Technique moins invasive pour la fracture mandibulaire non stabilisée dans des modèles murins

Résumé

Ce protocole présente une méthode complète et efficace pour analyser la réparation de l’os mandibulaire. Nous décrivons une technique reproductible pour la fracture mandibulaire non stabilisée dans un modèle murin, permettant d’analyser le processus de réparation de l’os endochondral avec un minimum de lésions tissulaires et de perte osseuse.

Résumé

Des fractures non stabilisées peuvent être réalisées au niveau des sites mandibulaires chez la souris, permettant ainsi d’analyser la réparation osseuse à l’aide d’un mode d’ossification endochondrale. Pour refléter le plus fidèlement possible ce processus in vivo, il est nécessaire d’avoir un protocole standardisé pour éviter une perte osseuse excessive et des lésions des tissus mous, en particulier au niveau du site mandibulaire, un site anatomique caractérisé par un accès minimal. À notre connaissance, nous décrivons pour la première fois un protocole moins invasif de fracture mandibulaire non stabilisée chez la souris. Les souris adultes sont anesthésiées avec de l’isoflurane et reçoivent une dose préopératoire de buprénorphine par injection sous-cutanée. Une approche sous-mandibulaire est effectuée, avec une incision cutanée pratiquée le long du bord inférieur de la mandibule. Le muscle masséter est élevé dans un plan sous-périosté le long de la branche mandibulaire avec un élévateur périosté. Une fracture verticale et complète de la branche est réalisée du bord basilaire à l’encoche coronoïde (entre les apophyses condylienne et coronoïde), à l’aide d’un appareil de chirurgie osseuse piézoélectrique sous irrigation sérum salin au bord basilaire et de ciseaux pour compléter la fracture de la branche mandibulaire. L’approche cutanée est fermée par des sutures en soie. Cette procédure détaillée pour les fractures mandibulaires non stabilisées offre une procédure efficace permettant une perte osseuse minimale et des lésions des tissus mous. Cette technique garantit des résultats réussis et cohérents pour refléter avec précision le processus de réparation de l’os endochondral dans des modèles murins.

Introduction

La réparation osseuse implique des processus d’ossification membraneuse et endochondrale, en fonction de la fracture ou de la stabilisation de l’ostéotomie. La réparation osseuse suite à des ostéotomies ou fractures osseuses stabilisées repose sur l’ossification membraneuse, tandis que les fractures non stabilisées ou les ostéotomies mal stabilisées se regroupent selon un mode d’ossification endochondrale¹. La réparation osseuse membraneuse se caractérise par la formation osseuse par différenciation directe des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes, tandis que la réparation osseuse endochondrale implique la formation d’une matrice cartilagineuse transitoire, qui se différencie en ostéoblastes pour former le cal osseux².

La réparation osseuse dépend de multiples interactions tissulaires et cellulaires ; Il est également influencé par des facteurs spécifiques au site et par la force exercée sur le cal³. L’os mandibulaire est un os mobile supportant les forces masticatoires, principalement formé par l’os cortical. Le processus de réparation de l’os mandibulaire est influencé par le site et la direction de la fracture. Il est bien connu que les blessures musculaires et périoste peuvent avoir un impact sur la consolidation osseuse ainsi que sur une perte osseuse importante au site de fracture^{4, 5, 6}.

L’analyse de la réparation de l’os endochondibulaire mandibulaire implique des protocoles standardisés et reproductibles pour des comparaisons précieuses et non biaisées. En ce qui concerne la littérature, seuls quelques auteurs rapportent des protocoles pour les fractures mandibulaires non stabilisées dans des modèles de souris ^3,7, et la plupart du temps avec une direction antérieure au niveau molaire⁸. En développant cette technique, nous visons à éviter les blessures musculaires et périostiques et à limiter la perte osseuse au site de la fracture afin d’analyser au mieux le processus de réparation de l’os endochondral sans facteurs de confusion. De plus, le but de la mise au point d’une nouvelle technique pour la fracture mandibulaire chez la souris était de minimiser la douleur postopératoire et la mort animale fréquentes lors de ces chirurgies chez les petits animaux. Pour la première fois, nous décrivons un protocole moins invasif pour la fracture mandibulaire non stabilisée au niveau de la branche chez la souris. Ce protocole in vivo évite les lésions musculaires et périostiques excessives ou la perte osseuse au site de la fracture et contribue à réduire le niveau de douleur postopératoire et le risque de mort de l’animal.

