Article de méthode

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

DOI :

10.3791/66921

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24 mai 2024

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1Department of Pathology, Case Western Reserve University, 2Division of Infectious Diseases and HIV Medicine, Department of Medicine, Case Western Reserve University, 3Cole Eye Institute, Ophthalmic Research, Cleveland Clinic

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) sont essentielles au bon fonctionnement de la rétine. Le dysfonctionnement de l’EPR est impliqué dans la pathogenèse d’importantes maladies rétiniennes, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique. Nous présentons une approche simplifiée pour l’isolement de l’EPR à partir d’yeux adultes murins. Contrairement aux méthodes précédemment rapportées, cette approche permet d’isoler et de cultiver des EPR très purs à partir de souris adultes. Cette méthode simple et rapide ne nécessite pas de compétences techniques approfondies et est réalisable avec des outils scientifiques et des réactifs de base. Les EPR primaires sont isolées chez des souris de fond C57BL/6 âgées de 3 à 14 semaines par énucléation de l’œil suivie de l’ablation du segment antérieur. La trypsinisation enzymatique et la centrifugation sont utilisées pour dissocier et isoler l’EPR de l’œilleton. En conclusion, cette approche offre un protocole rapide et efficace pour l’utilisation de l’EPR dans l’étude de la fonction rétinienne et de la maladie.

Introduction

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L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche cellulaire spécialisée qui tapisse la membrane de Bruch située entre les photorécepteurs et la choroïde1. Les cellules EPR jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement de la rétine. Les cellules EPR transportent le glucose et la vitamine A vers les photorécepteurs, favorisent la vision par réisomérisation de la rétine tout-trans en rétinienne 11-cis et maintiennent les segments externes du photorécepteur par phagocytose des segments externes excrétés, éliminent l’eau de l’espace sous-rétinien, forment la barrière hémato-rétinienne externe par la présence de jonctions serrées et sécrètent des facteurs de croissance neurotropes (tels que le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire, et facteur de croissance des fibroblastes de base) qui soutiennent les photorécepteurs2. Le dysfonctionnement des cellules EPR est impliqué dans la pathogenèse de diverses rétinopathies, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique 3,4,5. Les études in vitro utilisant des cellules RPE sont essentielles pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse de ces maladies. Les cellules primaires de l’EPR sont de loin préférées pour ces études, car les lignées cellulaires de l’EPR, bien qu’elles soient facilement disponibles, ne présentent pas les caractéristiques clés des cellules primaires de l’EPR.

Alors que diverses espèces ont été utilisées comme sources de cellules primaires de l’EPR, les souris ont l’avantage d’utiliser des modifications génétiques pour aider à comprendre la pathogenèse des rétinopathies. Les protocoles décrits précédemment pour isoler les cellules EPR des rongeurs nécessitent l’utilisation d’animaux nouveau-nés, sont longs, nécessitent des compétences techniques ou ne conviennent pas à la culture 6,7,8,9,10,11,12. Nous décrivons une méthode simple et rapide pour isoler les cellules EPR de souris adultes qui produisent des cultures très pures de ces cellules.

Protocole

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L’utilisation de sujets animaux dans cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Case Western Reserve.

1. Préparation des réactifs

  1. Préparez le milieu tampon de lavage en complétant la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol avec 10 mM de solution tampon HEPES. Maintenir la solution à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Préparez le milieu EPR en complétant le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco avec 4,5 g/L de glucose, 1,25 fois le supplément GlutaMAX (concentration de base 100x ou 200 mM ; concentration finale de 2,5 mM de L-glutamine), avec 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline/streptomycine et 1x solution d’acides aminés non essentiels MEM (100x). Avant utilisation, préchauffez le média à 37 °C au bain-marie.

