coton-tige pour tamponner tout excès de sang ou de liquide sur l’aorte.
   2. Ensuite, placez un morceau de gaze sèche de 10 mm x 2 mm sur l’aorte. À l’aide d’une pipette, distribuer 5 μL d’élastase (ou contrôler l’élastase dénaturée) pour saturer la gaze et l’aorte. Pliez délicatement les morceaux du gant autour de l’aorte.
      REMARQUE : Pour préparer de l’élastase dénaturée à utiliser dans des groupes fictifs ou témoins, faire bouillir l’élastase à 100 °C pendant 30 minutes.
   3. Attendre 5 min pour que l’élastase agisse sur l’aorte. Pendant cette période d’incubation, si nécessaire, relâchez une partie de la tension exercée par le rouleau abdominal et l’écarteur de peau.
      REMARQUE : En raison de l’effet de lot avec l’élastase, nous encourageons les chercheurs à utiliser la même bouteille d’élastase pour toutes les expériences d’une étude donnée. Avec chaque nouvelle bouteille d’élastase, nous recommandons d’effectuer une dose-réponse pour s’assurer qu’il n’y a pas un nombre écrasant de ruptures précoces (avant 4 semaines). La durée d’application de l’élastase peut également être ajustée entre 4 et 6 min en fonction de la réponse à l’élastase.
   4. Après 5 min, réinitialisez la rétraction intestinale et dépliez les morceaux du gant. Irriguez la cavité abdominale avec 1 ml de solution saline normale chaude stérile à 0,9 %, tout en retirant soigneusement la gaze et les morceaux de gant de l’aorte. Absorbez la solution saline dans l’abdomen avec de la gaze de 10 cm x 10 cm. Répéter l’irrigation de l’abdomen pour un total de 3 x 3 mL.
   5. Utilisez des pieds à coulisse portatifs pour mesurer à nouveau le diamètre aortique le plus large après l’application d’élastase et enregistrez 3x. Voir les figures 5B et C pour des exemples de dilatation de l’aorte au traitement par élastase fictive et active.
      REMARQUE : Les moyennes des trois mesures pré- et post-élastase peuvent être utilisées pour calculer le pourcentage de variation du diamètre aortique avec le traitement. En règle générale, il y a une dilatation notable de ~30 à 50 % immédiatement après le traitement à l’élastase, ce qui peut aider à garantir que l’élastase est fonctionnelle et que l’aorte a été traitée de manière adéquate. Le diamètre de l’aorte ne doit pas changer avec l’application d’élastase dénaturée ou peut être légèrement plus petit (probablement à cause d’un spasme).
5. Fermeture de la cavité abdominale :
   1. Retirez délicatement le rouleau abdominal sous l’intestin et hors du corps. Si nécessaire, appliquez une solution saline supplémentaire sur l’intestin pour éviter de coller au rouleau abdominal lors du retrait. Assurez-vous que l’intestin est rose et correctement perfusé.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’essayer de repositionner l’intestin à son emplacement d’origine ; tenter de le faire peut risquer une torsion de l’intestin ou des hernies internes.
   2. Rapprochez le fascia abdominal à l’aide d’une suture monofilament non résorbable 5-0. Fermez la peau avec 3-4 agrafes cutanées.

6. Soins postopératoires des animaux

1. Placez la souris dans la cage de récupération à l’aide d’une lampe chauffante. Assurez-vous que la température de la cage est chaude et non chaude.
2. Administrer un bolus de liquide sous-cutané de 0,5 à 1 mL de solution saline normale à 0,9 %.
3. Laissez la souris se rétablir d’elle-même dans la cage chauffée pendant ~20 minutes jusqu’à ce qu’elle soit active conformément au protocole institutionnel, puis retournez dans une cage d’hébergement.
4. Selon le protocole de l’établissement, administrer le carprofène 20 mg/kg 24 h après la chirurgie le jour 1 postopératoire et continuer quotidiennement pendant 3 jours.