Protocole

Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de l’Institut Imagine et a été validé par les comités d’éthique et le ministère français (APAFIS 26995).

1. Animaux

1. Déterminez le nombre d’animaux par groupe. Nous recommandons 12 animaux par groupe. Déterminez le sexe et l’âge des souris. Ce protocole est adapté pour les souris C57BL/6J de 6 semaines (mâles ou femelles).
2. Donnez aux animaux, au moins 1 semaine avant l’intervention, un gel nutritionnel pour l’acclimatation.

2. Intervention chirurgicale

1. Préparez le matériel requis. Autoclave les instruments : ciseaux, tourne-aiguille, pince, insert et pièce à main de l’appareil de chirurgie osseuse piézoélectrique, et élévateur. Préparez des gants stériles, des sutures en soie (4/0), un rasoir, de la gaze de coton, une solution de povidone iodée à 10 %, une table chauffante, de l’isoflurane et le masque museau pour l’inhalation d’isoflurane.
2. Préparer la buprénorphine à 0,1 mg/kg, diluée dans du sérum physiologique injectable stérile. Administrer la buprénorphine par injection sous-cutanée avec une aiguille de 25 G 30 minutes avant l’intervention chirurgicale.
3. Préparez la plaque chauffante (37 °C), placez un support en mousse dessus et fixez le masque museau avec de petites aiguilles ou du ruban adhésif.
4. Placez la souris dans le réservoir d’isoflurane pour l’induction, avec diffusion d’isoflurane (4 %). Testez la profondeur de l’anesthésie en effectuant un pincement des orteils. En cas d’induction suffisante, un manque de réflexe de pédale sera observé.
5. Placez la souris anesthésiée sur le dos sur la plaque chauffante recouverte d’un champ stérile maintenu à 37 °C pendant toute la durée de l’intervention. Positionner le masque sur le museau pour une inhalation continue d’isoflurane (maintien à 2,5 %). Fixez les extrémités de la souris avec du ruban adhésif.
6. Appliquez le lubrifiant pour les yeux deux fois pour prévenir la sécheresse oculaire induite par l’anesthésie générale. Rasez les poils sous-maxillaires, portez des gants stériles et désinfectez la peau avec plusieurs passages de solution de povidone iodée à 10 % et d’alcool.
7. Effectuez l’approche cutanée sous-mandibulaire comme décrit ci-dessous.
   1. Effectuez une incision cutanée de l’angle mandibulaire à la jonction 1/3 postérieure - 2/3 antérieure de la branche horizontale de la mandibule avec des micro-ciseaux.
   2. Disséquez les tissus sous-cutanés pour exposer le muscle masséter.
8. Désinsérez le muscle masséter qui s’attache à l’aide d’un élévateur périosté à partir du bord inférieur de la mandibule.
9. Élevez le muscle masséter dans un plan sous-périosté le long de la branche mandibulaire avec l’élévateur.
10. Créer une petite ostéotomie (3 mm de longueur) au bord inférieur de la mandibule à l’aide de l’appareil de chirurgie osseuse piézoélectrique sous irrigation sérum salin (10 mL/min maximum) au bord inférieur de la mandibule, antérieurement à l’angle mandibulaire, dans la partie postérieure de la concavité (Figure 1, Figure 2).
11. Localisez le bord postérieur de la mandibule et l’encoche coronoïde (avec les micro-ciseaux ou la pince) et complétez la fracture à l’aide de petits ciseaux droits insérés le long de la branche mandibulaire pour éviter une ouverture supplémentaire du muscle masséter et des blessures. Pour permettre une orientation correcte de la fracture, placez les ciseaux perpendiculairement au bord inférieur de la mandibule.
12. Vérifier que la fracture est bien complète : une mobilité totale entre les deux segments osseux doit être observée lors de la mobilisation molle des 2 segments à l’aide d’une pince.
13. Fermer l’approche cutanée avec des sutures en soie (4/0) avec des sutures séparées. Aucune suture n’est nécessaire dans le périoste.
    REMARQUE : Alternativement, l’approche cutanée peut être suturée avec d’autres sutures non adsorbables (par exemple, des sutures en polypropylène).
14. Effectuer des radiographies latérales céphaliques pour confirmer la direction de la fracture (Figure 3).
    1. Placez à nouveau la souris dans le réservoir d’isoflurane pour une courte réinduction avant d’effectuer les radiographies. Ensuite, placez la souris en extension, sur le côté latéral, avec la tête légèrement en hyperextension pour l’analyse aux rayons X.
    2. En cas de fracture trop placée en avant au niveau d’une molaire mandibulaire ou lorsque la fracture a détaché l’angle mandibulaire (Figure 4), observez une augmentation anormale du volume du cal osseux. Dans ces cas, excluez les animaux de l’étude pour éviter tout biais dans l’analyse.
15. Vérifiez les souris jusqu’à ce qu’elles reprennent conscience avant de les remettre dans la cage.