2. Extraction de l’œil de la souris

  1. Euthanasier la souris, de préférence âgée de 3 à 14 semaines, à l’aide d’une méthode d’euthanasie approuvée par l’IACUC (la luxation cervicale sous anesthésie à l’aide d’un cocktail de kétamine et de xylazine à raison de 0,1 mL par 20 g de souris [87,5 mg/kg de kétamine et 12,5 mg/kg de xylazine] a été utilisée dans cette étude).
    REMARQUE : Les yeux prélevés sur des souris plus jeunes faciliteront l’augmentation du rendement des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes au fil du temps et étendront la capacité de passages successifs.
  2. Posez la souris à plat sur le côté, l’œil orienté vers le haut.
  3. Placez l’index et le pouce au-dessus et en dessous de l’œil, respectivement. Appliquez doucement une pression sur la structure osseuse entourant l’œil pour induire la saillie du globe oculaire.
  4. Insérez la pointe des ciseaux légèrement ouverts sous l’œil et tournez doucement le poignet en l’éloignant de l’œil de 90° jusqu’à ce que l’œil se détache de l’orbite.
    REMARQUE : Ne fermez pas les ciseaux pour couper l’œil ou le nerf optique, car cela rendrait la dissection de l’œilleton plus difficile.
  5. Placez immédiatement l’œil et roulez-le dans de l’éthanol à 70 % pendant 5 secondes au maximum avant de le transférer dans un milieu tampon de lavage maintenu sur de la glace.
  6. À l’aide d’un microscope à dissection, transférez un œil à la fois dans une boîte de Pétri remplie de tampon de lavage et de bandes de gaze trempée.
  7. Stabilisez l’œil en tenant le nerf optique à l’aide d’une pince à épiler. Faites doucement une incision au niveau de l’ora serrata à l’aide d’un couteau chirurgical de 3,00 mm à 45° ou d’une lame de rasoir de 0,009".
  8. À l’aide de ciseaux Vannas, insérez doucement les ciseaux dans l’incision et coupez autour de la circonférence de l’ora serrata jusqu’à ce que le segment antérieur et le vitré puissent être retirés et jetés.
  9. Décollez doucement la rétine de l’œilleton à l’aide d’une pince attachée, en prenant soin de ne pas perturber la couche d’EPR.
    REMARQUE : Pour faciliter l’élimination de la rétine, remplissez une pipette de transfert avec un produit tampon de lavage et appliquez-la soigneusement sur les bords de l’œilleton pour soulever doucement la rétine.
  10. Enfin, retirez le nerf optique et l’excès de tissu conjonctif de l’œilleton à l’aide de ciseaux. Attention à ne pas percer l’œilleton.

3. Isolement de l’EPR primaire

  1. Transférez l’œilleton dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1 mL de trypsine à 0,25 % + 0,02 % d’EDTA.
    REMARQUE : Deux œilletons peuvent être ajoutés à une aliquote de trypsine-EDTA pour augmenter le rendement en EPR cultivable.
  2. Transférez les tubes de microcentrifugation dans un bain-marie réglé à 37 °C et incubez pendant 10 min. Toutes les 2 minutes, retirez les tubes du bain-marie et tapotez fermement le bas du tube 40 fois sur le plan de travail.
  3. Après 10 min, perturbez doucement l’œilleton mécaniquement à l’aide d’une pipette sérologique P1000 ou de 2 mL en pipetant de haut en bas pas plus de 3 fois.
    REMARQUE : La fragmentation des feuilles RPE est essentielle car les grandes feuilles n’adhéreront pas correctement.
  4. Neutralisez immédiatement la trypsine en superposant les feuillets d’EPR détachés, mais pas l’œilleton, sur 0,5 mL de sérum fœtal bovin (FBS) dans un tube conique de 15 mL.
  5. De plus, diluez la trypsine en superposant 3 mL de média EPR goutte à goutte sur les couches de feuilles de FBS et d’EPR.
  6. Centrifuger l’EPR à 340 x g pendant 3 min.
  7. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans une quantité appropriée de milieu EPR pour une plaque de 24 puits (1,9 cm2/puits) ou une plaque de 48 puits (0,75 cm2/puits).
    REMARQUE : L’EPR peut être plaqué sur des plaques bien recouvertes de protéines de matrice extracellulaire, en particulier de laminine, de collagène IV ou de fibronectine, pour augmenter l’adhérence11. L’EPR peut également être remis en suspension dans 1 mL de milieu EPR et superposé sur un gradient de séparation de densité de 40 % pour isoler davantage les cellules EPR pures. De plus, faire tourner la plaque à 340 x g pendant 3 à 5 minutes peut augmenter l’adhésion cellulaire13.
  8. Incuber à 37 °C à 5% de CO2.

