Une procédure rapide et standardisée pour établir des communautés de biofilms multi-espèces synergiques à partir de divers sols de la rhizosphère est présentée ici. Il s’agit d’un protocole unique conçu pour sonder et simuler le microbiote complexe du sol de la rhizosphère.
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Article de méthode
Une approche pour la construction de communautés de biofilms multispécifiques à partir du sol de la rhizosphère
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le biofilm multi-espèces est un mode de vie naturel et dominant des bactéries dans la nature, y compris dans le sol de la rhizosphère, bien que la compréhension actuelle soit limitée. Ici, nous proposons une approche pour établir rapidement des communautés synergiques de biofilms multi-espèces. La première étape consiste à extraire des cellules du sol de la rhizosphère en utilisant la méthode de centrifugation différentielle. Ensuite, ces cellules du sol sont inoculées dans le milieu de culture pour former un biofilm pelliculaire. Après 36 h d’incubation, la composition bactérienne du biofilm et de la solution sous-jacente est déterminée à l’aide de la méthode de séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S. Pendant ce temps, l’isolement bactérien à haut débit du biofilm pellicle est effectué à l’aide de la méthode de dilution limitante. Ensuite, les 5 premiers taxons bactériens sont sélectionnés avec la plus grande abondance dans les données de séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S (échantillons de biofilm de pellicule) pour une utilisation ultérieure dans la construction de communautés de biofilms multi-espèces. Toutes les combinaisons des 5 taxons bactériens ont été rapidement établies à l’aide d’une plaque de 24 puits, sélectionnée pour la plus forte capacité de formation de biofilm par le test de coloration au violet cristallin, et quantifiée par qPCR. Enfin, les communautés de biofilms multi-espèces bactériennes synthétiques les plus robustes ont été obtenues par les méthodes ci-dessus. Cette méthodologie fournit des orientations informatives pour mener des recherches sur le biofilm multi-espèces de la rhizosphère et identifier des communautés représentatives pour étudier les principes régissant les interactions entre ces espèces.
Introduction
Les biofilms représentent des communautés microbiennes complexes, soit fixées à des surfaces, soit reliées par des interfaces. Il est largement reconnu que la majorité des bactéries rencontrées dans divers environnements, tels que les habitats naturels, les milieux cliniques et les contextes industriels, perdurent au sein des communautés de biofilms1. Dans le sol, la rhizosphère, qui englobe la surface racinaire et la région adjacente de 2 mm d’épaisseur, forme une niche écologique avec une disponibilité accrue des nutriments. Des bactéries spécifiques ont développé des stratégies pour exploiter ce créneau, favorisant la prolifération microbienne et favorisant la formation de communautés de biofilms dans la rhizosphère2.
Les microbes de la rhizosphère sont considérés comme le « deuxième génome » des plantes3. Les micro-organismes favorisant la croissance des plantes (PGPM) s’engagent dans une symbiose mutualiste avec les plantes, fournissant des fonctions significatives de promotion de la croissance et de biocontrôle4. D’une part, le PGPM peut fournir des nutriments aux racines des plantes, améliorer l’absorption des nutriments, se défendre contre les agents pathogènes et dégrader les polluants dans le sol de la rhizosphère5. D’autre part, le PGPM utilise les exsudats racinaires des plantes comme source de nutriments pour la croissance et l’évolution, influençant ainsi le sol de la rhizosphère et le système racinaire par leur propre métabolisme. Il convient de noter que la condition préalable à toutes ces fonctions est la colonisation efficace des PGPM dans la rhizosphère végétale, formant des biofilms stables6.
Le biofilm de la rhizosphère affecte le processus d’assemblage des microbes de la rhizosphère, et les caractéristiques temporelles et spatiales de l’assemblage des microbes de la rhizosphère sont étroitement liées à l’interaction du biofilm multi-espèces7. Il sert de plaque tournante des interactions plante-microbiome, fournissant une niche stable et contrôlable pour qu’ils interagissent efficacement. Par conséquent, l’étude du biofilm de la rhizosphère est également une direction importante pour mieux comprendre l’interaction entre les plantes et les microbes.
