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Utilisation de l’administration de médicaments guidée par micropipette comme méthode alternative au gavage oral chez les rongeurs

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DOI :

10.3791/66836

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26 juillet 2024

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1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, 4Department of Urology, Johns Hopkins University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons l’administration de médicaments guidée par micropipette (MDA) comme une méthode alternative au gavage oral qui incite l’animal de recherche à ingérer facilement les traitements avec un minimum de stress et d’inconfort.

Résumé

Le gavage oral (OG) à l’aide d’une canule attachée à une seringue est l’une des méthodes les plus couramment utilisées pour administrer un dosage précis de composés à l’estomac des animaux de recherche. Malheureusement, cette méthode présente des difficultés tant pour l’opérateur que pour l’animal de recherche. Des études ont montré que l’OG peut entraîner des complications, notamment l’œsophagite, la perforation de l’œsophage et l’administration accidentelle de médicaments trachéaux. De plus, l’OG est associé à une augmentation des taux plasmatiques et fécaux de corticostérone (en raison du stress), à une altération de la pression artérielle et à une augmentation de la fréquence cardiaque, ce qui pourrait influencer négativement ou biaiser les résultats de l’étude. Une méthode alternative précédemment développée, appelée administration de médicaments guidée par micropipette (MDA), incite l’animal à consommer facilement des traitements de manière peu invasive. Ici, nous présentons des exemples de l’utilisation de la technique MDA avec des traitements reconstitués dans différents véhicules et démontrons l’efficacité de l’administration des traitements variés à plusieurs souches de souris différentes. Nous démontrons en outre que la MDA est une technique qui diminue le moment et le caractère invasif de l’administration des médicaments et n’affecte pas la composition du microbiome intestinal telle qu’évaluée par l’analyse quantitative des espèces microbiennes intestinales de base. Dans l’ensemble, la MDA peut offrir une alternative moins stressante et efficace à la GO.

Introduction

L’administration de médicaments aux modèles de rongeurs se fait généralement par gavage oral (OG), qui consiste à administrer une préparation liquide directement dans l’estomac à l’aide d’une canule attachée à une seringue contenant la solution. Cette technique permet d’obtenir un dosage constant et précis du traitement à l’animal, mais comporte également de multiples inconvénients. L’OG a fait l’objet d’un examen minutieux pour ne pas avoir modélisé de manière adéquate les expositions alimentaires humaines 1,2. De plus, l’OG augmente le risque de lésions involontaires du système digestif supérieur (perforation de l’œsophage et de l’estomac), d’aspiration du traitement administré et de lésions des voies respiratoires3. L’OG est également associée à l’inconfort4, à l’augmentation de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque5, ainsi qu’au stress 6,7 et parfois à la mort8 en raison d’une diminution de la tolérance au gavage par l’animal. Ces changements physiologiques peuvent interférer avec ou fausser les résultats expérimentaux ; Ainsi, de nouvelles procédures ont été explorées pour éviter ces effets secondaires. Des études ont utilisé des procédures alternatives à l’OG, telles que l’utilisation de gélatine comme véhicule médicamenteux9, des bandelettes dissolvantes par voie orale (SACO)10, des aiguilles de gavage enrobées de saccharose11, des sondes d’alimentation flexibles, des biscuits de blé12, du miel13 et des granulés de beurre d’arachide14. Malheureusement, ces modifications de la technique OG présentent des limites, notamment l’incompatibilité avec les médicaments insolubles dans l’eau, le temps de préparation plus long pour le traitement15, l’appétence et la stabilité du médicament15, et la familiarisation de l’animal avec la nourriture. De plus, il est possible que le dosage soit moins précis lorsque les animaux se nourrissent à volonté.