4. Culture de l’EPR

  1. Ne perturbez pas l’EPR isolé pendant au moins 3 jours. Après 72 h, retirez délicatement l’ancien média et remplacez-le par un média frais et préchauffé.
  2. Changez de milieu toutes les 48 h après les 3 premiers jours.
  3. Une fois que les cellules atteignent la confluence, faites passer les cellules en utilisant 0,25 % de trypsine + 0,02 % d’EDTA et réduisez le FBS dans le milieu RPE à 2 %.
    REMARQUE : Les EPR primaires ont déjà commencé à se dédifférencier après 5 à 7 passages et commenceront à perdre leur forme hexagonale et leur pigmentation14.

Résultats

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Le protocole décrit a été utilisé sur des souris de fond C57BL/6. Le sexe ne semble pas changer la capacité à cultiver l’EPR. Les souris de moins de 6 semaines produisent des feuilles d’EPR limitées par rapport aux souris plus âgées, et plus d’yeux peuvent être nécessaires pour atteindre une confluence optimale. Après l’isolement, les cellules EPR mettent environ 3 jours à se stabiliser et à se fixer à la plaque de culture cellulaire. Environ 24 h après l’isolement, des cellules rondes et pigmentées qui semblent anucléées ont commencé à se déposer, mais n’ont pas complètement adhéré à la plaque (figure 1A). Au cours des 48 à 72 prochaines heures, les cellules commencent à se fixer et à s’étendre tout en conservant leur pigmentation foncée et leur noyau transparent (Figure 1B,C). Après 5 jours, les EPR ont augmenté leur confluence et ont commencé à former des contacts de cellule à cellule rappelant une monocouche polarisée de forme hexagonale (Figure 1D).

La pureté et l’intégrité des jonctions serrées ont été évaluées après 6 jours de culture. L’EPR a d’abord été évaluée pour la présence de la protéine rétinoïde isomérohydrolase ou de la protéine 65 kDA de l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE65), un marqueur spécifique de l’EPR (Figure 2, vert). De plus, pour que l’EPR forme une seule couche de cellules pigmentées et de forme hexagonale, les jonctions de cellule à cellule doivent rester intactes. La protéine de jonction serrée-1 ou zonula occludens-1 (ZO-1) sont des protéines d’échafaudage essentielles au maintien et à l’intégrité des jonctions serrées entre les cellules EPR individuelles14. Les cultures d’EPR isolées confluentes ont conservé leurs protéines de jonction intercellulaire, comme en témoigne la coloration de ZO-1 à la périphérie de la cellule (Figure 2, rouge). Une fois que ces cellules atteignent la confluence en grandes feuilles, elles maintiennent des contacts de cellule à cellule sans proliférer jusqu’à 2 semaines. Des études antérieures ont montré que le ZO-1 est fortement exprimé jusqu’à 9 jours en culture15. D’autres marqueurs utilisés dans les cultures d’EPR primaires comprennent le collagène IV, le CRALBP et l’OTX211.