Cependant, il existe actuellement peu de recherches sur les biofilms multi-espèces de la rhizosphère. La grande complexité de la composition du microbiome rend difficile la réponse aux questions écologiques fondamentales entourant les communautés microbiennes naturelles8. Au cours des expériences, de nombreuses conditions, telles que le type de sol, le type de plante et le grand nombre de communautés microbiennes, doivent être prises en compte. Divers facteurs limitent la recherche de biofilms multi-espèces de la rhizosphère.
Pour étudier plus en détail les communautés de biofilms multispécifiques du sol de la rhizosphère, telles que les interactions synergiques interespèces ou l’alimentation croisée des métabolites8, il est souhaitable de construire artificiellement une communauté microbienne synthétique simplifiée, représentative, stable et traitable dans des conditions de laboratoire 9,10. Ici, un protocole standardisé combine plusieurs des dernières techniques microbiologiques et bioinformatiques.
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Protocole
Ce protocole est généralement applicable au microbiote du sol de la rhizosphère de diverses plantes. Ici, le concombre est utilisé comme exemple. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Isolement bactérien
- Isolement du sol de la rhizosphère
- Culture du concombre
- Désinfectez les graines de concombre avec une solution d’éthanol à 75 % et d’hypochlorite de sodium à 2 % (NaClO), puis rincez-les à l’eau stérile11.
- Faites germer les graines dans des conditions stériles et sélectionnez celles qui atteignent le stade12 à deux feuilles. Par la suite, transplantez les plants de concombre uniformément germés dans des pots contenant 2 kg de terre noire.
REMARQUE : Deux types de terre noire provenant de différents endroits du nord-est de la Chine sont utilisés pour réduire les erreurs systématiques.
- Préparation de la suspension du sol
- Préparer le tampon PBS-S à l’aide de la formulation : 6,33 g de NaH2PO4· H2O, 16,5 g de Na2HPO4·7H2O, 200 μL de Silwet L-77 et 1 L d’eau distillée.
- Lorsque les semis atteignent le stade12 à quatre feuilles, retournez le pot et isolez les racines avec un sol rhizosphérique de 2 mm d’épaisseur à l’aide de gants stérilisés.
- Placez les racines dans 30 mL de tampon PBS-S dans un tube à centrifuger de 50 mL. Après avoir secoué pendant 20 min, filtrez la suspension à travers un filtre à cellules en nylon de 100 μm pour éliminer les racines et les gros sédiments.
- Transférez le filtrat dans un autre tube à centrifuger de 50 ml, centrifugez-le à 3200 x g pendant 15 min à température ambiante et stockez-le temporairement à 4 °C.
- Culture du concombre
- Extraction de cellules bactériennes du sol de la rhizosphère.
REMARQUE : Cette méthodologie adopte la méthode de centrifugation différentielle13, bien que la méthode de centrifugation à gradient de densité de Nycodenz14 s’applique également à cette étape.- Diluer la suspension de sol avec une solution de Na4P2O7 à 0,2 % à 500 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min pour séparer initialement les organismes du sol.
- Réhomogénéisez le précipité, centrifugez-le à la même vitesse basse pendant 60 s et répétez le processus trois fois. Mélangez les surnageants, centrifugez-les à 12 000 x g pendant 20 min, puis jetez le surnageant.
- Remettre le précipité en suspension dans 50 mL de tampon PBS-S, constituant la suspension de cellules bactériennes du sol de la rhizosphère.
2. Séquençage et identification du microbiobiote de la rhizosphère
- Préparation des milieux
REMARQUE : Le bouillon de soja tryptique (TSB) et le milieu de sels minimaux de glycérol glutamate (MSgg) sont disponibles dans le commerce. Les formulations ci-dessous sont fournies à titre indicatif seulement.- Préparer le milieu TSB à l’aide de la formulation suivante : 15 μg/mL de tryptone, 5 μg/mL de peptone de soja, 5 μg/mL de NaCl, pH = 7.
- Préparer le milieu MSgg en utilisant la formulation suivante : 5 mM KH2PO4, 100 mM d’acide 3-(N-morpholino) propane sulfonique (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM thiamine, 0,5 % de glycérol, 0,5 % de glutamate, 50 μg/mL de tryptophane, 50 μg/mL de phénylalanine, pH = 7.