7. Mesure de l’aorte et prélèvement tissulaire

1. Après l’euthanasie avec isoflurane et une luxation cervicale, rouvrir la cavité abdominale. Prolongez l’incision à travers le sternum pour accéder au thorax. Exciser l’oreillette droite et perfuser le ventricule gauche avec 10 mL de solution froide de DPBS à 1 % pendant 2 min. Réséquer les poumons, le foie et la rate.
   REMARQUE : Veillez à ne pas blesser l’intestin ; Le déversement de contenu entérique peut avoir un impact sur l’analyse des tissus.
2. Expliquez l’aorte abdominale et mesurez le diamètre maximal de l’aorte infrarénale, comme décrit ci-dessus. Continuez à disséquer l’ensemble de l’aorte et du cœur. Une fois le cœur et l’aorte isolés, coupez toutes les branches artérielles et les artères iliaques communes en laissant de courts segments intacts sur l’aorte. Placez le cœur et l’aorte sur un fond contrasté à côté d’une règle et d’une image.

8. Analyse des données et rapports

1. Pour aider à tenir compte de l’erreur humaine, mesurez les diamètres de l’aorte au moins 3 fois chacun lorsque vous utilisez des pieds à coulisse portatifs, puis rapportez le diamètre comme valeur moyenne.
2. Définir l’AAA comme une augmentation de 50 % du diamètre de l’aorte saine. Assurez-vous d’inclure à la fois les diamètres aortiques bruts et le pourcentage de changement de diamètre dans les résultats de l’étude.

Résultats

Des souris C57BL/6J mâles et femelles âgées de 22 à 24 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les aortes infrarénales ont été traitées avec 5 μL d’enzyme élastase (6,9 mg de protéines/mL, 6 unités/mg de protéines) ou de l’élastase dénaturée pendant 5 min. Les souris mâles traitées à l’élastase ont montré une augmentation de 43,4 % du diamètre de l’aorte après 5 minutes d’exposition à l’élastase par rapport aux diamètres aortiques de base non traités, tandis que les aortes féminines traitées ont augmenté de 33,6 % (P = 0,0342). Les diamètres aortiques des couvre-oreillers n’ont montré aucun changement après 5 minutes d’exposition à l’élastase dénaturée (mâles 0,5 % ; femelles -2,8 %). Il n’y a eu aucun décès lié à la chirurgie parmi les 12 souris traitées et les 6 souris fictives. Les données de l’étude de 28 jours sont présentées dans le tableau 1. Parmi les souris femelles traitées, 3 sur 6 sont mortes d’une rupture de l’AAA ; un au 20e jour postopératoire et deux au 25e jour (Figure 6). Il n’y a pas eu de ruptures de l’AAA chez les mâles traités. Les AAA (définis comme une augmentation de >50 % du diamètre de base de l’aorte ou la mort par rupture de l’AAA) ont été induits avec succès chez toutes les souris traitées (12 sur 12). À 28 jours, le diamètre moyen de l’AAA des mâles traités était de 2,86 ± 0,31 mm, avec une variation moyenne en pourcentage de 257 ± 54 %, tandis que le diamètre de l’AAA des souris femelles traitées survivantes était de 3,60 ± 1,87 mm, avec une variation moyenne en pourcentage de 417 ± 286 % (figure 7). Les souris factices, qui n’ont montré aucun changement dans les diamètres aortiques.

Figure 6 : Survie de souris B6 mâles et femelles au cours d’un modèle élastase/BAPN de AAA pendant 28 jours. (A) Une rupture de l’AAA s’est produite chez 3 des 6 souris femelles traitées (une souris à 20 jours, puis deux souris à 25 jours) alors qu’il n’y a eu aucune rupture chez les 6 souris mâles traitées à 28 jours. (B) Images représentatives à l’autopsie d’une souris femelle morte d’une rupture de l’AAA. La rupture de l’AAA se manifeste par un gros hématome rétropéritonéal (à gauche) et la présence d’un AAA infrarénal avec une anomalie de la paroi (à droite). Abréviations : BAPN = ß-aminopropionitrile ; AAA = anévrisme de l’aorte abdominale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Diamètres aortiques maximaux des souris élastase/BAPN et B6 mâles et femelles fictives à 28 jours. (A) Les souris traitées présentent des diamètres infrarénaux significativement plus grands à 28 jours par rapport aux souris placebos. (B) La combinaison de l’élastase et de la BAPN produit avec succès de grandes AAA infrarénales chez les souris B6 mâles et femelles. Abréviations : BAPN = ß-aminopropionitrile ; AAA = anévrisme de l’aorte abdominale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