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Graphique 1. Morphologie de l’EPR primaire de souris cultivée sur une plaque standard de polystyrène à 24 puits. (A) EPR primaire isolé des deux yeux d’une souris C57BL/6 et cultivé dans un seul puits d’une plaque de polystyrène à 24 puits de culture tissulaire non enrobée directement après l’isolement. (B, C) Après 48 h et 72 h, l’EPR primaire commence à adhérer à la plaque et forme des cellules pigmentées et binucléées. (D) Après 5 jours, la microscopie à fond clair montre que les cellules hyperpigmentées de forme hexagonale augmentent la confluence et commencent à former des contacts de cellule à cellule. Barre d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Graphique 2. Le marqueur spécifique de l’EPR, l’EPR-65, et le marqueur de la jonction intercellulaire, le ZO-1, sont conservés dans l’EPR primaire murin isolé. L’EPR primaire de trois souris C57BL/6 a été cultivé pendant 6 jours avant d’être fixé avec du paraformaldéhyde à 4 %. Les cellules ont été perméabilisées avec 0,1 % de Triton-X dans du PBS pendant 5 min, bloquées avec 5 % de sérum de chèvre normal et incubées avec des anticorps contre le RPE-65 (vert) ou le ZO-1 (rouge). Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Graphique 3. Représentation schématique simplifiée du protocole d’isolement de l’épithélium pigmentaire rétinien. Après avoir retiré le globe oculaire de la souris, stérilisez l’œil en le trempant brièvement dans de l’éthanol à 70 % avant de passer au tampon de lavage. Dans le tampon de lavage, coupez le long de l’ora serrata et retirez le segment antérieur. Retirez la rétine et placez l’œilleton dans un tube avec de la trypsine/EDTA. Tapotez doucement le tube sur le comptoir toutes les 2 minutes pendant 10 minutes au total, transférez le surnageant dans un tube conique de 15 ml et centrifugez la pastille de RPE. Remettez les cellules et la plaque en suspension sur une plaque à 24 ou 48 puits. Graphiques générés à l’aide de BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Dans cet article, nous avons décrit un protocole simplifié pour l’isolement et la culture de l’épithélium pigmentaire rétinien murin. Les cellules EPR isolées dans les yeux de souris adultes ont exprimé un marqueur spécifique de l’EPR, RPE65, et un marqueur de jonction intercellulaire, ZO-1. De plus, les cellules cultivées se sont développées en feuilles hexagonales pigmentées en culture.

Plusieurs méthodes d’isolement de l’EPR chez les rongeurs ont été publiées précédemment 6,7,8,9,10,11,12. De nombreux protocoles décollent les couches de l’EPR de la membrane de Bruch, ce qui nécessite des compétences techniques et augmente le risque de dommages à l’EPR ou de mort cellulaire 6,7,9,11,12,16. Ainsi, ce protocole utilise le détachement enzymatique de la couche d’EPR, plutôt que la dissociation mécanique, pour favoriser la survie et maintenir l’intégrité des feuillets d’EPR en culture. Cette méthode permet d’obtenir des EPR de souris dans une culture qui maintient la morphologie de l’EPR avec des cellules hautement pigmentées et de forme hexagonale qui conservent l’expression des protéines de jonction serrée. De plus, ce protocole ne prévoit pas l’utilisation de réactifs complexes ou de matériaux utilisés dans d’autres protocoles, tels que des inserts de membrane perméables, des protéines de revêtement de matrice extracellulaire supplémentaires ou des réactifs spécialisés de dissociation tissulaire. Au lieu de cela, ce protocole utilise une digestion enzymatique simple en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA en combinaison avec une agitation tissulaire pour dissocier la couche d’EPR de la membrane de Bruch. Ce protocole a été réalisé avec succès sur des souris âgées de 3 à 14 semaines ; Cependant, plus d’yeux peuvent être nécessaires pour obtenir une culture confluente chez les jeunes souris.

Plusieurs défis peuvent survenir lors de l’exécution de ce protocole. Des compétences techniques sont nécessaires pour couper avec précision autour de l’ora serrata et retirer soigneusement la rétine sans perturber la couche RPE. La rétine peut être perturbée lors de la coupe de la circonférence de la sclérotique, ce qui peut altérer la viabilité de l’EPR. Le raffinement de cette technique ne peut être accompli que par une pratique répétitive et continue. De plus, les feuilles d’EPR peuvent rester attachées à la couche rétinienne après le retrait. Pour éviter une perte excessive d’EPR, stimulez le décollement de la rétine à l’aide d’une seringue ou d’une pipette de transfert remplie d’un tampon de lavage pour soulever doucement les bords de la rétine de l’œilleton. L’incubation de l’hyaluronidase peut également faciliter le détachement16. Dans le cas où les EPR ne se détachent pas correctement de la membrane de Bruch et de la choroïde, augmentez le temps d’incubation avec de la trypsine dans le bain-marie. De plus, congelez des aliquotes de trypsine fraîche à -20 °C et décongelez-les directement avant utilisation pour maintenir une activité enzymatique optimale. L’EPR ne parvient pas à se fixer à la plaque du puits après l’isolement si les cellules sont ensemencées à une densité trop faible ou si l’EPR a été endommagé pendant le processus d’isolement. De plus, notre protocole ne nécessite pas l’enrobage de protéines de matrice extracellulaire (ECM) pour la culture. Cependant, il a été démontré que les protéines ECM, telles que la fibronectine, le collagène IV, la laminine ou le collagène I, augmentent l’attachement cellulaire et doivent être prises en compte si l’observance est faible11.

Pour augmenter le rendement des monocouches cultivées par EPR, regroupez au moins 2 à 3 yeux de souris du même âge ayant le même patrimoine génétique ; Les cellules peuvent perdre leur forme hexagonale et leur pigment au fil du temps si elles ne sont pas ensemencées à une densité suffisamment élevée. Pour les souris âgées de plus de 8 semaines, 2 yeux par plaque de 24 puits devraient suffire pour une confluence optimale. Si les souris ont moins de 8 semaines, 3-4 yeux entraîneront une meilleure adhérence et confluence. Au fil du temps, les cellules peuvent être sensibles à la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) avec perte de pigmentation et acquisition d’une forme allongée. L’ajout d’inhibiteurs de la Rho-Kinase et du TGFβR-1/ALK5, tels que Y27632 et Repsox, respectivement, peut prévenir l’EMT des cellules EPR12 en culture. Bien que le protocole d’isolement soit bref, ne nécessitant que 1 h pour l’isolement de 2 à 4 yeux, la culture primaire peut prendre jusqu’à 7 à 10 jours pour atteindre la pleine confluence. De plus, le passage de l’EPR est limité, avec un risque accru d’EMT à chaque passage ultérieur.

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes sont des cellules essentielles au maintien de l’homéostasie dans l’œil. Les EPR agissent comme des phagocytes pour aider au maintien des photorécepteurs, empêchent les couches neurales d’être endommagées par la lumière et agissent comme une barrière épithéliale étanche pour réguler le transport17. Les maladies affectant directement l’EPR, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique, peuvent exacerber l’inflammation, augmenter l’apoptose et perturber les jonctions cellulaires, entraînant une probabilité accrue de dégénérescence rétinienne et de cécité17. La culture de l’EPR primaire facilite l’étude de la pathogenèse des maladies oculaires affectant l’EPR. En conclusion, notre protocole raccourcit la durée d’isolement et simplifie les techniques et réactifs nécessaires tout en maintenant une culture cellulaire de haute pureté.

Déclarations de divulgation

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Il n’y a pas de divulgation financière ou non financière pertinente.

Remerciements

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Les recherches présentées dans cette publication ont été soutenues par les subventions des NIH R01EY018341 et R01EY019250 (C.S.S.), F31EY035156 des subventions NIH (A.H.) et P30 EY011373. L’organisme de financement n’a joué aucun rôle dans la conception ou la réalisation de cette recherche.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0.009 RD Lames à simple tranchantPersonna941202
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Corning10-013-CVavec 4,5 g/L de glucose, L-glutamine, pyruvate de sodium,
sérum de veau fœtalCorning35010CV
, GlutaMAX, 100xGibco35050061
Hank’s Balanced Salt SolutionGibco14175095sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol
tampon HEPES (1M)Gibco
MEM, 100xGibco11140050
Micro-Unitome KnifeBVI Beaver377546
Pénicilline-Streptomycine Solution, 100xMicroplaques de30-002-CI
Falcon08-772-124 puits ou 48 puits
Sérum de veau fœtal régulierCorning35-010-CV
Trypsine-EDTA (0,25 %)Ciseaux Gibco25200056avec rouge phénol
VannasOutils scientifiques fins10091-12
, Solution Acides aminés non essentiels 15630106 polystyrène Corning

Références

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Mots-clés

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