- Pour préparer des supports TSB-MSgg, mélangez des supports TSB avec des supports MSgg dans un rapport de 1:1 (v/v)15.
- Coculture de biofilm pelliculaire
- Incuber la suspension cellulaire dans un milieu TSB à 30 °C pendant la nuit (généralement 12 h) pour activer la bactérie.
- Placez des filtres cellulaires en nylon de 100 μm sur des plaques à 24 puits. Incuber les bactéries dans un milieu TSB et mettre en place trois répétitions. Cultivez le biofilm pelliculaire pendant 36 h à 30 °C.
REMARQUE : Si le biofilm pelicule de la dernière étape n’est pas bien cultivé, le milieu TSB-MSgg est un substitut efficace au milieu TSB. - Retirez le filtre contenant le biofilm de la pellicule. Ajoutez 2 ml de tampon PBS-S dans une nouvelle plaque de cellules à 24 puits, placez-y le filtre à 24 puits pour laver le biofilm et retirez les cellules libres. Répétez le processus de lavage trois fois.
- Extraction de l’ADN du biofilm pellaire
- Extrayez le génome du biofilm à l’aide d’un kit d’ADN en suivant les instructions du fabricant.
- Séquençage à haut débit
REMARQUE : Les entreprises de biotechnologie peuvent aider à réaliser des expériences de séquençage pour la plupart des laboratoires. Si la composition microbienne de la solution restante est nécessaire, séquencez-la à cette étape. L’étape de séquençage varie en fonction des instruments. Veuillez suivre les instructions du fabricant. L’étape 2.4.1 est fournie à titre indicatif seulement.- Amplifiez les régions V3-V4 du gène de l’ARNr 16S en vous basant sur la base de données avec des séquences complètes du gène de l’ARNr 16S. Créer des UTO d’espèces en fonction du nombre minimum de séquences par échantillon16. Regroupez les annotations de classification des espèces et acquérez la composition des communautés à partir de chaque échantillon.
- D’après les données de séquençage, sélectionnez les cinq principales souches en fonction de leur abondance relative.
- Isolement et culture bactériennes à haut débit
REMARQUE : Cette étape est conçue selon les dernières méthodologies microbiologiques et bioinformatiques17. La méthode de la plaque revêtue de dilution est disponible pour l’isolement bactérien ici, bien qu’elle prenne plus de temps et soit moins ciblée que les techniques à haut débit.- Mélangez le biofilm cultivé. Utilisez une dilution limitative pour vous assurer qu’il n’y a pas plus de 30 % des puits de la plaque à 24 puits qui présentent une croissance bactérienne.
REMARQUE : Pour déterminer la dilution la plus appropriée, effectuez des expériences préliminaires en utilisant une large gamme de taux de dilution. La dilution optimale ne doit pas contenir plus de deux bactéries cultivables par millilitre, ce qui représente une incubation bactérienne dans moins de 30 % des puits. - Amplifiez le gène de l’ARNr 16S de la bactérie tout en ajoutant des étiquettes pour les puits et les plaques et séquencez-les à l’aide de la plateforme à haut débit Illumina17.
- Effectuer des analyses bioinformatiques à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce afin d’obtenir des informations sur la pureté et la taxonomie des espèces pour chaque culture.
- Cultivez les cinq bactéries pures les plus abondantes par culture en ligne continue et utilisez du glycérol pour préserver les bactéries à -80 °C.
- Mélangez le biofilm cultivé. Utilisez une dilution limitative pour vous assurer qu’il n’y a pas plus de 30 % des puits de la plaque à 24 puits qui présentent une croissance bactérienne.
3. Construction de communautés microbiennes synthétiques
- Culture de biofilm reconstruite
REMARQUE : Pour plus de détails, veuillez consulter Ren et al.18. Les 5 souches correspondent à 31 combinaisons synthétiques, dont 5 consortiums monospécifiques, 10 consortiums biespèces, 10 consortiums tri-espèces, 5 consortiums quadri-espèces et 1 consortium 5-espèces.- