Méthodes pour permettre la transcriptomique spatiale des tissus osseux

Summary

Nous décrivons ici une méthode qui permet de décalcifier les tissus osseux fraîchement obtenus et de préserver l’ARN de haute qualité. Une méthode est également illustrée pour sectionner des échantillons d’os non déminéralisés contenant de la paraffine fixe au formol (FFPE) afin d’obtenir des résultats de bonne qualité si les tissus frais ne sont pas disponibles ou ne peuvent pas être recueillis.

Abstract

Comprendre la relation entre les cellules et leur emplacement dans chaque tissu est essentiel pour découvrir les processus biologiques associés au développement normal et à la pathologie de la maladie. La transcriptomique spatiale est une méthode puissante qui permet d’analyser l’ensemble du transcriptome dans des échantillons de tissus, fournissant ainsi des informations sur l’expression des gènes cellulaires et le contexte histologique dans lequel les cellules résident. Bien que cette méthode ait été largement utilisée pour de nombreux tissus mous, son application pour l’analyse des tissus durs tels que les os a été difficile. Le principal défi réside dans l’incapacité à préserver une bonne qualité de l’ARN et la morphologie des tissus lors du traitement des échantillons de tissus durs pour la section. Par conséquent, une méthode est décrite ici pour traiter des échantillons de tissu osseux fraîchement obtenus afin de générer efficacement des données transcriptomiques spatiales. La méthode permet de décalcifier les échantillons, ce qui permet d’obtenir des coupes de tissus avec des détails morphologiques préservés tout en évitant la dégradation de l’ARN. De plus, des lignes directrices détaillées sont fournies pour les échantillons qui étaient auparavant intégrés à la paraffine, sans déminéralisation, tels que les échantillons prélevés dans des banques de tissus. À l’aide de ces directives, des données transcriptomiques spatiales de haute qualité générées à partir d’échantillons de banques de tissus de tumeurs primaires et de métastases pulmonaires d’ostéosarcome osseux sont présentées.

Introduction

L’os est un tissu conjonctif spécialisé composé principalement de fibres de collagène de type 1 et de sels inorganiques¹. En conséquence, l’os est incroyablement solide et rigide tout en étant léger et résistant aux traumatismes. La grande force de l’os provient de sa teneur en minéraux. En fait, pour une augmentation donnée du pourcentage de teneur en minéraux, la rigidité est multipliée^{par cinq} 2. Par conséquent, les chercheurs sont confrontés à des problèmes importants lorsqu’ils analysent, au moyen d’une coupe histologique, la biologie d’un échantillon osseux.

L’histologie osseuse non décalcifiée est réalisable et parfois nécessaire, selon le type d’investigation (par exemple, pour étudier la micro-architecture de l’os) ; C’est cependant très difficile, surtout si les spécimens sont grands. Dans ces cas, le traitement des tissus à des fins histologiques nécessite plusieurs modifications des protocoles et techniques standard³. En général, pour effectuer des évaluations histologiques courantes, les tissus osseux sont décalcifiés juste après la fixation, un processus qui peut prendre de quelques jours à plusieurs semaines, selon la taille du tissu et l’agent décalcifiant utilisé⁴. Les coupes décalcifiées sont souvent utilisées pour l’examen de la moelle osseuse, le diagnostic des tumeurs, etc. Il existe trois principaux types d’agents décalcifiants : les acides forts (par exemple, l’acide nitrique, l’acide chlorhydrique), les acides faibles (par exemple, l’acide formique) et les agents chélateurs (par exemple, l’acide éthylènediaminetétracetique ou EDTA)⁵. Les acides forts peuvent décalcifier les os très rapidement, mais ils peuvent endommager les tissus ; les acides faibles sont très courants et conviennent aux procédures de diagnostic ; Les agents chélateurs sont de loin les plus utilisés et les plus appropriés pour la recherche car, dans ce cas, le processus de déminéralisation est lent et doux, ce qui permet de conserver une morphologie de haute qualité et de préserver l’information sur les gènes et les protéines, comme l’exigent de nombreuses procédures (par exemple, hybridation in situ , immunomarquage). Cependant, lorsque l’ensemble du transcriptome doit être préservé, comme pour les analyses d’expression génique, même une déminéralisation lente et douce peut être préjudiciable. Par conséquent, de meilleures approches et méthodes sont nécessaires lorsque l’analyse morphologique des tissus doit être associée à des analyses de l’expression génique des cellules.

Grâce aux récentes améliorations du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) et de la transcriptomique spatiale, il est désormais possible d’étudier l’expression génique d’un échantillon de tissu, même lorsque l’enrobage de paraffine de fixation au formol (FFPE) a été utilisé pour stocker^{les échantillons de tissus.} Cette opportunité a permis d’accéder à un plus grand nombre d’échantillons, tels que ceux stockés dans des banques de tissus du monde entier. Si le scRNA-seq doit être utilisé, l’intégrité de l’ARN est l’exigence la plus importante ; cependant, dans le cas de la transcriptomique spatiale des échantillons FFPE, des coupes de tissus de haute qualité et de l’ARN de haute qualité sont nécessaires pour visualiser l’expression génique dans le contexte histologique de chaque section de tissu. Bien que cela ait été facilement réalisé avec les tissus mous, on ne peut pas en dire autant des tissus durs comme les os. En effet, à notre connaissance, aucune étude utilisant la transcriptomique spatiale n’a jamais été réalisée sur des échantillons osseux FFPE. Cela est dû à l’absence de protocoles capables de traiter efficacement les tissus osseux FFPE tout en préservant leur contenu en ARN. Ici, une méthode pour traiter et décalcifier des échantillons de tissu osseux fraîchement obtenus tout en évitant la dégradation de l’ARN est d’abord fournie. Ensuite, reconnaissant la nécessité d’une analyse transcriptomique des échantillons FFPE collectés dans les banques de tissus du monde entier, des directives élaborées pour manipuler correctement les échantillons FFPE d’os non déminéralisés sont également présentées.

Protocol

Toutes les procédures sur les animaux décrites ci-dessous ont été approuvées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’École de médecine dentaire de l’Université de Pittsburgh.

1. Méthode de préparation de blocs FFPE d’échantillons de tissu osseux nécessitant une déminéralisation

1. Préparation des réactifs et des matériaux
   1. Préparez l’EDTA 20% pH 8.0. Pour 1 L, dissoudre 200 g d’EDTA dans 800 mL d’eau ultrapure, ajuster le pH à 8,0 avec de l’hydroxyde de sodium 10 N et enfin porter le volume à 1L avec de l’eau ultrapure. Conserver à température ambiante.
      REMARQUE : Utilisez toujours de l’EDTA 20% pH 8,0 fraîchement préparé. L’hydroxyde de sodium (NaOH) 10 N est préparé en dissolvant 400 g de NaOH dans 1 L d’eau ultrapure.
   2. Préparez du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans une hotte en utilisant 1 fois PBS sans calcium ni magnésium.
      REMARQUE : Désignez une zone dans une hotte pour travailler avec des solutions concentrées de paraformaldéhyde ou des solides de paraformaldéhyde et étiquetez-la comme telle. Pour éviter l’exposition, gardez les contenants fermés autant que possible. Utiliser dans les plus petites quantités pratiques nécessaires à l’expérience réalisée. Si le pesage de la poudre de paraformaldéhyde et la balance ne peuvent pas être utilisés dans une hotte, prenez d’abord un récipient, puis ajoutez de la poudre PFA dans la hotte et le couvercle avant de retourner à la balance pour peser la poudre. Utilisez toujours 4% de PFA fraîchement préparé.
   3. Utilisez un récipient adapté à chaque échantillon.
      REMARQUE : Par exemple, pour 1 mg de tissu osseux, utilisez un récipient qui permet d’entrer en contact avec l’os à au moins 1 ml de n’importe quelle solution.
   4. Stérilisez tout le matériel chirurgical nécessaire à la dissection.
   5. Nettoyez toutes les zones avec une solution décontaminante pour éliminer les RNases.
   6. Collectez les matériaux expérimentaux restants, y compris des récipients de glace, un spray d’éthanol à 70 %, et ayez accès à un agitateur orbital.
2. Isolement d’échantillons de tissu osseux de souris
   1. Euthanasier la souris par exposition au CO₂ , puis effectuer une luxation cervicale et la coucher sur le dos. Vaporisez la peau de la souris avec de l’éthanol à 70%.
   2. À l’aide de ciseaux de dissection stériles, ouvrez la peau et exposez le muscle de la jambe. Coupez le muscle le long de la jambe pour obtenir une vue claire de la position de l’os, et désarticulez doucement l’os pour le retirer sans l’endommager.
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’enlever entièrement tout le muscle attaché à l’os. Essayez d’être le plus rapide possible pour limiter la dégradation de l’ARN.
   3. Placez immédiatement l’échantillon d’os dans un tube contenant 4 % de PFA et placez le tube sur de la glace.
   4. Répétez la procédure pour prélever d’autres échantillons d’os si vous le souhaitez.
   5. Placez les échantillons contenant 4 % de PFA en agitation sur un agitateur orbital à 140 tr/min à 4 °C pendant au moins 24 h pour permettre une bonne fixation.
3. Décalcification d’échantillons de tissu osseux
   1. Récupérez le tissu osseux de l’agitateur orbital après la fixation.
   2. Laver le tissu osseux 2 fois avec 1x PBS pendant 3 min sur un agitateur orbital à 140 tr/min pour éliminer tout PFA restant.
   3. À l’aide de ciseaux de dissection stériles, retirez tous les muscles restants encore attachés à l’os.
   4. Lavez le tissu osseux une fois de plus avec 1x PBS pendant 3 min.
   5. Placez le tissu osseux dans un nouveau récipient avec 20% d’EDTA pH 8,0. Ensuite, placez le récipient sur un agitateur orbital à 140 tr/min pendant 30 min à température ambiante (RT).
   6. Jetez la solution, ajoutez de l’EDTA frais à 20 % pH 8,0 dans le récipient et placez-la sur un agitateur orbital à 140 tr/min pendant 30 min à RT.
   7. Répétez l’étape 1.3.6 10 fois.
   8. Jetez la solution, ajoutez de l’EDTA frais à 20 % pH 8,0 dans le récipient et placez-la à 4 °C dans une chambre froide sur un agitateur orbital à 140 tr/min pendant la nuit.
4. Déshydratation d’échantillons de tissu osseux
   1. Récupérez l’échantillon de tissu osseux du contenant.
   2. Inspectez le tissu et vérifiez l’efficacité de la décalcification en tournant et en tordant doucement l’os. Vous pouvez également effectuer une radiographie de l’os à l’aide d’un appareil à rayons X.
      REMARQUE : Si l’échantillon fléchit facilement, un bon degré de décalcification a été atteint. Si ce n’est pas le cas, les paramètres de détartrage (temps, vitesse d’agitation, volume de 20% EDTA pH 8,0. utilisé, etc.) doivent être augmentés.
   3. Lavez le tissu osseux 2 fois avec 1x PBS pendant 3 min pour éliminer les résidus d’EDTA.
   4. Placez le tissu osseux dans un nouveau récipient et commencez la déshydratation avec de l’éthanol à 70 %. Incuber pendant 15 min à 140 tr/min.
   5. Jetez la solution d’éthanol à 70 %, placez l’échantillon dans une solution d’éthanol à 90 % et incubez pendant 15 min à 140 tr/min.
   6. Jetez la solution d’éthanol à 90 %, mettez l’échantillon dans de l’éthanol à 100 % et incubez pendant 15 min à 140 tr/min.
   7. Jetez l’éthanol à 100 %, mettez l’échantillon dans un nouvel éthanol à 100 % et incubez pendant 15 min à 140 tr/min.
   8. Jetez l’éthanol à 100 %, mettez l’échantillon dans un nouvel éthanol à 100 % et incubez pendant 15 min à 140 tr/min.
   9. Jetez l’éthanol à 100 %, mettez l’échantillon dans un nouvel éthanol à 100 % et incubez pendant 30 min à 140 tr/min.
   10. Jetez l’éthanol à 100 %, mettez l’échantillon dans un nouvel éthanol à 100 % et incubez pendant 45 min à 140 tr/min.
       REMARQUE : La déshydratation peut également être effectuée à l’aide d’un processeur automatique. Dans ce cas, configurez le programme avec les mêmes conditions que celles signalées pour la déshydratation manuelle. Les conditions rapportées concernent des échantillons d’une épaisseur maximale de 4 mm (c.-à-d. des échantillons de tissu osseux provenant de souris). Pour les échantillons de plus de 4 mm d’épaisseur, le moment de la déshydratation doit être déterminé expérimentalement.
5. Clarification d’échantillons de tissu osseux
   1. Placez l’échantillon de tissu osseux dans un nouveau récipient et lancez le processus de nettoyage à l’aide de xylène. Incuber pendant 20 min à 140 tr/min.
   2. Jetez le xylène usagé, ajoutez du nouveau xylène et incubez pendant 20 minutes supplémentaires à 140 tr/min.
   3. Jetez le xylène utilisé, ajoutez du nouveau xylène et incubez pendant 45 min à 140 tr/min.
      REMARQUE : Le nettoyage peut également être effectué à l’aide d’un processeur automatique. Dans ce cas, configurez le programme avec les mêmes conditions que celles signalées pour le nettoyage manuel. Les conditions rapportées concernent des échantillons d’une épaisseur maximale de 4 mm (c.-à-d. des échantillons de tissu osseux provenant de souris). Pour les éprouvettes de plus de 4 mm d’épaisseur, le moment doit être déterminé expérimentalement.
6. Infiltration et enrobage d’échantillons de tissu osseux
   1. Récupérez l’échantillon de tissu osseux à partir de l’agitateur orbital/processeur automatique après l’élimination.
   2. Placez l’échantillon de tissu osseux dans une cassette d’enrobage et amorcez l’infiltration avec de la cire (voir le tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à 60 °C.
   3. Jetez la cire utilisée, ajoutez une nouvelle cire et incubez pendant 30 min à 60 °C.
   4. Jetez la cire usagée, ajoutez une nouvelle cire et incubez pendant 45 min à 60 °C.
   5. Placez soigneusement l’échantillon de tissu osseux dans un moule avec l’orientation souhaitée.
   6. Laissez le bloc d’échantillon se solidifier sur une surface froide.
   7. Conservez le FFPE obtenu à 4 °C jusqu’au moment de commencer le sectionnement.
      REMARQUE : Le bloc FFPE peut être stocké pendant de nombreuses années avant d’être effectué pour le sectionnement.

2. Lignes directrices pour la coupe d’échantillons FFPE non déminéralisés

REMARQUE : Les directives suivantes fournissent des conseils et des instructions précieux utiles pour améliorer considérablement la qualité des coupes de tissus tout en évitant la dégradation de l’ARN, en particulier dans le cas de petits échantillons d’os non décalcifiés. Ces lignes directrices peuvent également être appliquées aux échantillons d’os décalcifiés lorsqu’ils sont disponibles. Pour les échantillons de tissu osseux plus volumineux, une déminéralisation doit être effectuée pour obtenir des coupes de meilleure qualité ; Dans ce cas, la méthode décrite ci-dessus doit être suivie et les paramètres (temps, volumes de solutions, etc.) doivent être ajustés en conséquence. Les lignes directrices suivantes conviennent soit lorsque les tissus osseux FFPE ont déjà été traités (par exemple, bloc FFPE collecté dans des banques de tissus ou d’autres laboratoires), soit lorsque les sections collectées seront utilisées pour effectuer tout type d’analyse nécessitant un ARN de bonne qualité, des coupes de tissus de haute qualité, ou les deux.

1. Préparation de l’équipement
   1. Vaporisez toutes les surfaces de travail et tous les instruments avec des solutions décontaminantes pour éliminer les RNases.
   2. Préparez un bain-marie avec de l’eau distillée deux fois et réglez la température à 42 °C.
   3. Prenez une lame de microtome, vaporisez-la avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer les résidus d’huile, puis vaporisez-la avec des solutions décontaminantes pour éliminer les RNases.
   4. Fixez la lame sur le microtome. Assurez-vous que l’angle de dégagement est réglé sur 10°.
      REMARQUE : Utilisez toujours des lames neuves pour sectionner.
   5. Préparez deux seaux de glace.
   6. Prenez des pinces à épiler, des brosses et des sondes, vaporisez-les de solutions décontaminantes pour éliminer les RNases, et placez-les dans l’un des deux seaux à glace.
   7. Préparez un bain de glace en ajoutant de l’eau distillée deux fois dans l’autre seau à glace.
      REMARQUE : le bloc FFPE ne doit pas flotter dans l’eau ajoutée ; Par conséquent, la quantité d’eau ajoutée dans le seau à glace doit être juste suffisante pour permettre à l’échantillon d’être mouillé sans flotter.
2. Sectionnement
   1. Récupérez le bloc FFPE de son stockage à 4 °C et placez-le sur le microtome. Réglez la commande sur Trim ou sur 14 μm d’épaisseur de spirale, et commencez à couper l’échantillon jusqu’à ce que le tissu soit exposé.
      REMARQUE : Si le bloc FFPE a déjà été coupé et que le tissu est déjà exposé, sautez l’étape 2.2.1. Vérifiez que le bloc est sans trous ni fissures. Si c’est le cas, passez directement à l’étape 2.2.2. Sinon, coupez quelques sections pour aplatir la surface et éviter les trous et les fissures, puis passez à l’étape 2.2.2.
   2. Placez le bloc FFPE sur le bain de glace pour hydrater l’échantillon. Le temps d’hydratation doit être déterminé expérimentalement.
      1. Commencez par 2 min et augmentez le temps si l’hydratation ne suffit pas. Ne pas dépasser 10 min. L’hydratation dilatera les tissus et réduira la formation de « stores vénitiens » et de lignes. Des temps d’hydratation plus longs pourraient provoquer des fissures dans le bloc de paraffine et, éventuellement, un décollement des tissus.
      2. Si 10 minutes sont insuffisantes pour hydrater l’échantillon, effectuez des cycles d’hydratation ne dépassant pas 10 minutes et essayez à nouveau de sectionner.
      3. Si la surface du bloc n’est pas lisse et propre en raison de fissures ou de coupures, envisagez de réintégrer l’échantillon. La qualité de l’ARN ne sera pas affectée par le processus de réencastrement.
   3. Placez l’échantillon dans la pince à échantillon du microtome, alignez-le avec la lame et commencez à sectionner. Réglez l’épaisseur de la spirale sur 5 μm.
   4. Prélevez la section et placez-la dans le bain-marie à 42 °C à l’aide d’une pince à épiler et d’une brosse froide.
      REMARQUE : Alternativement, si l’isolement de l’ARN de sections de tissu doit être effectué, prélevez les sections dans un tube à centrifuger et suivez les spécifications de fabrication pour la préparation de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
   5. Incuber la section dans le bain-marie pour étirer les tissus et éliminer les rides et plis résiduels.
      REMARQUE : Le temps de flottaison dans le bain-marie pour chaque section doit être déterminé expérimentalement. Envisagez de laisser les sections osseuses une minute de plus si des problèmes de décollement de tissus se produisent. Ne laissez pas la section flotter trop longtemps car de longs temps de flottaison pourraient endommager les tissus.
   6. Placez la section sur une lame de verre, puis incubez-la pendant 3 h à 42 °C.
   7. Placez la lame de verre dans un dessiccateur ou un four pendant la nuit à RT pour un séchage correct.
   8. Rangez la diapositive en verre avec la section attachée à RT dans une boîte à diapositives.
      REMARQUE : Les diapositives peuvent être stockées pendant de nombreuses années chez RT. Si la transcriptomique spatiale doit être effectuée, au lieu d’une lame de verre, placez la section sur la lame d’expression génique spatiale fournie par le fabricant et suivez les recommandations rapportées (voir le tableau des matériaux).

Results

La méthode présentée ici décrit comment traiter des os fraîchement isolés pour obtenir des échantillons FFPE déminéralisés qui peuvent être facilement sectionnés avec un microtome tout en préservant l’intégrité de l’ARN (Figure 1). La méthode a été utilisée avec succès sur des fémurs murins, mais elle peut être suivie pour d’autres échantillons de tissu osseux de dimensions similaires, ou elle peut être adaptée à des échantillons osseux plus grands (par exemple, des échantillons humains) en augmentant tous les paramètres (timing, volumes de solutions, etc.).

Figure 1 : Représentation schématique du protocole. Schéma de principe de la méthode d’obtention de blocs FFPE de tissus osseux décalcifiés avec intégrité de l’ARN préservée (points 1 et 2). Schéma des lignes directrices pour la section des blocs FFPE (point 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour valider le bon moment de décalcification, une série de temps a été réalisée au cours de laquelle des fémurs non décalcifiés, des fémurs décalcifiés pendant 3 h (pour lesquels l’EDTA a été changé toutes les 30 minutes pour un total de 6 fois) et des fémurs décalcifiés pendant 24 h (pour lesquels l’EDTA a été changé toutes les 30 minutes pour un total de 10 fois, puis laissé dans l’EDTA pendant la nuit) ont été comparés (figure 2). Les blocs FFPE obtenus ont ensuite été sectionnés conformément aux directives ci-dessus, et la qualité histologique et l’intégrité de l’ARN des sections obtenues ont été vérifiées. Pour ce faire, l’intégrité structurelle et la morphologie des coupes de tissus ont été évaluées au moyen d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) suivie d’une inspection microscopique (Figure 2A, C, E), tandis que la qualité de l’ARN a été évaluée en évaluant la valeur de distribution des fragments d’ARN avec une taille supérieure à 200 nucléotides (200 nt) (connue sous le nom de score DV200)⁴ (Figure 2B, D,F). Les images H&E ont montré que les sections de fémur non décalcifiées et décalcifiées en 3 heures présentaient plusieurs fractures, trous et dommages (Figure 2A,C,), tandis que les sections de fémurs décalcifiées pendant 24 heures présentaient une bonne qualité histologique (Figure 2E). Tous les échantillons présentés ont des scores DV200 supérieurs à 50%, ce qui est considéré comme la valeur minimale pour effectuer des analyses scRNA-seq ou transcriptomique spatiale⁴. Des temps d’incubation plus longs avec des changements quotidiens d’EDTA, à 4 °C, avec une agitation plus légère dans des récipients plus petits, ont également été testés et ne sont pas recommandés car, dans ces conditions, l’intégrité de l’ARN des échantillons diminue considérablement (figure 2H). Par conséquent, le temps d’incubation a été réduit à 24 h, tandis que la fréquence, l’agitation et les volumes de décalcification ont été augmentés pour stimuler la décalcification.

Graphique 2. Coupes et contrôle de la qualité de l’intégrité de l’ARN (CQ) de fémurs de souris âgés de 8 semaines après décalcification. Les fémurs de souris de 8 semaines ont été fraîchement disséqués, réparés et décalcifiés avec un pH EDTA de 8,0 à 20 %. à différents points temporels, incorporé dans de la paraffine à l’aide de la méthode décrite et sectionné conformément aux directives rapportées. Le contrôle histologique des coupes obtenues a ensuite été effectué au moyen d’une coloration H&E, tandis que l’intégrité de l’ARN a été évaluée en évaluant la valeur de distribution des fragments d’ARN avec une taille supérieure à 200 nucléotides (200 nt) (DV200). (A) Coloration H&E montrant des coupes de fémur de souris âgées de 8 semaines après absence de décalcification. L’image de droite montre un grossissement plus élevé de la zone encadrée. (B) CQ de l’ARN de coupes de fémur de souris âgées de 8 semaines après absence de décalcification. (C) Coloration H&E montrant des coupes de fémur de souris âgées de 8 semaines après 3 h de décalcification. L’image de droite montre un grossissement plus élevé de la zone encadrée. (D) CQ de l’ARN de coupes de fémur de souris âgées de 8 semaines après 3 h de décalcification. (E) Coloration H&E montrant des coupes de fémur de souris âgées de 8 semaines après 24 h de décalcification. L’image de droite montre un grossissement plus élevé de la zone encadrée. (F) CQ de l’ARN de coupes de fémur de souris âgées de 8 semaines après 24 h de décalcification. (G) Coloration H&E montrant des coupes de fémur de souris âgées de 8 semaines après 72 h de décalcification. L’image de droite montre un grossissement plus élevé de la zone encadrée. (H) CQ de l’ARN de coupes de fémur de souris âgées de 8 semaines après 72 h de décalcification. Abréviations : H&E = hématoxyline et éosine ; DV200 (%) = % de la valeur de distribution des fragments > 200 nt ; nt = nucléotides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour tester l’efficacité des lignes directrices rapportées pour le traitement d’échantillons de FFPE non déminéralisés, des blocs FFPE de métastases d’ostéosarcome primaire humain non déminéralisé et d’ostéosarcome pulmonaire obtenus à partir de notre registre des tumeurs et de notre banque de tissus en oncologie musculo-squelettique (MOTOR) ont été collectés, et une analyse transcriptomique spatiale a été effectuée (Figure 3). Avant de procéder à l’analyse transcriptomique spatiale, les blocs de FFPE ont été réintégrés dans la paraffine pour obtenir une surface de départ lisse. Ensuite, l’ARN et la qualité histologique des coupes ont été évalués (données non présentées). Les étapes d’hydratation ont été décisives car les échantillons d’ostéosarcome primaire ne pouvaient pas être sectionnés sans une hydratation adéquate. En revanche, les métastases pulmonaires ne nécessitaient aucune étape d’hydratation. Après la section, les tissus ont été placés sur une lame transcriptomique spatiale (figure 3A), colorés avec H&E (figure 3D), et une analyse transcriptomique spatiale a été effectuée selon les spécifications du fabricant (voir la table des matériaux). Les banques d’ADNc obtenues ont été séquencées et les données traitées ont été visualisées avec Space Ranger pour le contrôle de la qualité⁵ (Figure 3B). Les résultats de Space Ranger ont montré des scores très élevés (près de 100%) pour les codes-barres valides, les identifiants moléculaires uniques (UMI) valides, les bases Q30 et la médiane des gènes détectés par point (entre 1700 et 5000), démontrant la robustesse et la solidité des données obtenues (Figure 3B). Au moyen d’une analyse par grappes basée sur des graphes impartiaux, 12 grappes principales ont été identifiées, y compris des grappes de cellules ostéogéniques, immunitaires, épithéliales et endothéliales, ainsi que des adipocytes (Figure 3E). Il est à noter que les limites des grappes chevauchaient les bords des régions histologiques identifiées par le pathologiste (figure 3D). Des sections supplémentaires des mêmes échantillons ont également été colorées au trichrome de Goldner pour visualiser les zones minéralisées (figure 3C).

Graphique 3. Analyse transcriptomique spatiale de deux paires d’ostéosarcome primaire (OS) non décalcifié et de métastases pulmonaires. Des blocs FFPE de deux paires appariées d’ostéosarcome primaire humain non déminéralisé et de métastases pulmonaires ont été prélevés dans notre banque de tissus moteurs. Les échantillons ont été sectionnés à l’aide des directives rapportées et ont été placés sur une lame d’expression génique spatiale Visium pour les échantillons FFPE afin d’effectuer une analyse transcriptomique spatiale. (A) Lame d’expression génique spatiale Visium pour les échantillons FFPE avec les sections jointes. (B) Sortie du Space Ranger montrant les paramètres communs utilisés pour évaluer la qualité des données obtenues pour tous les échantillons. (C) Coloration trichrome de Goldner montrant la localisation des tissus osseux minéralisés et de l’ostéoïde. (D) Coloration H&E montrant l’annotation du pathologiste. (E) Analyse en grappes montrant la localisation des populations cellulaires résidant dans les tissus. Abréviations : FFPE = fixé au formol et enrobé de paraffine ; MOC = cellules ostéogéniques malignes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ici, une méthode détaillée est fournie pour préparer des blocs FFPE d’os décalcifiés et préserver l’intégrité de l’ARN pour le séquençage (c’est-à-dire le séquençage de nouvelle génération (NGS)) ou pour d’autres techniques liées à l’ARN (c’est-à-dire l’hybridation in situ , la réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative (qRT-PCR), etc.).

La méthode utilise l’EDTA pour décalcifier les échantillons de tissu osseux ; l’incubation EDTA permet une déminéralisation lente mais fine des échantillons, préservant ainsi au mieux les caractéristiques histologiques du tissu. Habituellement, la décalcification osseuse est effectuée en utilisant 10% d’EDTA pH 7,0 pendant au moins 2 semaines en rafraîchissant la solution tous les deux jours⁴. Cependant, les longues périodes de décalcification contribuent de manière significative à la dégradation de l’ARN ^6,7,8. Pour surmonter ce problème, la concentration d’EDTA a été augmentée à 20 %, le pH a été élevé à 8,0 et la fréquence de remplacement de la solution a été augmentée à toutes les 30 minutes. Ces conditions, combinées à la grande quantité de solution à laquelle le tissu est exposé, à l’agitation vigoureuse et au rapport contenant/volume tissulaire élevé, ont maximisé la décalcification et réduit les temps de traitement, permettant une déminéralisation douce mais rapide. Il est important de noter que lorsque des échantillons de tissu osseux doivent être utilisés pour le séquençage du transcriptome, il n’est peut-être pas nécessaire de les décalcifier complètement. Dans ce cas, il faut trouver la proportion optimale entre une déminéralisation suffisante et une bonne conservation de l’ARN. Une autre chose importante à mentionner est que, quelle que soit la façon dont les échantillons sont traités, s’ils ont été fixés, leur ARN sera fragmenté. La méthode décrite ici permet de retenir les fragments d’ARN d’une taille supérieure à 200 nucléotides (%DV200) (Figure 2F), ce qui indique une qualité élevée de l’ARN ^9,11.

Cette méthode présente certaines limites. Tout d’abord, comme les souris étaient la seule source d’échantillons de tissu osseux, la méthode n’a été validée que sur des os murins, qui sont relativement petits. De plus, on ne sait pas si cette méthode peut être utilisée pour les souris âgées de plus de 8 semaines, car elle a été testée sur des souris âgées de 8 semaines seulement. Nous avons choisi des souris de 8 semaines parce qu’elles sont squelettiques matures. Comme le vieillissement modifie la teneur en minéraux des os, il peut être nécessaire de modifier cette approche.