Scarborough et al.7 ont précédemment mis au point une méthode alternative de traitement oral chez la souris, qu’ils ont appelée administration de médicaments guidée par micropipette (MDA). Cette méthode d’administration est basée sur une solution de lait concentré sucré comme véhicule pour les substances pharmacologiques, ce qui motive les animaux de l’étude à consommer facilement le véhicule préparé et/ou les solutions médicamenteuses en distribuant la solution à l’aide d’une pipette monocanal et d’une pointe de pipette. Pour introduire cette technique, les rongeurs suivent une séance d’entraînement (minimum 2 jours) afin de raccourcir les temps de manipulation et de permettre à l’animal d’étude de se familiariser avec l’abreuvement de la pointe4 de la pipette. Les premières études de validation menées par Scarborough et coll.7 et Schalbetter et coll.16 suggèrent que la procédure d’AMM est facile à mettre en œuvre, rentable, peu invasive et moins stressante pour les animaux que les méthodes conventionnelles de gavage oral. Scarborough et al. ont introduit l’utilisation de la technique MDA dans un modèle murin d’activation immunitaire maternelle (MIA) des troubles neurodéveloppementaux7. Cette étude a démontré que les profils pharmacocinétiques des souris traitées avec l’antipsychotique rispéridone à l’aide de la MDA étaient comparables à l’utilisation de l’OG. De plus, la MDA n’a pas induit d’augmentation des niveaux de corticostérone (une hormone du stress) chez les souris, et le traitement chronique par rispéridone utilisant la technique MDA a conduit à une diminution dose-dépendante des déficits d’interaction sociale induits par la MIA et de l’hypersensibilité aux amphétamines7. D’autres études ont exploré l’efficacité de la MDA par rapport à l’OG dans des modèles de souris17 et de rat18 . La MDA a également été comparée à l’injection intrapéritonéale et s’est avérée aussi efficace pour administrer du N-oxyde de clozapine aux souris16. En raison du succès rapporté de la MDA dans la réduction du stress animal et de l’efficacité thérapeutique, nous visons maintenant à explorer davantage la technique MDA en tant que méthode efficace d’administration de médicaments en utilisant des modèles murins supplémentaires. Ici, nous décrivons la mise en œuvre de la méthode MDA pour traiter différentes souches de souris, y compris les souches FVB/NJ et C57BL/6J immunocompétentes et la souche immunodéprimée NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) avec différents traitements oraux, y compris des bactéries vivantes, des composés expérimentaux administrés dans des solutions insolubles dans l’eau (huile de maïs) et des contrôles de véhicules. Nous avons évalué l’activité et la présence des différents traitements dans le sérum et les matières fécales, et nous avons évalué les altérations du microbiote intestinal central en relation avec la méthode MDA.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives de l’établissement et aux protocoles approuvés par l’IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) de l’Université Johns Hopkins M021M197 et M023M195. Les souches de souris utilisées (souris mâles, âgées de 7 semaines) sont décrites dans la table des matières. L’utilisation de souris mâles était due à leur utilisation dans les études en cours sur le cancer de la prostate. La méthode MDA s’est déjà avérée efficace chez les souris femelles 7,17. Les souris ont été randomisées dans leurs cages/groupes de traitement respectifs. Les souris ont été traitées dans des cages et sans ordre particulier. L’expérimentateur qui administrait les traitements était aveugle au groupe de traitement. Le numéro attribué à une souris faisait référence à son identifiant et non à l’ordre dans lequel elle a été traitée. Les données ont été collectées tout au long de la chronologie de l’étude et analysées à la fin pour éviter tout biais. Les tests expérimentaux ont été mis à l’insu du groupe de traitement jusqu’à ce que toutes les données soient recueillies.

REMARQUE : Ce protocole a été modifié à partir de Scarborough et al.7.

1. Préparation des traitements

  1. Préparez une solution de lait concentré sucré (ingrédients : lait et sucre) et d’eau de biologie moléculaire en utilisant un rapport lait/eau de 3:10. Mesurer le lait concentré sucré à l’aide d’un tube conique de 15 mL en raison de la viscosité du lait.
  2. À l’aide d’un tube conique de 50 ml, mélangez de l’eau de biologie moléculaire avec le lait concentré sucré en mélangeant lentement 5 ml d’eau à la fois avec le lait.
    REMARQUE : Cette étape est effectuée dans des conditions stériles à l’aide d’une enceinte de biosécurité.
  3. Préparez les aliquotes de la solution de lait (stockées sous forme d’aliquotes de 500 μL) et stockez-les à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient associées au traitement d’intérêt.
  4. Remettre les traitements en suspension dans leurs véhicules respectifs à la bonne concentration en fonction du poids corporel de l’animal avant de les combiner avec la solution condensée sucrée de lait et d’eau.

2. Séance de formation MDA

REMARQUE : Cette section décrit les modèles de souris ; cependant, la technique MDA pourrait être étendue au besoin avec des volumes/pointes de pipette plus importants pour les modèles de rongeurs plus grands.

  1. FACULTATIF : Retenez doucement l’animal d’étude en tenant la peau du cou d’une main.
  2. Offrez à l’animal d’étude 100 μL de solution de lait concentré sucré/eau uniquement (sans l’ajout du traitement expérimental) à l’aide d’une pipette monocanal et d’une pointe de pipette de 200 μL qui est guidée vers la bouche.
  3. Distribuez lentement la solution lait/eau pour éviter de manquer la bouche de l’animal. Assurez-vous que l’animal consomme facilement la solution de lait entre 5 et 15 secondes.
    REMARQUE : Cette formation se déroule pendant au moins 2 jours consécutifs (une séance d’entraînement par jour), sans modification du volume administré. Une légère retenue de la part de Scruff a été nécessaire pour les séances d’entraînement de MDA. Scarborough et al.7 recommandent la contention complète de l’animal le premier jour de la formation MDA, puis la contention par la queue le deuxième jour. La méthode de contention peut différer pour les modèles de rongeurs plus grands. En revanche, Vanhecke et al.17 n’ont tenu les souris que légèrement par la queue pendant l’entraînement.

3. Traitements chez la souris à l’aide de la méthode MDA

  1. Combinez le traitement à l’étude avec la solution de lait concentré sucré/eau (voir ci-dessous des exemples avec des expériences de validation [section 4 et section 5]).
  2. FACULTATIF : Retenez doucement l’animal d’étude en tenant la peau du cou d’une main.
    REMARQUE : Scarborough et coll.7 rapportent que les souris n’ont plus besoin d’être contraintes au-delà de la période d’entraînement et qu’elles boivent facilement à l’extrémité de la pipette. En revanche, Vanhecke et coll.17 rapportent que pour certains traitements (p. ex., le tamoxifène) qui pourraient présenter une légère aversion au goût, la meilleure façon de réaliser l’AMM est de retenir doucement les souris à l’aide d’une peau pendant tous les traitements. Cette étude a également déterminé que le fait de positionner l’animal sur le dos avec une peau douce améliore le temps et l’efficacité de la consommation du traitement.
  3. Administrer 100 μL de traitement à l’aide d’une pipette monocanal et d’une pointe de pipette de 200 μL guidée vers la bouche de l’animal, comme cela a été fait lors des séances de formation.
  4. Traitez un seul animal à la fois.
  5. Remettez chaque animal dans sa cage respective après le traitement.
    REMARQUE : Les traitements utilisant la méthode MDA peuvent être administrés quotidiennement ou de manière répétée 7,17.

4. Expérience de validation #1 - administration orale de bactéries intestinales à des souris à l’aide de la MDA

REMARQUE : Cette section décrit l’utilisation de la méthode MDA pour administrer par voie orale des bactéries vivantes pour les études de colonisation intestinale chez la souris. Dans cette expérience pilote représentative, la bactérie à Gram positif Clostridium scindens est administrée à des souris C57BL/6J. Les souris ont été traitées avec des antibiotiques (céfoxitine) pendant deux jours consécutifs dans l’eau de boisson avant l’inoculation bactérienne avec MDA.

  1. Culture bactérienne
    1. Cultiver la souche ATCC 35704 de C. scindens dans un bouillon clostridien renforcé (RCB) à l’aide d’un stock de glycérol congelé pour inoculer 500 μL de bactéries dans un tube de 7 mL de RCB. Cultiver en anaérobie pendant la nuit à 37 °C.
    2. Utilisez 500 μL de la culture bactérienne de nuit pour inoculer un nouveau tube RCB et incuber en anaérobie pendant 24 h. Retirez ce tube de la chambre anaérobie et utilisez-le pour préparer le traitement bactérien pour l’AMM. Utilisez ce même tube pour calculer les unités formant colonies par millilitre (UFC/mL).
  2. Calcul de l’UFC/mL de C. scindens
    1. Créer une dilution de 1:3 de la culture de C. scindens en utilisant 3,5 mL de la culture inoculée dans 7 mL de milieu RCB. À l’aide d’un échantillon de cette dilution, on obtient un stock de glycérol de 1 mL à 20 % (1:1) qui est stocké à -80 °C.
    2. Plaque 100 μL de la dilution 1:3 sur des plaques de gélose clostridiale renforcée (RCA). Utilisez la première dilution pour effectuer les diluations en série suivantes et la plaque pour un total de trois fois de plus.
    3. Après l’incubation des plaques RCA, comptez les colonies et calculez l’UFC. Utilisez l’équation suivante pour calculer la concentration de cellules bactériennes dans les échantillons dilués et originaux :
      UFC dans l’échantillon dilué (cellules/mL) = (nombre de colonies comptées sur la plaque d’ACR)/(quantité d’échantillon dilué ajoutée à la plaque d’ACR en mL)
      UFC dans l’échantillon d’origine (cellules/mL) = (UFC dans l’échantillon dilué)/(dilution de la plaque d’ACR)
  3. Préparation du traitement à C. scindens pour l’AMM
    1. Combinez une solution de 50 μL (1,265 x 106 UFC/mL dans cet exemple) de C. scindens + 50 μL de la solution condensée sucrée de lait et d’eau.
      REMARQUE : Si une UFC spécifique est nécessaire, une autre méthode de quantification des cellules bactériennes peut être utilisée, telle que la création d’une courbe standard avec des mesures de densité optique (DO) à 600 nm.
  4. Traitement oral de souris par C. scindens à l’aide de MDA
    1. Les jours 1 à 3, familiarisez les souris avec la solution de lait comme décrit dans la section 2 (séance d’entraînement MDA).
    2. Le jour 4, administrer 100 μL de la solution de lait C. scindens + ou de PBS (témoin) + solution de lait par MDA à des souris C57BL/6J. Traitez les souris une fois pendant toute la durée de l’étude.
  5. Prélèvement d’échantillons fécaux
    1. Tenez la souris par une légère peau et attendez qu’elle décharge une boulette fécale. Prélevez les boulettes fécales directement du rectum dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 ml. Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à utilisation.
  6. PCR quantitative de C. scindens (qPCR)
    1. Effectuer l’extraction de l’ADN fécal à l’aide d’un protocole précédemment publié19,20.
    2. Déterminez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre à ADN pour une détection haute sensibilité. Normaliser les échantillons d’ADN à 10 ng/μL et les conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
    3. Utilisez la qPCR pour étudier l’abondance de : (i) bactéries C. scindens à l’aide d’amorces conservées contre le gène desA de la souche ATCC 35704 de C. scindens, (ii) bactéries totales à l’aide d’amorces conçues contre la région hypervariable V6 du gène de l’ARNr bactérien 16S comme décrit précédemment20,21.
      REMARQUE : Les conditions de qPCR et les amorces utilisées sont répertoriées dans le Tableau 1. Une courbe standard utilisant l’ADN de la souche ATCC 35704 de C. scindens a été utilisée pour estimer les copies de la bactérie desA+.

5. Expérience de validation #2 - administration expérimentale de médicaments à des souris à l’aide de la MDA

REMARQUE : Cette section décrit l’utilisation de la méthode MDA pour administrer un composé expérimental à des souris. Dans cette expérience pilote représentative, le métabolite du soja equol (S-equol) est administré à des souris NSG et FVB/NJ.

  1. Préparation du traitement S-equol
    REMARQUE : Le S-equol et le diméthylsulfoxyde (DMSO) sont tous deux aliquotes et stockés à -20 °C jusqu’à leur utilisation.
    1. Reconstitue le S-équol dans le DMSO associé à de l’huile de maïs (90 %). Mélanger du S-équol aliquote dans de l’huile de maïs (220 μL) avec 480 μL de la solution condensée sucrée de lait et d’eau. Combinez et mélangez cette solution dans la salle animalière pour éviter la séparation de l’huile du lait.
      REMARQUE : Si la séparation de la solution est observée, mélangez la solution avant le traitement. La dose de S-équol administrée est de 25 mg/kg/jour. Les souris utilisées dans cette étude avaient toutes un poids similaire, elles ont donc reçu la même dose. Il peut être nécessaire d’ajuster la dose du traitement et de la transformer en plusieurs préparations en fonction du poids des animaux à l’étude.
    2. Combinez le véhicule DMSO avec de l’huile de maïs (90 %). Mélanger du DMSO aliquote dans de l’huile de maïs (220 μL) avec 480 μL de la solution condensée sucrée de lait et d’eau. Combinez et mélangez cette solution dans la salle animalière pour éviter la séparation de l’huile du lait.
      REMARQUE : Si la séparation de la solution est observée, mélangez la solution avant le traitement.
  2. Traitement oral de souris avec du S-équol par MDA
    1. Les jours 1 et 2, familiarisez les souris avec la solution de lait comme décrit dans la section 2 (séance d’entraînement MDA).
      REMARQUE : Pour l’expérience de validation #1, le temps d’entraînement décrit dans Scarborough et al. a été suivi, ce qui suggère un temps d’acclimatation de 3 jours. Dans cette expérience, un temps d’entraînement plus court (2 jours) a été testé et a révélé qu’il ne modifiait pas l’administration des traitements d’intérêt.
    2. Aux jours 3 à 43, traiter les souris avec (i) un témoin PBS, (ii) un véhicule DMSO ou (iii) du S-equol, le tout combiné avec la solution condensée sucrée de lait et d’eau. Faites un mélange principal de la solution pour fournir une solution homogène des traitements à tous les animaux étudiés. Administrer un volume total de 100 μL à chaque souris une fois par jour, 5 jours par semaine, pour un total de 43 jours.
  3. Prélèvement sanguin
    1. Prélever du sang après l’euthanasie (surdose de dioxyde de carbone) par ponction cardiaque. Transférez le sang dans un tube séparateur de sérum microtainer, mélangez et conservez à température ambiante (RT) jusqu’à ce que le traitement soit ultérieur.
    2. Centrifuger l’échantillon de sang pour compléter la séparation à 254 x g pendant 5 min. Prélever le sérum (couche supérieure de séparation) et le conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
  4. Chromatographie liquide S-equol avec spectrométrie de masse en tandem (LC/MS/MS)
    1. Reportez-vous au fichier de la Table des matériaux pour connaître les produits chimiques et les réactifs utilisés pour cette expérience.
    2. Étalons d’étalonnage et contrôle de la qualité : Préparer des solutions mères de S-équol et d’étalon interne (racémique équol-d4) dans du DMSO à des concentrations de 1 mg/mL et les conserver à -20 °C.
    3. Diluer les solutions mères étalons avec de l’acétonitrile et de l’eau (50:50) pour préparer une solution de travail mixte de différentes concentrations. Préparer l’étalon interne dans de l’acétate d’éthyle comme solution d’extraction à une concentration de 100 ng/mL. Conservez les stocks et les solutions de travail à 4 °C et utilisez-les quotidiennement, diluées ou directement.
    4. Extraction d’échantillons
      1. Préparer l’échantillon en utilisant la précipitation des protéines par une solution d’extraction (acétate d’éthyle plus étalon interne, voir section 5.4.3), suivie d’une centrifugation et d’une évaporation du surnageant sous azote sec (50 °C).
      2. Reconstituer l’échantillon dans 100 μL d’acétonitrile à 50 % et le transférer dans des flacons d’échantillonneur automatique pour l’analyse LC/MS/MS.
    5. Séparation des échantillons
      1. Réalisez la séparation avec une colonne C18, 2,1 x 50 mm, 1,7 μm. Utilisez de l’acide formique à 0,1 % comme phase mobile A et de l’acide formique à 0,1 % dans la phase mobile B de l’acétonitrile.
      2. Utilisez un gradient et maintenez la phase B mobile à 40 % avec un débit de 0,3 mL/min pendant 0,5 min. Ensuite, augmentez le débit à 100 % sur 1 min, maintenez-le pendant 2 min, puis revenez à 40 % B pendant 1 min.
      3. Surveiller l’effluent de la colonne à l’aide d’un détecteur spectrométrique de masse par ionisation par électronébulisation, qui fonctionne en mode négatif. Programmez le spectromètre pour surveiller les transitions de surveillance des réactions multiples (MRM) suivantes : 241 → 119.1 pour S-equol et 245 → 123 pour l’étalon interne, equol-d4.
      4. Calculer la courbe d’étalonnage pour S-equol à l’aide du rapport de surface crête de l’analyse par rapport à l’étalon interne à l’aide d’une équation quadratique avec une fonction de pondération de 1/x2 à l’aide des plages d’étalonnage de 5 à 500 ng/mL.

6. Mesurer l’effet du traitement à la MDA sur le microbiote intestinal central

REMARQUE : Cette section décrit l’utilisation de la qPCR pour mesurer les niveaux de microbiote intestinal central après un traitement MDA.

  1. Effectuer le prélèvement d’échantillons fécaux et l’extraction de l’ADN comme décrit aux étapes 4.5.1 et 4.6.1.
  2. Déterminez la concentration d’ADN à l’aide d’un fluorimètre à ADN pour une détection haute sensibilité. Normaliser les échantillons d’ADN à 10 ng/μL et les conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
  3. Utilisez la qPCR pour étudier l’abondance des membres du microbiote intestinal : (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp., et (v) bactéries totales à l’aide d’amorces conçues contre la région hypervariable V6 du gène de l’ARNr bactérien 16S comme décrit précédemment 20,21,22.
    REMARQUE : Les conditions de qPCR et les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau 2.

Résultats

La MDA peut être utilisée dans l’administration orale de souches bactériennes dans des modèles murins. Les souris C57BL/6J ont été traitées avec des antibiotiques (céfoxitine dans l’eau potable) pendant 2 jours pour éliminer les communautés microbiennes commensales avant de commencer la séance d’entraînement MDA. La solution condensée sucrée de lait et d’eau a été administrée une fois par jour consécutivement pendant 3 jours avant l’administration du traitement. Les souris ont été brièvement retenues par une légère peau pendant l’administration du traitement MDA. Au jour 4, les souris ont été traitées une fois avec du PBS (contrôle négatif, n = 4) ou une culture anaérobie de C. scindens (bactérie desA+, n = 4) qui avait été préalablement remise en suspension dans la solution de lait concentré sucré / eau. Toutes les souris ont généralement pris les traitements en quelques secondes et ont bu toute la dose (100 μL). Pour valider l’administration et la présence des bactéries anaérobies, nous avons comparé des échantillons fécaux prélevés après un traitement antibiotique à des échantillons fécaux prélevés 24 h après un traitement par PBS ou C. scindens (Figure 1). L’ADN fécal a été isolé, quantifié et normalisé à 10 ng/μL pour effectuer une qPCR à l’aide d’amorces spécifiques du gène ATCC 35704 desA de C. scindens (tableau 1). Nous avons observé que les souris traitées aux antibiotiques avaient peu ou pas de bactéries desA+. Comme prévu, nous avons observé une quantité significativement plus élevée de bactéries desA+ chez les souris traitées à C. scindens, ce qui était significativement différent de celles du groupe témoin PBS (p = 0,0286, Figure 1).

