Article de méthode

Le protocole de l’unité d’AVC de souris avec notation neurologique standardisée pour les études translationnelles sur l’AVC de souris

DOI :

10.3791/66847

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7 février 2025

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1Department of Pharmacology Medical School of Athens, National and Kapodistrian University of Athens, 2Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), University of Munich Medical Center, 3Department of Neurointensive Care, Schoen Clinic Bad Aibling

Dans cet article

Résumé

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Cet article présente un protocole pour l’exécution du concept d’unité d’AVC de souris (mSU) hautement translationnel et éprouvé indépendamment chez les souris à grand AVC. Il fournit également un protocole standardisé pour l’exécution de l’échelle expérimentale focale d’AVC chez la souris, qui évalue les déficits focaux d’AVC détectés même à long terme.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le modèle filamentaire d’occlusion de l’artère moyenne (fMCAo) est peut-être le modèle d’AVC de souris le plus translationnel, permettant une ischémie contrôlée avec reperfusion/recanalisation intravasculaire. Cependant, il n’est pas harmonisé avec les progrès cliniques actuels en matière de soins de l’AVC (p. ex., les unités de l’AVC), utilise généralement une notation neurologique subjective ou vague entre les laboratoires et présente une mortalité élevée en phase aiguë. Ici, nous abordons ces limitations avec des protocoles vidéoguidés validés. Nous présentons le protocole de l’unité d’AVC chez la souris (mSU) avec des vidéos pédagogiques et un algorithme de décision (Risk Stratification Score), comblant ainsi le fossé entre la modélisation clinique et la modélisation de l’AVC chez la souris. Afin d’augmenter la précision et la sensibilité de la notation neurologique de l’AVC, nous présentons pour la première fois un format vidéo-standardisé de l’échelle focale de l’AVC expérimental (fESS) et prouvons sa valeur jusqu’à 6 mois après l’AVC. De plus, des protocoles pour le test de l’échelle de la souris, ainsi que le test connu du cylindre, pour une évaluation quantitative non biaisée de la fonction motrice des membres sont présentés. Les résultats mettent en évidence l’efficacité translationnelle de mSU. L’ESS focale (fESS) excelle par rapport aux autres échelles connues dans la détection des déficits focaux de l’AVC, la récupération et le maintien de la sensibilité jusqu’à 6 mois après l’AVC. Les tests à l’échelle et au cylindre quantifient et surveillent objectivement les déficits moteurs des membres antérieurs et postérieurs, à long terme. En résumé, l’intégration des tests mSU, fESS et de la fonction motrice fournit un cadre solide pour les investigations cliniquement pertinentes de l’AVC. Nos protocoles améliorent la valeur translationnelle de la recherche sur les accidents vasculaires cérébraux chez la souris.

Introduction

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L’AVC ischémique important est l’une des principales causes de morbidité et d’invalidité dans le monde1. Pourtant, la recherche sur l’AVC chez la souris se heurte à un blocage translationnel dans presque tous les traitements testés précliniquement jusqu’àprésent2. Les multiples raisons de ce problème et les efforts déployés pour le surmonter ont été examinés en détail dans la publication précédente2. Ces défis découlent de l’intégration limitée des progrès cliniques dans les modèles animaux pertinents2 et des faiblesses des systèmes de notation comportementale et neurologique dans la détection précise et sensible des déficits post-AVC2.

Des découvertes récentes3 confirment que le modèle filamentaire de l’occlusion de l’artère moyenne (fMCAo) chez la souris présente des avantages translationnels significatifs par rapport à d’autres modèles présentant des lésions et des traumatismes crâniens ouverts 2,4. En plus de cela, c’est le seul qui modélise la reperfusion et la thrombectomie mécanique des contextes cliniques d’AVC 5,6,7. Cependant, le modèle fait face à une mortalité subaiguë élevée entre 3 et 7 jours après l’AVC, ce qui interdit les études à long terme des grands AVC et était considéré jusqu’à récemment comme l’artefact inhérent et insurmontable du modèle. De plus, la détection des déficits neurologiques post-AVC est relativement difficile et biaisée chez la souris en raison de sa petite taille, en particulier chez les non-cliniciens ou les chercheurs inexpérimentés 8,9. Pour y remédier, différents groupes ont mis au point différentes échelles pour détecter les déficits. Les échelles les plus utilisées et les plus connues comprennent l’échelle de Bederson à 3 points (BS)10, l’échelle de Bederson modifiée à 5 points (mBS)11, le score Longa à 5 points (LS) (qui est similaire à mBS)6, l’échelle modifiée de l’AVC neurologique (mNSS)12,13, l’échelle de Garcia à 18 points (GS)9 et l’échelle plus détaillée de DeSimoni14 ou autrement connue sous le nom de « Neuroscore » (NS)9, Échelle 15. Malheureusement, certaines de ces échelles sont soit trop grossières et limitées aux quelques jours de phase aiguë suivant l’AVC (BS, mBS et LS)8,9, soit leur interprétation est brouillée par les déficits généraux (NS).

Dans ce contexte, nous avons précédemment développé et validé le protocole de support de l’unité d’AVC de souris (mSU), ainsi que l’échelle expérimentale d’AVC (ESS) pour les souris13. La raison d’être de mSU était d’adapter les connaissances de la routine clinique (c’est-à-dire les unités d’AVC humain) à la recherche préclinique sur l’AVC, tandis que l’ESS consolidait de manière critique les échelles d’AVC existantes mais « insensibles » ou redondantes en une échelle pratique, raffinée, sensible et efficace en termes de temps. L’USm consiste en une surveillance fréquente et adaptée des paramètres cliniques de base de la souris avec une application adaptée du soutien animal pour améliorer la survie13.

En effet, les données de notre laboratoire et d’autres vérifient la valeur des deux méthodes. Le mSU traduit les mesures de soutien cliniques de baseet fait progresser 7 de l’homme à la souris, réduit considérablement la mortalité du fMCAo chez la souris de 60-70% à 10-15%13, permettant ainsi des études sur des accidents vasculaires cérébraux plus importants, et peut être appliqué efficacement dans des laboratoires indépendants depuis lors 16,17,18,19. De plus, l’ESS peut faire la distinction entre les déficits et les symptômes post-AVC focaux (composante focale de l’ESS, fESS) et généraux (composante générale de l’ESS, gESS), modélise le score clinique humain (différenciation entre les signes et symptômes focaux et généraux chez l’homme), est linéairement lié à la taille de la lésion de l’AVC et est sensible à long terme aux déficits13,20. Pourtant, malgré la valeur et l’efficacité prouvées de mSU et d’ESS, l’absence d’instructions claires, visualisées et standardisées, même pour les chercheurs inexpérimentés, laisse plusieurs questions ouvertes sur l’application de mSU et une subjectivité significative sur l’évaluation des déficits focaux sur fESS.

En tant que tel, notre présent article vise à fournir des instructions claires et assistées par vidéo pour les protocoles mSU et fESS. Nous croyons fermement qu’il aidera les chercheurs sur l’AVC à augmenter l’efficacité translationnelle de leurs études sur l’AVC, à réduire considérablement la perte d’animaux au cours des 3 à 10 premiers jours après l’AVC, à réduire les coûts d’expérimentation et, éventuellement, à évaluer de manière reproductible les déficits neurologiques pendant des mois après l’AVC13. De plus, la combinaison supplémentaire du test de l’échelon de l’échelle et du test du cylindre peut facilement quantifier la parésie des membres focaux (membres antérieurs et postérieurs) due au fMCAo.

Pour mettre en évidence l’efficacité de mSU et de fESS, nous fournissons des données à moyen (14 jours) et à long terme (6 mois) sur des souris après fMCAo. Des souris C57Bl/6J mâles âgées de douze semaines (n = 31) ont été utilisées et logées à une température contrôlée (22 ± 2 °C), avec une période de cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès à de la nourriture en granulés et de l’eau à volonté. Les souris ont été divisées en deux cohortes suivies pendant 14 jours (n = 10, cohorte 1) et 6 mois (n = 15, cohorte 2) respectivement. Ces souris ont été soumises à une ischémie cérébrale de 60 minutes en utilisant le modèle bien décrit de fMCAo 13,20,21 sous anesthésie à l’isoflurane. Des animaux opérés fictivement (n = 6, opérés dans les deux cohortes ci-dessus, mais aucune ischémie n’a été induite) suivis pendant 6 mois ont servi de témoins. La buprénorphine a été utilisée comme analgésique préopératoire et postopératoire de 3 jours. Les tests de l’échelon et du cylindre de l’échelle ont également été effectués pour la cohorte de 6 mois dans le cadre de la notation neurologique.

Tous les animaux ont été vérifiés quotidiennement pour détecter les paramètres sans cruauté au cours des 14 premiers jours suivant l’alimentation, définis comme suit : 1) hypothermie grave (<33 °C) et/ou immobilité (p. ex., score de 4 au test 6 de la fESS ou test d'« activité spontanée » de la gESS) qui n’a pas été améliorée par le traitement de l’unité de course de souris (c.-à-d. chauffage passif et alimentation active, voir 1.4, 1,6, 1,8) dans l’heure, 2) signes de douleur ou de comportement anxieux (par exemple, score >2 au test « anxiété/comportement automatique » de gESS), même après une analgésie postopératoire conformément au protocole.

Dans ce protocole, le soutien post-AVC des souris sous forme de mSU commence immédiatement après la récupération de la souris après l’opération fMCAo. Celle-ci comporte 3 phases : la phase A (0-48 h après la reperfusion), la phase B (>48 h et jusqu’à la « fin du soutien actif nécessaire », généralement entre le 10e et le 14e jour, en fonction de la phase B de chaque animal), et la phase C (à partir du 14e jour). Il comporte cinq interventions significatives (visites/score de stratification du risque, alimentation, liquides, température et désinfections locales ; voir 1.1 à 1.8 ci-dessous) adaptées à chaque animal, en fonction de chaque phase (A, B ou C) et de son état clinique réel quotidien évalué par le score de stratification du risque (RSS), voir la figure supplémentaire 1 et le tableau 1 avec trois exemples typiques. Les matériaux et les outils nécessaires pour mSU sont illustrés à la figure 1a et décrits dans le tableau des matériaux. Nous fournissons également un modèle pour la surveillance des animaux pendant la mSU (voir le fichier supplémentaire 1).

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Protocole

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Les expériences rapportées dans cet article ont été menées conformément aux directives nationales et européennes pour l’utilisation d’animaux de laboratoire et ont été approuvées par les comités gouvernementaux grecs (Athènes, licence n° « 843895_06-09-2022 »).