De plus, les lignes directrices contribueraient à améliorer la qualité des coupes de tissus lorsque des échantillons FFPE de petits échantillons d’os non décalcifiés sont utilisés, comme, par exemple, lorsqu’ils sont prélevés directement dans des banques de tissus. Dans ces situations, rien ne peut être fait si l’ARN est dégradé, mais la qualité de la section peut être améliorée. D’autre part, pour les échantillons ayant une bonne teneur en ARN, comme ceux présentés ici, l’analyse transcriptomique spatiale est possible si les directives fournies sont suivies. Il convient de noter que dans les échantillons d’ostéosarcome primaire, la structure osseuse peut être altérée par la présence de la masse tumorale, ce qui rend les échantillons réels plus faibles et cassants, ce qui peut faciliter la section. Par conséquent, la coloration trichrome de Goldner a été utilisée pour évaluer si c’était le cas, car les zones minéralisées et non minéralisées peuvent être identifiées avec cette technique de coloration (figure 3C).

En conclusion, la méthode présentée représente une méthode facilement applicable pour décalcifier des échantillons de tissu osseux et obtenir des coupes FFPE qui peuvent être efficacement utilisées pour le NGS ou d’autres techniques nécessitant l’intégrité de l’ARN. De plus, des lignes directrices sont fournies pour la coupe d’échantillons qui n’ont peut-être pas été déminéralisés avant l’enrobage de paraffine, comme les échantillons obtenus à partir de banques de tissus. Compte tenu du développement rapide des analyses transcriptomiques spatiales, la méthode et les lignes directrices proposées pourraient être très utiles dans la recherche osseuse en général et dans la recherche sur le cancer osseux également.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agitateur orbital avancé	VWR	76683-470	À utiliser pour maintenir les tissus sous agitation pendant l’incubation, comme indiqué dans les instructions de la méthode.
Brosses en poil de chameau	Ted Pella	11859	À utiliser pour traiter les sections FFPE comme indiqué dans les directives.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	À utiliser pour effectuer la transcriptomique spatiale.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	À utiliser pour effectuer la déshydratation des tissus comme indiqué dans les instructions de la méthode.
Acide éthylènediaminetétraacétique, sel disodique dihydraté (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Utiliser pour préparer l’EDTA 20 % pH 8.0.  ;
Fisherbrand Pince incurvée à pointe moyenne à usage général	Fisher Scientific	16-100-110	À utiliser pour manipuler les sections FFPE comme indiqué dans les directives.
Fisherbrand Sonde de précision fine	Fisher Scientific	12-000-153	À utiliser pour manipuler les sections FFPE comme indiqué dans les directives.
Fisherbrand  ; Lames de microscope Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	À utiliser pour fixer des parchemins sectionnés comme indiqué dans les directives.
Lames de microtome diamantées à profil haut	CL Sturkey	D554DD	À utiliser pour sectionner les blocs FFPE comme indiqué dans les directives.
Séquenceur	Novaseq 150PE	Novogene	N/A
Paraformaldéhyde (PFA) 32 % Solution aqueuse	Microscopie	15714-S	Diluer à une concentration finale de 4 % avec 1x PBS  ; pour effectuer la fixation tissulaire.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Prêt à l’emploi. À utiliser pour diluer le PFA et pour effectuer les lavages comme indiqué dans les instructions de la méthode.
Premiere Tissue Floating Bath  ;	Fisher Scientific	A84600061	Utiliser pour éliminer les rides des coupes FFPE comme indiqué dans les directives.
RNase AWAY Décontaminant de surface	Thermo Fisher Scientific	7002	À utiliser pour nettoyer toutes les surfaces comme indiqué dans les instructions de la méthode.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	À utiliser pour isoler l’ARN des coupes FFPE une fois qu’elles ont été générées comme indiqué dans les directives.
Microtome rotatif semi-automatisé	Leica Biosystems	RM2245	À utiliser pour sectionner les blocs FFPE comme indiqué dans les directives.
Hydroxyde de sodium	Millipore Sigma	S8045-500	Préparez une solution de 10 N en dissolvant lentement 400 g dans 1 litre d’eau Milli-Q.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Permet de traiter la sortie de données de séquençage.
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Utiliser pour effectuer l’infliltration et l’enrobage des tissus comme indiqué dans les instructions de la méthode.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	À utiliser pour réaliser des expériences de transcriptomique spatiale.
Kit de sonde de transcriptome humain Visium Small  ;	10X Genomics	PN-1000363	Utilisation pour effectuer des expériences de transcriptomique spatiale.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns  ;	10X Genomics	PN-1000188	Permet de placer les coupes lors de la réalisation d’expériences de transcriptomique spatiale.
Xylène	Leica Biosystems	3803665	Utiliser pour effectuer l’élimination des tissus comme indiqué dans les instructions de la méthode.