			86 Sham masculin	86 femme Sham	86 mâle Elastase/8APN	86 femelle Elastase/8APN
Nombre de souris			3	3	6	6
Âge (semaines)			22,3 ± 0,0	22,7 ± 0,7	23,1 ± 0,2	23,2 ± 0,2
Poids (g ; à la chirurgie)			36,3 ± 2,5	23,7 ± 1,2	32,8 ± 1,7*	23,7 ± 0,8
Diamètre aortique de prétraitement (mm)			0,89 ± 0,02	0,75 ± 0,04	0,81 ± 0,07	0,73 ± 0,09
Diamètre de l’aorte post-traitement (mm)			0,90 ± 0,03	0,73 ± 0,01	1,15 ± 0,03**	0,98 ± 0,12**
Variation en pourcentage après 5 min de traitement (%)			0,5 ± 4,4	-2,8 ± 5,3	43,4 ± 10,2***	33,6 ± 4,5***
Incidence de l’AAA (%)			0 / 3	0 / 3	6 / 6	6 / 6
Ruptures de l’AAA de 28 jours			0 / 3	0 / 3	0 / 6	3 / 6
Survie jusqu’à 28 jours			3 / 3	3 / 3	6 / 6	3 / 6
Diamètre maximal de l’aorte à 28 jours (mm)			0,85 ± 0,01	0,64 ± 0,01	2,86 ± 0,31*	3,60 ± 1,87**
Pourcentage de variation du diamètre de l’aorte à 28 jours (%)			-4 ± 2	-16 ± 2	257 ± 54*	417 ± 286**

Tableau 1 : Résultats d’un modèle à 28 jours du modèle murin d’AAA élastase/BAPN. Les données sont moyennes ± écart-type. *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0001 par rapport au simulacre du même sexe via le test de Fischer ANOVA à un facteur. Abréviations : BAPN = ß-aminopropionitrile ; AAA = anévrisme de l’aorte abdominale.

Discussion

La compréhension de la physiopathologie complexe de l’AAA est essentielle pour améliorer la prise en charge de l’anévrisme de l’aorte. Bien que de nouvelles stratégies soient activement développées pour améliorer les résultats chirurgicaux, les AAA restent répandus dans notre société vieillissante et la rupture d’anévrisme reste l’une des principales causes de décès aux États-Unis¹⁰. Par conséquent, les besoins non satisfaits en matière de détection, de prévention et de traitement de l’AAA justifient la poursuite de la recherche fondamentale sur les anévrismes¹¹.

Des modèles animaux qui récapitulent avec précision et efficacité les caractéristiques et les comportements des AAA humains sont essentiels pour les études mécanistes de la physiopathologie des anévrismes et l’identification de cibles thérapeutiques potentielles. Bien que les modèles animaux actuels puissent imiter les principaux aspects des changements anévrismaux qui se produisent dans les maladies humaines, aucun modèle ne représente pleinement la véritable complexité des AAA humains. Actuellement, les souris sont l’espèce la plus largement acceptée pour la modélisation de l’AAA animale. Les chercheurs devraient tenir compte des diverses forces et faiblesses de chaque modèle murin pour leur étude particulière sur l’anévrisme, telles que celles décrites par Daugherty et al. et Busch et ^al.12,13.

L’utilisation de l’élastase pour induire l’AAA chez les rongeurs a été décrite pour la première fois par Anidjar et al. en 1990¹⁴. La perfusion de l’aorte avec de l’élastase pancréatique porcine à l’aide d’un pousse-seringue crée une dilatation initiale d’environ 50 % à 70 %, et les segments dilatés présentent favorablement des caractéristiques pathologiques similaires aux AAA humains, telles que la dégénérescence médiale et l’inflammation adventice. Le modèle de perfusion classique, cependant, est sans doute le modèle d’anévrisme le plus difficile sur le plan technique, et les anévrismes qui se forment généralement à la deuxième semaine commencent à se résorber progressivement par la suite. Bhamidipati et al. en 2012 ont ensuite démontré que l’application adventice d’élastase pouvait également induire avec succès des anévrismes similaires qui sont plus reproductibles en taille¹⁵. Un modèle beaucoup moins difficile, le modèle topique de l’élastase a été largement adopté dans la recherche sur les anévrismes. La méthodologie supplémentaire et les avantages du modèle topique de l’élastase sont discutés dans l’article sur les méthodes de Xue et ses collègues¹⁶.