3. Soins postopératoires

1. Préparez une cage à souris sans croquettes et enrichissement dur pour éviter toute force masticatoire.
2. Isolez la souris opérée dans une seule cage pendant la^{1ère semaine} jusqu’à ce que la peau soit complètement cicatrisée. À 1 semaine après l’opération, le groupe a opéré des souris femelles ensemble dans la même cage.
3. Administrer de la buprénorphine (0,1 mg/kg) par injections sous-cutanées 4 h, 24 h, 48 h et 72 h après l’intervention.
4. Nourrissez les souris avec du gel diététique mou pendant toutes les périodes postopératoires du jour 0 à la fin de la période de consolidation (c’est-à-dire 28 jours) pour éviter la douleur et le déplacement secondaire de la fracture.
5. Pesez quotidiennement les souris du jour 0 au jour 4 après la fracture, le matin, avant l’injection de buprénorphine, puis 3 fois par semaine jusqu’au sacrifice de l’animal (14 jours après la fracture).
6. Évaluer le bien-être des animaux postopératoires afin d’optimiser les soins postopératoires aux animaux. Utilisez l’échelle de score du tableau 1 pour évaluer l’état postopératoire de l’animal et adapter le suivi. Lorsque le score est > 1, une injection de buprénorphine est administrée, et lorsque le score est > 3 et/ou en cas de perte de poids > 20 % du poids préopératoire malgré l’enrichissement alimentaire, l’euthanasie doit être discutée (Tableau 1).

Résultats

En ce qui concerne les interventions chirurgicales in vivo , pour réaliser de manière optimale cette procédure de fracture mandibulaire non stabilisée dans un modèle murin, un apprentissage et une formation spécifiques sont nécessaires.

Cette technique de fracture mandibulaire non stabilisée permet d’étudier le processus de réparation de l’os endochondral. Après l’euthanasie, des échantillons mandibulaires ont été prélevés dans du paraformaldéhyde à 4 % (24 h). Après une décalcificati...

Discussion

La technique permet de réaliser des fractures mandibulaires non stabilisées dans un modèle murin dans le cadre d’une approche ouverte minimale dans un court laps de temps (environ 10 min ou moins). Cette procédure de courte durée limite le risque de morbidité et de mort animale, en particulier chez les petits animaux comme les souris. Pour obtenir des résultats comparables dans l’analyse du processus de réparation osseuse endochondrale, il faut prendre un soin particulier à effectuer les...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Buprénorphine : Buprecare 0.3 mg/kg	Élévateur Animalcare
Largeur OBWEGESER 6mm Longueur 17,5cm  ;	Collin Medical	HA 5905
Pince : Plaque de coussin MORIA 11 cm N° ; 5	MORIA	9906
Table chauffante Bioseblab 55 cm x 33 cm	Bioseblab	707
Porte-aiguille : Micro Halsey Porte-Aiguille - Métal  ;	LABODERM	21,100
Neo Clear  ;	Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne	109843  ;
Ocry Gel Tube 10 g (lubrifiant pour les yeux)	tvm lab  ;   ;	3.70045E+12
Piezotome 2 ASS FINAL	ACTEON	X57402
Insert piézotome Piezocision PZ3	ACTEON	F87574
Ciseaux micro  ;	MORIA	MC52
Sutures en soie PERMA HAND SEIDE  ; / MERSILK	ETHICON	REF 18501G  ;
Ciseaux droits	MORIA	4877A
Vetflurane (isoflurane) 250 ml	VIRBAC	VET066 (Centravet)