1. L’unité de trait de souris (mSU)

  1. Évaluer quotidiennement l’état clinique de l’animal (« visites ») et calculer son score RSS
    1. Imprimez le Dossier Supplémentaire 1, de préférence avant la chirurgie de l’animal, pour l’enregistrement des données et le suivi.
    2. Évaluez chaque animal cliniquement à des moments standard (visites) : tôt le matin (vers 08h00), midi (entre 14h00 et 16h00) et tard le soir (vers 22h00 - 23h00).
      REMARQUE : Adaptez ces visites standard en fonction de la phase de suivi de l’animal : vérifiez l’état de l’animal 2x/jour (matin-nuit) pour la phase A, 3x/jour pour la phase B, et une fois par jour pour la phase C. Adaptez davantage la fréquence des visites en fonction du score RSS (voir 1.1.6). Travailler de préférence en équipe de >2 personnes pour réduire la charge de travail. Les visites du matin et du soir sont cruciales pour le soutien, la surveillance et la réduction de la mortalité, car la phase nocturne (active) des souris augmente les besoins métaboliques et énergétiques 13,22,23 et est liée à une augmentation de la mortalité nocturne post-AVC.
    3. Pesez la souris à l’aide d’une balance standard sensible lors de la visite du matin.
    4. Mesurez la température à l’aide d’un thermomètre sans contact placé sur le centre ventral de son corps lors de la visite matinale. Tenez et immobilisez la souris avec son dos. Prenez la lecture dans les premières secondes après l’immobilisation (voir Figure 1f).
      REMARQUE : N’utilisez pas de thermomètre rectal en raison d’une rupture intestinale potentielle après des mesures répétées avec une péritonite concomitante.
    5. Évaluer et consigner l’état clinique général de la souris (mobilité, plaies, capuchon de l’urètre, réactivité, fourrure, état d’hydratation, etc.) lors de la visite matinale pour toutes les phases, quotidiennement jusqu’au 14e jour.
    6. Calculez le score RSS lors de la visite du matin en additionnant les points en fonction du poids de l’animal, de sa température et de son score fESS, comme décrit dans la figure supplémentaire 1. Pour le calcul automatisé du RSS dans un tableur, utilisez et adaptez la formule du tableau 1. Euthanasier l’animal à l’aide d’une méthode approuvée par l’établissement, si des critères d’évaluation sans cruauté sont présents (voir ci-dessus).
    7. Adaptez à la fois la fréquence des visites et l’intensité de l’appui, quotidiennement en fonction du score RSS et de la phase post-AVC de l’animal.
      REMARQUE : La phase B est la plus critique pour la mortalité. Augmenter la fréquence des visites et l’intensité du soutien pour les RSS ≥3 (pour la définition et les instructions, voir le tableau 1). Si l’animal continue de présenter un RSS >3 en phase C, visitez-le et soutenez-le comme à la phase B. Utilisez le RSS et des descriptions générales (tels que rétablissement, stable, malade faible/moyen et gravement malade) pour décrire son état clinique au sein de l’équipe de soutien. Après le 14e jour, réduire les visites d’animaux à celles requises par le protocole expérimental (par exemple pour les évaluations comportementales/neurologiques).
  2. Préparation du gel alimentaire pour un soutien nutritionnel
    1. Pulvérisez les granulés alimentaires courants à l’aide d’un mélangeur (Figure 1a).
    2. Ajoutez du sucre commercial à 5-10% pour augmenter la teneur calorique de l’aliment.
    3. Ajoutez de l’eau pour créer une texture liquide semblable à celle d’un gel (Figure 1b).
    4. Utilisez ce gel alimentaire pour un soutien nutritionnel passif et actif.
      REMARQUE : En option, utilisez du gel alimentaire commercial prêt à l’emploi. Les aliments préparés peuvent rester au réfrigérateur pendant 2 à 3 jours.
  3. Soutien nutritionnel passif des souris
    1. Remplissez une boîte de Pétri avec de la nourriture en gel et placez-la sur le sol de la cage (soutien nutritionnel passif par fourniture de nourriture en gel pour un accès facile à la souris). Laissez 2-3 granulés de nourriture à côté de la boîte de Pétri.
    2. Rafraîchissez quotidiennement la boîte de Pétri avec de la nourriture en gel. Au cours des premiers jours, les souris peuvent remplir ou recouvrir la boîte de Pétri avec de la litière en cage. Certains commenceront à en manger (Figure 1c).
  4. Soutien nutritionnel actif (alimentation active)
    REMARQUE : L’alimentation active se produit pendant la phase B. La fréquence d’alimentation standard est de 3 fois par jour et est adaptée à plus de fois en fonction du score RSS (par exemple, même 4 à 5 fois par jour). Parfois, pour les souris qui ont constamment un score RSS de 0-1 (c’est-à-dire un petit AVC) et mangent activement par elles-mêmes, réduisez la fréquence à 1-2/jour.
    1. Préremplissez les seringues de 1 ml avec de la nourriture en gel.
    2. Saisissez et tenez la souris doucement mais fermement par la fourrure de son cou, comme le montre la figure 1d (pointe de flèche rouge).
    3. Stabilisez la joue de la souris avec le majeur, comme le montrent les flèches rouges de la figure 1d : tout en tenant fermement la souris, faites glisser le doigt latéralement vers le nez de la souris contre sa joue. Position de maintien.
    4. Placez l’extrémité de la seringue dans la bouche de la souris entre ses dents et dirigez l’extrémité vers l’intérieur de sa joue (flèche rouge, Figure 1e).
    5. Donnez environ 40 à 50 μL de nourriture en gel à chaque fois (une bouchée).
    6. Remettez doucement la souris sur la grille de la cage. Prévoyez du temps pour la mastication.
    7. Répétez l’alimentation après 1 à 2 minutes, jusqu’à ce que chaque souris ait mangé 1 à 1,5 ml de nourriture en gel.
      REMARQUE : Nourrissez 5 à 10 souris par enclos (1 à 2 cages) ; Les autres mangent et avalent la nourriture en gel pendant que chaque souris reçoit une bouchée. Le processus ne confère aucun stress aux souris. Il a également été observé que certains animaux finissent par se positionner pour saisir et se nourrir.
  5. Supplémentation normale en solution saline
    1. Pesez la souris lors de la visite matinale (voir 1.1.2 et 1.1.3).
    2. Calculez sa perte/gain de poids par rapport à la mesure précédente en soustrayant les valeurs.
    3. Complétez son déficit pondéral (en grammes) avec un mL de solution saline normale (par voie sous-cutanée).
      REMARQUE : Évitez à tout prix la surcharge de liquide et l’œdème. Ne pas dépasser 1 à 2 ml par dose et 3 à 4 ml de liquides par jour. Commencer après 36 h après fMCAo.
  6. Supplémentation en glucose
    1. Vérifiez le score RSS calculé de la souris et son mouvement global.
    2. Injecter par voie sous-cutanée de 0,5 à 1 mL de glucose à 5 % si le RSS >3 et que la souris présente des signes concomitants d’hypothermie (<34 °C) ou d’immobilisation/bradykinésie. Injecter de préférence uniquement pendant la visite de nuit.
      REMARQUE : Évitez à tout prix l’hyperglycémie après un AVC. L’hyperglycémie post-AVC est toxique7. En tant que tel, ne complétez le glucose qu’après l’alimentation active et en cas d’état clinique grave ou pour prévenir l’hypoglycémie pendant l’activité nocturne. L’alimentation active (voir 1.4) devrait être la principale mesure de soutien, car elle fournit un soutien énergétique plus lisse et plus durable et traduit les directives cliniques 7. Ne prenez pas de supplément de glucose avant le jour 3.
  7. Gestion de la température (passive)
    1. Mesurer la température corporelle à la surface de l’animal avant l’opération au départ et après l’opération à chaque visite (figure 1a). Mesurez comme indiqué sur la figure 1f et décrit dans 1.1.4. Notez les valeurs.
      REMARQUE : L’hypothermie chez la souris est définie comme la température corporelle <35 °C 24,25. Les données précédentes13 indiquent que toute température inférieure à 34 °C est un signe d’avertissement de soutien après un AVC (voir ci-dessous).
    2. Lorsqu’une hypothermie entre 33 et 34 °C est observée, réchauffez passivement la souris dans une cage sur une plaque chauffante (ou tout autre dispositif de réchauffement passif) jusqu’à ce qu’elle atteigne une température corporelle de >34 °C. Nourrissez activement la souris pour fournir de l’énergie pour la production active de chaleur par l’animal (apport d’énergie plus durable).
      REMARQUE : Gardez l’animal en chauffage passif pendant 1 à quelques heures. Évitez à tout prix l’hyperthermie passive.
    3. Lorsqu’une hypothermie est observée, <33 °C, intensifier le soutien avec une administration supplémentaire de glucose par voie sous-cutanée (apport d’énergie rapide mais de courte durée ; voir 1.6 ci-dessus).
  8. Nettoyage des organes génitaux et/ou des plaies cervicales (« désinfections » locales)
    REMARQUE : Occasionnellement, une déhiscence de la plaie ou un bouchon urétral peut être observé. La déhiscence de la plaie est rare. Le bouchon urétral est un bouchon dur à l’extrémité des organes génitaux de la souris (Figure 1g) et est observé plus fréquemment, en particulier chez les animaux présentant une gravité d’AVC plus élevée. Lorsque le bouchon bloque l’urètre, un syndrome d’obstruction urinaire peut survenir et peut entraîner une morbidité et la mort26. Par conséquent, il doit être bien nettoyé.
    1. Trempez le bouchon urétral, s’il est présent, avec une solution saline normale pour faciliter son retrait.
    2. Retirez doucement le bouchon urétral à l’aide d’un petit écouvillon ou d’une simple pince à épiler à chaque contrôle ou visite de l’animal. Désinfectez l’urètre à l’aide d’un manomètre ou d’un écouvillon, imbibé d’une solution antiseptique.
    3. En cas de déhiscence de la plaie, désinfectez-la localement avec n’importe quelle solution antiseptique chirurgicale courante (par exemple, Octanisept) et suturez régulièrement la plaie en utilisant de préférence une suture en soie 5/0.

2. La composante centrale de l’échelle expérimentale de l’AVC (fESS)

  1. Préparer le terrain d’essai
    1. Nettoyez une paillasse avec de l’alcool à 70 % pour éliminer les stimuli externes (optiques ou odeurs) et préparez le matériel de test, comme le montre la figure 2a.
    2. Imprimez la feuille de pointage ESS fournie sous forme de fichier supplémentaire 2 et suivez les tests un par un.
  2. Parésie des membres antérieurs (Test 1)
    1. Soulevez et tenez doucement la souris à partir de sa base arrière.
    2. Vérifiez et évaluez visuellement l’extension symétrique vers l’avant et la mobilité symétrique des membres antérieurs lorsque la souris se déplace (Figure 2c).
    3. Score en fonction des signes visuels comme suit : 0 pour une extension et un mouvement normaux et symétriques des membres antérieurs ; 1 pour une « légère asymétrie » définie comme une légère flexion et/ou un mouvement réduit du membre contralésionnel ou une raideur du membre ; 2 pour une « flexion marquée » du membre contralésionnel ; 3 pour l’adhérence du membre contralésionnel au tronc ; Score de 4 pour l’absence de mouvement du corps ou des membres.
      REMARQUE : Le test détecte la parésie du membre antérieur contralésionnel. Il fait également partie des balances BS, LS, mNSS et NS. Le score 1 peut être difficile à définir en raison des manœuvres d’évasion de l’animal.
  3. Parésie des membres postérieurs (Test 2)
    1. Continuez à tenir la souris par la base de sa queue, comme décrit Test 1.
    2. Vérifiez visuellement l’extension symétrique et le mouvement des membres postérieurs et des orteils (figure 2c).
    3. Score suivant en fonction des résultats : 0 pour une position/extension et un mouvement normaux et symétriques des membres postérieurs et des orteils ; 1 pour une asymétrie nette, lorsqu’il y a une diminution significative du mouvement et une position/extension asymétrique de la patte postérieure controlatérale (droite) (Figure 2d).
      REMARQUE : Le test détecte la parésie de la patte postérieure contralésionnelle. Il fait également partie de l’échelle mNSS. Ce test peut être difficile à noter avec précision.
  4. Symétrie du tronc (Test 3)
    1. Continuez à tenir la souris par la base de sa queue (voir 2.3.) et évaluez les mouvements de son tronc.
    2. Score en fonction des résultats comme suit : 0 pour normal, pas de flexion du tronc ou flexion/mouvement symétrique léger du tronc des deux côtés (comme manœuvre d’évasion) ; 1 pour une flexion marquée (>30°) de la tête et du tronc principalement contralésionnelle (vers la droite), dans les 10 premières secondes à partir de la tenue.
      REMARQUE : Le test détecte l’asymétrie par lésions motrices unilatérales. Il fait également partie de la notation mNSS.
  5. Comportement en cercle (Test 4)
    1. Placez doucement la souris sur une surface plane et laissez-la bouger librement pendant au moins 1 min. Observez son mouvement.
    2. Score suivant en fonction des résultats : 0 pour un mouvement exploratoire, vif et linéaire sans comportement circulaire ; 1 pour la tendance à se tourner d’un côté mais pas en cercles fermés ; 2 pour un mouvement inconstant en cercles fermés d’un côté ; 3 pour un mouvement constant en cercles fermés d’un côté ; 4 pour pivoter, se balancer ou ne pas bouger du tout.
      REMARQUE : Le test détecte les déficits sensorimoteurs et de navigation spatiale. Il fait également partie de la NS.
  6. Symétrie corporelle (Test 5)
    1. Continuez à partir du test 4 et laissez la souris se déplacer librement sur la surface plane. Observez son axe nez-queue.
    2. Score en fonction des résultats comme suit : 0 pour une posture normale avec un tronc surélevé depuis le banc et une queue droite ; 1 pour une « légère asymétrie » si le corps est légèrement plié d’un côté et la queue pliée distalement ; 2 pour une « asymétrie modérée » si le corps se plie ou se penche sur le côté contralésionnel avec la queue pliée proximale et/ou les membres s’étirent hors du corps ; 3 pour une « asymétrie proéminente » si le corps est plié, un côté repose inconstamment sur le banc et la queue est clairement pliée vers la proximale (plus que le score 2) ; 4 pour « asymétrie extrême » si le corps est plié, un côté repose constamment sur le banc et la queue est fortement pliée.
      REMARQUE : Il détecte les déficits tronculaires et de queue unilatéraux sensorimoteurs. Il fait également partie de l’échelle NS.
  7. Évaluation de la marche (Test 6)
    1. Continuez à partir du test 5 et laissez la souris se déplacer librement sur la surface plane. Observez maintenant sa démarche et vérifiez les déficits moteurs de la marche tels que la parésie, la raideur des membres, la démarche spastique, l’ébranchement.
    2. Score suivant en fonction des résultats : 0 pour une démarche normale si exploratoire, symétrique et rapide avec des membres souples qui se déplacent « cachés » sous le corps ; 1 pour une démarche raide, inflexible et plus lente d’une souris se déplaçant librement sans boiter ; 2 pour une boiterie nette avec des mouvements asymétriques (gauche-droite) ; 3 pour trembler, dériver ou tomber après une légère poussée ; 4 pour l’absence de marche spontanée (ne marche pas plus de 3 pas lorsqu’elle est stimulée par une légère poussée).
      REMARQUE : Il détecte les déficits de marche combinés. Il fait également partie de la NS.
  8. Cercles obligatoires (Test 7)
    1. Tenez la souris par la base de sa queue pour l’élever de la surface et laissez-la marcher uniquement sur ses membres antérieurs. Observez son mouvement.
    2. Score suivant en fonction des résultats : 0 pour un mouvement linéaire normal ; 1 pour tendance à se tourner d’un côté ; 2 pour tourner d’un côté en cercles fermés ; 3 s’il pivote d’un côté avec des mouvements maladroits ou s’il ne parvient pas à boucler un cercle ; 4 s’il n’y a pas d’avancement et que la partie avant du tronc repose sur le banc.
      REMARQUE : Le test complète le test de comportement circulaire (test 4, voir 2.5). Il détecte probablement des déficits sensorimoteurs et spatiaux. Il fait également partie du système de notation NS.
  9. Posture contre les forces latérales (Test 8)
    1. Placez la souris sur la paume, avec l’axe de sa queue et de son nez (longitudinal) parallèle à l’axe sagittal de la paume.
    2. Balancez la souris d’avant en arrière à une vitesse constante pour induire des forces perpendiculaires à son axe longitudinal.
      REMARQUE : Cela oblige la souris à conserver sa position verticale et à s’équilibrer contre les forces latérales pendant le balancement. Son corps n’entre normalement pas en contact avec la paume ou les doigts.
    3. Observez visuellement et sentez tous les contacts de la paume des côtés gauche-droit de la souris lorsqu’elle s’équilibre contre la balançoire. Vérifiez s’il n’y a pas de chute asymétrique, de toucher la paume ou d’indication de faiblesse latérale.
    4. Score en fonction des résultats comme suit : 0 si la souris se tient dans une position verticale normale, le dos parallèle à la paume et peut s’équilibrer contre le balancement sans toucher fortement la paume ; 1 si la souris aplatit son corps pendant le balancement pour gagner en stabilité ; 2 si une partie de la souris repose ou touche brièvement la paume pendant le balancement ; 3 si la souris est allongée sur un côté, à peine capable de retrouver la position verticale ; 4 Si la souris est allongée sur le ventre, incapable de récupérer la position verticale.
      REMARQUE : Le test détecte des déficits posturaux contre l’accélération latérale, mais sa notation peut être subjective. Il fait également partie du mNSS, NS.
  10. Placement ciblé des membres antérieurs (Test 9)
    1. Tenez la souris par le dos ou par la base de la queue. Dirigez-le perpendiculairement vers le faisceau, qui fonctionne comme une « cible à atteindre ». Observez la « portée » et la préhension symétriques.
    2. Une fois qu’il saisit le faisceau régulièrement, tirez-le doucement et observez le « relâchement » symétrique des membres antérieurs.
    3. Score suivant en fonction des résultats : 0 pour « tendre la main », saisir et « relâcher » symétriques ; 1 pour toute asymétrie dans la « tendre la main » et/ou le « relâchement », indiquant une faiblesse contralésionnelle des membres antérieurs.
  11. Déficit sensorimoteur des membres antérieurs (Test 10)
    1. Tenez fermement la souris par le dos et orientez-la vers le ventre (voir vidéo ou Figure 1e).
    2. Stimulez les pattes avant successivement avec une pointe fine (par exemple un cure-dent en bois) à partir d’un angle aveugle. Observez la réaction de la patte avant.
    3. Noter en fonction des résultats les suivants : 0 pour un mouvement de préhension normal et rapide des deux côtés ; 1 pour une préhension absente ou nettement retardée en contre-lésion.
      REMARQUE : Les tests 2.10 et 2.11 pour les déficits sensorimoteurs fins des membres antérieurs. Ils font également partie du mNSS.
  12. Marche sur faisceau (Test 11)
    1. Placez une poutre en bois de 1 m de long (table des matériaux) pour relier deux surfaces surélevées (par exemple des bancs, des tables) à une hauteur de 1 à 1,5 m au-dessus du sol. Stabilisez les bords du faisceau pour éviter les vibrations ou l’instabilité.
    2. Placez la souris au milieu de la poutre avec l’axe nez-queue parallèle à la poutre (Figure 2e). Prévoyez l’équilibre ou la marche libre sur la poutre. Observez son équilibre ou sa parésie et ses chutes des membres.
      REMARQUE : La souris doit gagner en équilibre sur le faisceau avant de le marquer. Tenez un gant épais sous l’animal (à une distance d’environ 15-20 cm) pour le protéger en cas de chute.
    3. Score en fonction des résultats comme suit : 0 si la souris se tient en équilibre et marche avec une posture stable vers un côté de la poutre ; 1 s’il saisit le côté de la poutre et ne marche pas dessus ; 2 si un membre tombe de la poutre ; 3 si deux membres tombent de la poutre ; 4 si la souris tente de se tenir en équilibre sur la poutre mais tombe (après 40 s) ; 5 s’il tombe entre 20 et 40 secondes ; Marquez 6 s’il tombe sans tenter de s’équilibrer ou de s’accrocher à la poutre (<20s).
      REMARQUE : Le test détecte les déficits moteurs combinés des membres antérieurs, des membres postérieurs et du tronc. Il fait également partie de l’échelle mNSS.
  13. Sensation de moustache (Test 12)
    1. Placez la souris sur une paillasse ouverte (comme dans les tests 4 et 5). Prévoyez un peu de temps pour l’hébergement.
    2. Stimulez successivement ses moustaches gauche et droite, à l’aide d’un coton-tige fin à longue pointe, à partir d’un « angle aveugle ». Observez une réponse rapide de rotation de la tête vers la stimulation.
    3. Score suivant en fonction des résultats : 0 pour une rotation de tête normale et rapide lors d’une stimulation, bilatéralement ; 1 pour une réponse contralésionnelle plus lente lors de la stimulation ; 2 pour absence de réponse contralésionnelle (pas de tour) ; 3 en cas d’absence de réponse contralésionnelle et de réponse ipsilésionnelle plus lente ; 4 pour réponse bilatérale absente.
      REMARQUE : Évitez la détection visuelle du coton car cela provoquerait à tort une rotation de tête ipsilatérale. Le test n’est techniquement correct que lorsque la souris est « surprise » par la stimulation des moustaches. Le test fait également partie de NS et détecte les déficits sensorimoteurs des moustaches (cortex en tonneau).
  14. Escalade (Test 13)
    1. Utilisez une surface inclinée à 45° recouverte de caoutchouc (Figure 2a) et placez la souris en son centre. Observez l’effort de la souris pour grimper.
    2. Score en fonction des résultats comme suit : 0 (normal) si la souris grimpe rapidement et sans effort vers le haut de la surface ; 1 s’il grimpe avec tension, avec faiblesse des membres ; 2 s’il s’accroche à la pente sans glisser ni grimper ; 3 s’il glisse sur la pente malgré les efforts déployés pour éviter la chute ; 4 s’il glisse sans effort pour éviter la chute.
      REMARQUE : Le test fait également partie de NS et détecte la force motrice générale.
  15. Calculez le score de fESS en additionnant tous les scores des tests 1 à 13
    REMARQUE : le score fESS de 0 indique une souris normale, le score maximal est de 42. Les infarctus volumineux avec lésions striatales et corticales induisent généralement des scores >7-9. Examinez et notez plusieurs souris normales avant de commencer à évaluer celles qui ont été caressées, afin de tenir compte des variations de comportement normal et de réduire le score fESS faussement positif. Utilisez constamment le protocole vidéo fourni pour normaliser la notation tout au long de l’expérience.

3. Composante générale de l’ESS (gESS)

REMARQUE : Évaluez la gESS pour détecter les signes d’une « maladie générale de la souris », par exemple une inflammation ou une infection, généralement présents au cours des 1 à 2 premières semaines après la fMCAo. Utilisez la feuille de pointage dans le fichier supplémentaire 2. Évaluez la gESS de préférence après avoir terminé la fESS.

  1. Placez la souris sur une surface plane (banc) et laissez-la se déplacer librement comme dans la version 2.5. Évaluez séquentiellement les scores suivants.
  2. Observez sa fourrure. Score selon la feuille de pointage gESS (scores 0-2, voir Fichier supplémentaire 2).
  3. Vérifiez la réponse de sursaut de la souris : surprenez la souris avec un applaudissement soudain d’un angle aveugle, lorsqu’elle est détendue. Vérifiez et notez la réaction des oreilles de la souris selon la feuille de score gESS (scores 0-2, voir Fichier supplémentaire 2).
  4. Évaluez visuellement les yeux de la souris détendue : vérifiez la présence d’yeux ouverts/fermés ou de mucus. Score selon la feuille de pointage gESS (scores 0-4, voir Fichier supplémentaire 2).
  5. Observez l’activité spontanée générale et la vigilance de la souris. Score selon la feuille de pointage gESS (scores 0-4, voir Fichier supplémentaire 2).
  6. Observez le comportement spontané général de la souris pour toute présence d’anxiété, d’hyperexcitabilité, d’agressivité ou de rotation le long de son axe lors de toute manipulation. Score selon la feuille de pointage gESS (scores 0-4, voir Fichier supplémentaire 2).
  7. Calculez le score de gESS en additionnant les scores de toutes les étapes ci-dessus (score d’observation, étapes 3.2 à 3.6).
    REMARQUE : Le score gESS ne détecte pas les déficits focaux induits par les lésions de l’AVC et n’est pas affecté par la mSU, comme indiqué précédemment 13. Tous les tests sont adaptés de l’échelle NS 9,15.

4. Quantification des déficits des membres antérieurs avec le test du cylindre

REMARQUE : L’essai de cylindre est précédemment décrit en détail9, 15, 27 et ne sera pas décrit en détail ici. Le test du cylindre est un test comportemental indépendant qui quantifie de manière impartiale les déficits des membres antérieurs (voir 4.2).

  1. Exécutez le test en suivant les instructions fournies ici15. Capturez des vidéos et analysez-les comme en 15. Mesurez les premiers contacts des membres droit et gauche avec les parois. La figure 3a,b montre des images de la configuration.
  2. Calculer la latéralisation de l’utilisation des membres due à la parésie contralésionnelle (droite) en pourcentage en %. Utilisez la formule : % de préférence pour les pas de gauche = [(gauche - droite) premiers contacts / (droite + gauche) contacts] x 100.
    REMARQUE : Exécutez un test de cylindre de référence pour chaque souris avant d’induire un coup. Exécutez des tests à des moments temporels en fonction de chaque plan expérimental.

5. Quantification des déficits des membres antérieurs et postérieurs à l’aide du test de l’échelon en échelle

REMARQUE : Construisez l’appareil pour souris en plexiglas (illustré à la figure 3c) : un couloir de 1 m de long avec des parois de 20 cm de haut, des échelons en plastique (3 mm de diamètre) placés à intervalles réguliers de 15 mm (figure 3c1) et une boîte de « refuge » à l’extrémité distale. Placez la litière des animaux dans la boîte du refuge pour leur rendre visite et des granulés de nourriture ou du beurre de cacahuète en guise de récompense. La largeur du couloir doit être de 10 cm et doit être surélevée d’environ 30 cm du sol.

  1. Entraînez les souris sur l’appareil 1 à 3 jours avant la date de référence de l’expérience. Exécutez la formation comme aux étapes 5.1.1 à 5.1.4.
    REMARQUE : Une formation est nécessaire pour permettre aux animaux de marcher à vitesse constante et normale dans le couloir de l’échelon, sans arrêts, virages ou comportement d’exploration. Effectuer des formations pendant 2 jours consécutifs (2 sessions). Chaque séance d’entraînement se compose de 3 courses (course = une seule promenade à travers tout le couloir vers le box refuge). La collecte de données de référence est nécessaire pour le suivi.
    1. Nettoyez les barreaux et les parois avant chaque passage avec de l’alcool à 70%, pour éviter les odeurs et les distractions/arrêts « exploratoires » de la souris.
    2. Positionnez la souris au début du couloir de l’échelon de l’échelle, face à la boîte de refuge, pour commencer une course. Laissez la souris marcher librement vers le box refuge au bout du couloir. Ne forcez pas l’animal à marcher.
      REMARQUE : Les courses pendant l’entraînement sont normalement très variables en termes de durée et de rythme de marche. L’objectif de l’entraînement est une marche stable vers le refuge, généralement en <10 s, sans arrêts/virages, ce qui est généralement réalisé à la fin de la deuxième journée d’entraînement. Manipulez toujours l’animal avec précaution pour éviter l’induction du stress qui distraira l’entraînement approprié. Retirez les animaux du couloir et refaites l’enclos s’ils restent dans le couloir et explorez localement pendant >1 min, pour éviter l’accoutumance.
    3. Effectuez la 1èrecourse d’entraînement . Laissez l’animal se reposer dans le box refuge pendant 5 min après la1ère course.
      REMARQUE : Ce temps de repos prolongé permet à la souris de se familiariser avec la boîte de refuge et de la percevoir comme une cible « repos/gratifiante » à atteindre. L’obtention d’une « perception gratifiante » de la boîte de refuge est cruciale pour la réussite des courses.
    4. Retirez la souris de la boîte de refuge et effectuez les deuxième et troisième exécutions d’entraînement comme dans la version 5.1.2. Prévoyez un temps de repos plus court dans le box refuge à la fin de ces courses (30-60 s), pour éviter l’accoutumance.
      REMARQUE : La formation se termine le jour 2. Au deuxième jour, presque tous les animaux apprennent à marcher dans le couloir à un rythme régulier. Envisagez d’exclure les animaux de toute expérimentation ultérieure s’ils n’apprennent pas.
  2. Exécutez l’expérience sur des souris entraînées. Testez les souris pendant 2 exécutions à chaque fois pendant tous les points temporels de l’expérience et de la ligne de base.
    1. Effectuez les exécutions décrites aux étapes 5.1.1 et 5.1.2. Prévoyez un maximum de 5 min de repos entre les 2 descentes dans le box refuge.
    2. À l’aide d’un smartphone (ou d’un appareil photo équivalent) et d’une perche à selfie, capturez des vidéos (données) des animaux à un léger angle ventral et à un angle « aveugle » à une certaine distance (comme le montre la figure 3c2). Assurez-vous de capturer les membres pendant que l’animal marche dans le couloir. Ne distrayez pas visuellement la souris pendant sa course et suivez ses membres pendant sa course (Figure 3c2).
    3. Enregistrez les deux exécutions, mais utilisez et analysez les données de la deuxième exécution.
    4. Mesurez le nombre de pas de défaut (chutes) entre les barreaux de chaque membre (gauche/droite, avant/postérieur) (Figure 3c3), en visionnant la vidéo à l’aide d’un logiciel de lecture multimédia doté d’options de ralenti. Calculez la différence absolue ou en % entre les pas de défaut du membre droit et du membre gauche, séparément pour les membres antérieurs et postérieurs.
      REMARQUE : La deuxième exécution donne des résultats plus fiables. Une souris en bonne santé a généralement 0 à 1 pas de défaut arbitraires par membre (droit ou gauche) lors de sa deuxième course, ce qui donne normalement une plage de différence de 0 ±1. Une souris caressée fera des pas de faute avec son membre parétique droit (contralésionnel) (membre antérieur ou postérieur), ce qui entraînera une latéralisation positive « vers la droite ». Un animal sévèrement caressé peut être plus lent ou ne pas terminer la course pendant les 7 à 10 premiers jours après l’AVC, cependant, il réussira à courir correctement par la suite et montrera de graves déficits.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le mSU, comme décrit ci-dessus, commence après l’opération fMCAo. Nos résultats représentatifs dans les deux cohortes de souris indépendantes de fMCAo, d’AVC et de placebo (Figure 4a) confirment la valeur précédemment prouvée de la mSU, en particulier pendant la période critique entre les jours 3 et 1013. Dans nos cohortes, la mortalité est survenue pour 3/15 des animaux de la cohorte 1 (AVC, suivi de 6 mois), 2/10 de la cohorte 2 (AVC, suivi de 14 jours) et 0/6 des a...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole est un guide complet du protocole de soutien mSU, conçu pour réduire la mortalité artificielle entre les jours 3 et 10 chez les souris soumises à de grands accidents vasculaires cérébraux territoriaux par le modèlefMCAo 13. De plus, le protocole actuel comprend un guide vidéo normalisé pour la composante focale de l’échelle ESS (fESS) afin de réduire la subjectivité étendue et le biais de la notation focale neurologique chez les souris après u...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucune divulgation à signaler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Nikolaos Plakopitis et Ioannis Tatsidis pour leur précieux soutien chirurgical pendant certaines parties de l’étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tools pour solution de dextrose mSU5 %
;VIOSER S.Ana (non applicable)Tout genericon
Thermomètre numériquesans contact AVRONYTC20095Tout
pèse-personne numériqueKERN & Sohn GmbhFCB6K1Any genericon
Granulés alimentairesMucedola srlnaAny genericon, utilisez la nourriture normale de votre animalerie
Plaque chauffantePhotaxnaChauffe-vaisselle Photax 2
Antiseptique liquideSchü ; lke & Mayr GmbHnaOctenisept® ;
Mélangeurd’aliments normal naPour la pulvérisation de granulés. Tout genericon
Saline normaleDEMO S.A.naChlorure de sodium injectable 0,9 %
Pinsetter et cotons-tigesnaAny genericon
SucrenaAny genericon
Seringues (1ml) avec aiguillenaAny genericon. Pour l’administration alimentaire (sans aiguille) et pour l’administration de liquide sous-cutané (avec aiguille)
Tools for ESS
45° ; surface inclinée  ;Fabriqué en plexiglas ou autre matériau, avec une surface en caoutchouc, pour les tests d’escalade
coton-tige.N’importe quel génériquenacotons-tiges auriculaires commerciaux, faites de son embout en coton long et mince
tranchant bâton en boisaiguisé N’importe quel genericonna parexemple des cure-dents
Long faisceau  ;Dimensions : 1 x 1 x1cm, environ 100cm de long, en bois. Placer entre deux bords de table pour le test de marche sur la poutre
Gant épais  ;Tout génériquenapour prévenir les traumatismes d’animaux lors de la chute d’un faisceau
genericon de calibre 27

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Occlusion de l art re c r brale moyennechelle exp rimentale de l AVCtest de la grille ladder rung testtest du cylindrevaluation de la fonction motricescore de stratification du risqued ficits focaux li s l AVCmod le translationnel de l AVC

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