Le modèle élastase/BAPN de l’AAA murin a été développé par Lu et ses collègues en 2017⁸. L’introduction de 0,2 % d’eau potable BAPN a amélioré de nombreuses critiques du modèle classique de l’élastase topique, produisant maintenant des anévrismes qui s’étendent continuellement jusqu’au point de rupture de l’AAA. Dans leur étude de 2017, ils ont démontré que les souris du groupe traité par élastase/BAPN présentaient des taux de formation d’AAA significativement plus élevés que le groupe élastase (93% contre 65%, P < 0,01), qui étaient également des AAA à un stade plus avancé. Sur une période d’étude de 100 jours, les AAA dans le groupe élastase/BAPN ont continué à se dilater jusqu’à >800 % du diamètre de base et ont formé un thrombus intraluminal (53,8 %), et 46,2 % se sont rompus spontanément avant la fin de l’expérience. Ce modèle a permis aux chercheurs d’étudier les facteurs qui peuvent avoir un impact sur la progression et la stabilité de l’anévrisme au fil du temps.

Berman et al. ont exploré plus en détail le modèle élastase/BAPN en faisant varier la concentration d’élastase topique, la durée de l’étude, le moment de l’administration du BAPN et l’impact du sexe animal⁹. Le traitement avec 5 μL d’élastase plus concentrée (5 mg/mL ou 10 mg/mL) a produit des anévrismes plus gros que 2,5 mg/mL sur 56 jours. La prévalence de la formation de thrombus intraluminaux dépendait également de la concentration d’élastase, qui s’est produite chez 28,6 % des souris traitées à 5 mg/mL et chez 62,5 % des souris traitées à 10 mg/mL. Ils ont également démontré que le modèle élastase/BAPN pouvait induire des anévrismes chez les souris femelles. Bien que seules quelques souris femelles aient été étudiées (n = 5), ils ont constaté que les anévrismes chez les femelles étaient plus sujets à la rupture (2 souris sur 5) et étaient significativement plus gros que les AAA mâles à 56 jours.

Dans cet article, nous visons à fournir une méthode pour aborder l’une des plus grandes limites de la modélisation chirurgicale, à savoir la variation de la procédure chirurgicale. En l’absence d’un consensus clair sur le degré de dissection et la zone de l’aorte traitée à l’élastase, les résultats de ce modèle pourraient varier considérablement entre les animaux, les chercheurs et les institutions. Nous avons observé de nombreuses variations anatomiques entre les souris, y compris le nombre et la taille des artères et des veines lombaires, et l’emplacement de l’IMA, le décollage de la veine gonadique gauche, entre autres, qui peuvent être limitatives lorsque l’on tente de traiter seulement une partie ou un segment spécifique de l’aorte infrarénale. Ici, nous démontrons que la dissection circonférentielle de toute la longueur de l’aorte infrarénale, de l’artère rénale gauche en proximal à la bifurcation aortique distale, permet de fournir des degrés reproductibles d’exposition aortique malgré les différences anatomiques, tout en augmentant le succès de l’induction de l’anévrisme et en fournissant des limites claires à l’opérateur. De plus, la taille et la position plus antérieure de la VCI ont tendance à couvrir la majorité de l’aorte, ce qui peut affecter la quantité d’aorte traitée si elle n’est pas isolée de la VC. Bien qu’il soit nécessaire d’enlever le fascia rétropéritonéal pour exposer l’aorte, il est important de ne pas disséquer complètement le tissu conjonctif de l’adventice de l’aorte et d’exposer l’une des couches médiales, car cela entraîne généralement une rupture pendant la période d’incubation de 5 minutes de l’élastase. Cela pourrait servir de contrôle interne supplémentaire au degré de dissection avec ce modèle, mais peut être une courbe d’apprentissage frustrante lors de l’adoption de ce modèle. Les opérateurs apprendront également les zones à haut risque (figure 4) qui peuvent être facilement blessées pendant l’opération et entraîner une hémorragie incontrôlable.

Bien qu’il soit important que les étapes procédurales de ce modèle soient cohérentes, la durée de l’étude et le moment de l’échographie d’intervalle peuvent varier en fonction de l’objectif de la recherche. La dilatation de l’aorte commence immédiatement avec l’application d’élastase, mais les études utilisant ce modèle suivent généralement des souris pendant 28 jours après la chirurgie⁷, comme dans cet exemple d’expérience. La prolongation de la durée de l’étude doit être envisagée lors de l’étude des AAA avancés, de la croissance à long terme, de la formation de thrombus intraluminaux ou de la rupture.

Des mesures périopératoires supplémentaires, telles que le maintien de la température corporelle et de l’état d’hydratation de l’animal, peuvent aider à améliorer la survie des animaux à cette procédure invasive. L’utilisation d’un coussin chauffant pendant la chirurgie et le placement dans une cage de récupération chaude peuvent aider à éviter l’hypothermie. Une solution saline doit être réchauffée avant d’être utilisée pour irriguer la cavité abdominale. Un bolus de liquide sous-cutané directement après la chirurgie peut expliquer les pertes de liquide insensibles pendant l’opération et aider l’animal à maintenir une hydratation adéquate pendant la phase de récupération immédiate. Avec une manipulation minutieuse des tissus et une approche méthodique cohérente, le modèle élastase/BAPN peut être réalisé par un opérateur expérimenté entre 30 et 45 minutes par souris et produire de manière fiable une AAA avec de très faibles complications périopératoires.

Nos résultats démontrent que l’association de BAPN en plus de la dissection circonférentielle de l’aorte infrarénale avant l’application d’élastase produit de grands AAA en expansion continue, avec des diamètres plus grands et une incidence de rupture à des périodes plus courtes. Dans cette expérience, les AAA ont été induits avec succès chez toutes les souris mâles (6 sur 6) et femelles (6 sur 6) traitées avec de l’élastase active. L’exposition à l’élastase pendant 5 minutes a entraîné une augmentation immédiate du diamètre de l’aorte d’environ 30 à 40 %, ce qui est utile pour confirmer l’application réussie et cohérente de l’élastase dans les groupes de traitement. À l’instar de Berman et al., nous avons montré que ce modèle peut induire des AAA chez les souris femelles, qui ont également une réponse de rupture plus importante que les mâles. La moitié des souris femelles (3 sur 6) ont rompu dans les 28 jours, contre 0 sur 6 des mâles, cependant, les souris femelles pèsent moins que les mâles. Les souris mâles ont montré une augmentation du diamètre de l’AAA de 257 % contre -4 % des témoins mâles, tandis que les femelles survivantes ont montré une augmentation du diamètre de 417 %, contre -16 % des témoins femelles. Les diamètres aortiques n’étaient pas significativement différents entre les souris mâles et femelles survivantes traitées à 28 jours en raison du nombre plus élevé de ruptures dans le groupe femelle. Nous supposons que les souris factices présentent des diamètres aortiques plus petits à la fin de l’étude, car l’aorte a tendance à se dilater légèrement lors de la dissection initiale, puis à former du tissu cicatriciel à 28 jours.

Le modèle élastase/BAPN présente certaines limites. La dissection circonférentielle de l’aorte nécessite des compétences chirurgicales fines, mais contribue à améliorer la reproductibilité et le degré d’induction de l’anévrisme. Semblable au modèle de l’élastase topique, il existe également un effet de lot dans l’activité de l’enzyme élastase, ce qui, comme mentionné précédemment, est donc important d’utiliser la même bouteille d’élastase pour tous les animaux dans une expérience donnée. Bien que l’incidence du thrombus intraluminal AAA et de la rupture augmente avec le temps et la gravité de l’anévrisme, celles-ci ne sont ni garanties ni entièrement prévisibles dans ce modèle.

En résumé, le modèle élastase/BAPN produit de grands AAA infrarénaux véritables chez les souris mâles et femelles, qui se dilatent progressivement au fil du temps, forment un thrombus intraluminal et sont capables de se rompre. Ces points forts de ce modèle murin aident à mieux récapituler certains des comportements et caractéristiques des anévrismes chez l’homme. Bien que techniquement difficile, une dissection minutieuse et approfondie de l’aorte peut augmenter la réponse anévrysmale. Actuellement, la méthode élastase/BAPN est un modèle avancé pour l’étude des anévrismes de l’aorte abdominale infrarénale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre d’induction de 0,5 L	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0530XXS Chambre d’induction d’anesthésie
injectée de chlorure de sodium à 0,9 %, USP, 20 mL	Hospira	NDC 0409-4888-03	seringue de solution saline normale
de 3 mL Luer-Lok Tip avec aiguille BD PrecisionGlide 22 G x 3/4	Seringue	de 309569 BD REF	, aiguille de 22 G
fumarate d’aminopropionitrile	TCI	A0796	BAPN
3-Aminopropionitrile Sel de fumarate	Sigma-Aldrich	A3134-25G	BAPN
Éponges de gaze Avant Delux, 2 » x 2 » 4 plis	Medline	NON26224	éponges de gaze
Tondeuse chauve Whal	Clipper Corporation	8110	tondeuses
à cheveux gommage chirurgical à la bétadine (povidone iodée, 7,5 %)	Avrio	NCD 67618-154-16	bétadine pince
émoussée	ROBOZ	RS-5130	pince émoussée
Buprénorphine ER-lab	ZooPharm	BERLAB0.5	buprénorphine
carprofène	Norbrook	NDC 55529-131-11	carprofène
CASTROVIEJO 5.75 » droit avec serrure	ROBOZ	RS-6412	Castroviejo tournevis
applicateur en bois à pointe de coton, 6 »	Dynarex	n° 4302	applicateurs en bois à pointe de coton
DESMARRES 5.5' rectractor  ;	ROBOZ	RS-6672	rectracteur de peau  ;
pied à coulisse numérique, 0-150 mm	World Precision Instruments	501601	pied à coulisse numérique
DPBS (1x)	Gibco	14190-144	DPBS
Élastase à partir du pancréase porcin Type I	Sigma-Aldrich	E1250-10MG	élastase >4,0 unités/mg de protéines
Éthanol 200 proof	Decon Labs, Inc	2701	éthanol dilué à 70 %
lubrifiant pour les yeux	Optixcare	14716	lubrification oculaire
Germinator 500 stérilisateur sec	CellPoint Scientific, Inc	5-1450	stérilisateur à billes sèches
tapis de thérapie par la chaleur	Adroit Medical Systems	V016	tapis de thérapie par
la chaleur pompe de thérapie thermique	Adroit Medical Systems	HTP-1500	pompe de thérapie par la chaleur
isoflurane, USP	Akorn Santé animale	NCD 59399-106-01	isoflurane
Pipette L-10	Rainin	LTS 0,5-10 uL	pipette
Masque d’anesthésie à profil bas, petit	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0801	cône d’anesthésie cône de nez
micro dissecteur ciseaux	ROBOZ	RS-5619	microscope à ciseaux micro dissecteur
	Leica	S9i	microscope
Nii-LED illuminateur LED haute intensitéLumière extérieure	Nikon Instruments, Inc	83359 NII-LED	dissection externe légère
nylon 5-0 monofilament, suture non résorbable noire	Oasis	MV-661-V	5-0 suture nylon
polyisoprène gants chirurgicaux, GAMMEX non-Latex PI Micro, taille 7,5	Ansell	20685975	gants chirurgicaux sans latex
Reflex 7 mm pinces pour plaie en acier inoxydable	CellPoint Scientific, Inc	203-1000	plaie clips
échelle	Ohaus	Compass CR2200	échelle
SomnofFlo Kit d’accessoires	Kent Scientific Corporation	10-8000-71	tube pour vaporisateur électronique  ;
Vaporisateur électronique SomnoFlo	Kent Scientific Corporation	SF2992	vaporisateur électronique à faible débit
SomnoPath Flow Diverter	Kent Scientific Corporation	SP1016	déviateur de flux pour vaporisateur électronique
SS/45 pince pointue ROBOZ		RS-4941	pince pointue
ciseaux chirurgicaux	ROBOZ	RS-6010SC	ciseaux
chirurgicauxpince à cuve	Dumont	VES 0.35	pince à cuve