Administration d’un composé expérimental (S-equol) à l’aide de la méthode MDA. Les souris NSG (n = 15) et FVB/NJ (n = 18) ont été entraînées avec la solution de lait condensé sucré et d’eau deux jours avant l’administration du traitement. Les souris NSG ont subi un traitement antibiotique (céfoxitine dans l’eau potable) pour éliminer les bactéries intestinales productrices d’équol et, par conséquent, la production endogène d’équol. Les souris FVB/NJ ont été nourries avec un régime sans soja pour éliminer la production endogène d’équol. Toutes les souris ont été brièvement retenues par une douce peau afin d’administrer les traitements. Le groupe témoin a reçu la solution de lait et d’eau condensée sucrée en combinaison avec de l’huile de maïs, le groupe DMSO (contrôle du véhicule pour S-equol) a reçu la solution de lait condensé sucré et d’eau et le DMSO dans l’huile de maïs, et le groupe equol a reçu une solution condensée de lait et d’eau sucrée et l’équol dans l’huile de maïs. Les souris ont été traitées cinq jours par semaine avec la technique MDA pendant un total de 43 jours. Les souris prenaient généralement les traitements en quelques secondes et buvaient toute la dose (100 μL). Dans l’ensemble, toutes les souris ont consommé au moins la moitié de la dose un jour donné (dose partielle un jour donné, mais dose complète la veille ou le lendemain). Aucune des souris n’a refusé le traitement entièrement au cours de l’étude. Nous avons observé qu’après l’égratignage, le positionnement des souris sur le dos améliorait le temps de consommation du traitement et garantissait que l’animal prenait la dose complète.

Les taux d’equol circulants démontrent l’efficacité de l’administration du médicament MDA. Des échantillons de sang ont été prélevés sur les souris NSG après l’euthanasie à la fin de l’étude pour valider que l’administration d’equol par MDA a entraîné des niveaux d’equol circulants chez les animaux étudiés. Nous n’avons pas récupéré suffisamment de sang chez l’une des souris traitées à l’equol pour effectuer le test LC/MS/MS. Les taux sériques d’equol ont été mesurés par LC/MS/MS à l’Analytical Pharmacology Shared Resource de la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins. Nous n’avons observé aucun equol circulant dans les groupes témoins et DMSO (equol vehicle), tandis que les souris traitées à l’equol avaient de l’equol circulant détectable (Figure 2). Il est important de noter que nous nous attendons à une certaine variation des niveaux d’equol circulant chez les souris traitées à l’equol en raison des dates et des heures différentes de sacrifice d’animaux dans cette expérience.

Les communautés microbiennes intestinales restent inchangées après le traitement par AMM. L’effet de la solution de lait MDA (avec et sans equol) sur le microbiote intestinal a été évalué à l’aide de souris FVB/NJ. Nous avons quantifié la composition microbienne des échantillons prélevés au départ (aucun traitement/pas de MDA) et des échantillons prélevés 7 jours après le début du traitement (9 jours après le début du MDA, y compris les jours de formation). Nous n’avons observé aucun changement significatif dans la charge bactérienne totale ou la composition microbienne globale du microbiote intestinal de base (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.) tel qu’évalué par l’analyse qPCR spécifique à l’espèce (Figure 3) comme décrit précédemment21,22. Une cage a montré une différence significative chez les lactobacilles entre le départ et après le traitement par AMM ; cependant, cette constatation a été observée dans le contrôle des véhicules DMSO et n’était pas uniforme dans toutes les cages.

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Figure 1 : La MDA libère des bactéries anaérobies dans l’intestin de la souris qui peuvent être quantifiées par qPCR fécale. Les souris C57BL/6J ont été traitées avec des antibiotiques pendant deux jours consécutifs dans l’eau de boisson. Les souris ont ensuite été traitées avec la bactérie anaérobie C. scindens à l’aide de la méthode MDA. La charge bactérienne fécale de C. scindens (desA+) a été mesurée par qPCR pour le gène desA à la fois après un traitement antibiotique et 24 heures après le traitement MDA (PBS ou C. scindens). (A) La quantification du gène desA spécifique de C. scindens est mise en évidence entre les souris traitées par PBS et C. scindens après un traitement antibiotique et 24 heures après le traitement par AMM. (B) Les mêmes données pour 24 h après l’AMM en (A) sont présentées sous forme de graphique à colonnes. La signification statistique a été déterminée à l’aide d’un test de Mann-Whitney non paramétrique. (*) p = 0,0286, barres d’erreur = SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Analyse des taux d’equol circulant chez des souris NSG traitées à l’equol via la technique MDA. Les taux sériques d’equol ont été quantifiés par LC/MS/MS chez des souris témoins (n = 5), DMSO (véhicule, n = 5) et equol (n = 4) traitées. Il n’y a pas eu suffisamment de sang prélevé sur l’une des souris traitées à l’equol pour effectuer une LC/MS/MS. Ces traitements ont été administrés selon la méthode MDA. L’equol sérique n’était détectable que dans le groupe traité par l’equol. Limite de quantification < 5 ng/mL. La signification statistique a été déterminée à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle non paramétrique avec des comparaisons multiples (correction de Dunn). (**) p = 0,0053, barres d’erreur = SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Les bactéries intestinales de base et la charge bactérienne totale sont inchangées chez les souris FVB/NJ après un traitement MDA. Aucun changement significatif n’a été observé dans les valeurs de Cq de la qPCR pour les communautés microbiennes ciblées avant et après l’administration du traitement à l’aide de la méthode MDA. Les lactobacilles n’ont montré une différence significative (*, p = 0,0321) que dans la cage 3 entre le traitement initial et le traitement par AMM. Cette constatation n’était pas uniforme d’une cage à l’autre. Les numéros de cage sont marqués C1-C4. La signification statistique a été déterminée à l’aide d’une ANOVA à un facteur avec comparaisons multiples (correction de Tukey). Barres d’erreur = SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Nom de baseSéquences d’amorçageConditions de PCR
DesA_CS_F5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3'93 °C 3 min, 34 cycles (95 °C 30 s, 54 °C 30 s)
DesA_CS_R5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

Tableau 1 : Amorces et conditions de qPCR pour la bactérie desA+ (C. scindens).

Nom de baseSéquences d’amorçageConditions de PCR
V6_F
V6_R		5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3'
5'-CRACACACGAGCTGACGAC-3'		95 °C, 3 min
36 cycles
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
A.muc_F
A.muc_R		5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3'
5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'		50 °C, 5 min
95 °C, 10 min
40 cycles
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Bifido_F
Bifido_R		5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3'
5'-TGATAGGACGCGACCCCA-3'		95 °C, 3 min
36 cycles
95 °C, 30 s
53 °C, 30 s
S. salivarius_F
S. salivarius_R		5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3'
5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'		95 °C, 10 min
44 cycles
95 °C, 15 s
60 °C, 1 min
Lacto_F
Lacto_R		5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3'
5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'		50 °C, 2 min
95 °C, 10 min
40 cycles
95 °C, 15 s
62 °C, 1 min

Tableau 2 : Amorces et conditions de qPCR utilisées pour mesurer l’effet de la MDA sur le microbiote intestinal central.

Discussion

La MO peut être une source importante de stress chez les animaux de recherche qui peut créer une variable confondante, comme l’ont déjà évalué plusieurs études 7,9,11,12,13,14,15,23. En raison de l’invasivité de la guerre d’outre-guerre, d’autres techniques ont été employées pour minimiser les défis associés à la chaîne d’État9, 10, 12, 13, 14, 15. L’administration de médicaments guidée par micropipette (MDA) est une nouvelle technique qui permet d’administrer un médicament de manière moins invasive à l’aide d’une pipette à canal unique et d’un mélange du médicament d’intérêt avec une solution de lait concentré sucré7. Une étape critique pour cette technique est la session de formation (minimum 2 jours) qui permet à l’animal de se familiariser avec la pointe de la pipette et l’arôme sucré du lait concentré, et réduit globalement les temps de manipulation et la détresse. Cette séance d’entraînement permet également aux souris de consommer facilement les médicaments incorporés dans la solution de lait concentré sucré beaucoup plus rapidement que les autres techniques et avec un dosage précis.

Nos études ont suivi de près les préparations et l’administration de la solution sucrée de lait condensé et d’eau présentée dans Scarborough et al.7. Pendant la durée de l’étude, les souris n’ont pas été privées d’eau ou de nourriture avant l’administration. Ils ont été gardés dans leur cage d’hébergement respective, et le moment des traitements était inférieur à 1 minute. L’une des principales différences dans nos études était que, peut-être en raison du potentiel de déficience visuelle dans les souches de souris albinos que nous avons utilisées et du potentiel de légère aversion au goût avec le traitement médicamenteux, toutes les souris ont nécessité une brève contention par un léger éraflage dans le cadre du protocole d’entraînement et de traitement. Cette modification des traitements MDA est recommandée par Vanhecke et al.16. La douce éraflure, ainsi que le positionnement des souris sur le dos, ont encouragé les souris à consommer avidement la solution de lait. Nous concluons que la nécessité d’un égratignage doux dans le cadre des étapes de formation et de traitement est facultative et dépendra de l’étude. L’administration des traitements (corrigée en fonction du poids corporel de l’animal, le cas échéant) a été administrée dans un volume standardisé, et les souris n’ont pas montré de changements de comportement. D’autres légères modifications apportées à l’étude initiale7 comprenaient une diminution du nombre de séances d’entraînement et des volumes administrés à chaque séance. Parmi les limites que nous avons rencontrées dans cette étude, citons la résistance de certaines souris à boire la dose complète (100 μL) de la solution de lait le premier jour de l’entraînement et à certains moments de l’étude. Cela a été surmonté en positionnant les souris sur le dos tout en étant retenues. Cette étude n’a pas évalué l’interaction du médicament avec la solution de lait concentré sucré, les différences de consommation entre les sexes de souris (bien que l’efficacité de la MDA ait déjà été démontrée chez les souris femelles 7,17), ou l’élévation des marqueurs de stress, tels que les niveaux de corticostérone 7,11,14, associés à l’OG.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la capacité de la technique MDA à délivrer une dose précise d’un traitement expérimental, puis nous avons évalué les niveaux fécaux et/ou circulants des traitements d’intérêt chez les animaux étudiés. Nous avons également évalué si le traitement par AMM modifie le microbiote intestinal, et nous avons observé des altérations minimes ou nulles du microbiote fécal central ou de la charge bactérienne fécale totale des animaux étudiés. De même, nous n’avons observé aucune blessure chez les animaux due au traitement MDA. En conclusion, la MDA peut servir de méthode alternative d’administration de traitement à court et à long terme dans des modèles de rongeurs. Dans l’ensemble, la MDA devrait avoir un impact positif sur le bien-être animal en réduisant le risque de blessures associées à l’OG. La MDA surmonte certaines des limites d’autres techniques et nous proposons qu’elle puisse être largement utilisée dans la recherche translationnelle dans de nombreux modèles de rongeurs différents24.

Remerciements

Nous tenons à souligner le soutien à la recherche du programme de recherche sur le cancer de la prostate du ministère de la Défense W81XWH-20-1-0274 et du prix 16CHAL13 de la Fondation du cancer de la prostate. Nous tenons à remercier la Dre Michelle Rudek, le Dr Noushin Rastkari, la Dre Nicole Anders et Linping Xu de l’Analytical Pharmacology Shared Resource de Johns Hopkins pour leur aide avec equol LC/MS/MS.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
200 et micro ; L pointes de pipetteMettler Toledo17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 détecteur spectrométrique de masseSciexN/A
Akkermansia muciniphila souche muc ADN génomiqueAmerican Type Culture CollectionBAA-835D-5
Acétate d’ammoniumSigma&ndash ; Aldrich5.43834
C57BL/6J sourisJackson LaboratoriesSouche # 000664
C. scindens souche 35704American Type Culture Collection35704
CefoxitinSagent  ;NDC25021-109-10
Huile de maïsMedChemExpressHY-Y1888
DMSOSigma-AldrichD2650
éthanolFisher ScientificAC611050040
Acide formiqueSigma&ndash ; Aldrich5.33002
FVB/NJ sourisJackson LaboratoriesSouche # 001800
GlycérolSigma&ndash ; AldrichG5516
HexaneFisher Scientific02-002-996
Eau de qualité LC-MSFisher Scientific14-650-357
MéthanolFisher Scientific02-003-340
Tube séparateur de sérum MicrotainerBecton Dickinson02-675-185
Eau de qualité biologie moléculaireCorning46-000-CI
Souris NSGJackson LaboratoriesSouche # 005557
PBSCorning21-031-CV
Qubit DNA HS kitInvitrogenQ32851
Racemic  ; equol-d4Santa Cruz Biotechnologysc-219827
Gélose clostridiale renforcéeSystèmes anaérobiesAS-6061
Bouillon clostridien renforcéSystèmes anaérobiesAS-606
S-equolMedChemExpressHY-100583
Étalon de référence S-equol pour LC-MSCayman Chemical 10010173
Single pipette à canalRainin17008652
Streptococcus salivarius ADN génomiqueAmerican Type Culture CollectionBAA-1024D-5
Lait concentré sucréCalifornia FarmsB09TGQ7WV8
VSL#3VSL#3B07WX1LVHL
&beta ;-glucuronidase de Helix pomatiaSigma&ndash ; AldrichG7017

Références

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  2. Craig, M. A., Elliott, J. F. Mice fed radiolabeled protein by gavage show sporadic passage of large quantities of intact material into the blood, an artifact not associated with voluntary feeding. Contemp Top Lab Anim Sci. 38 (5), 18-23 (1999).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
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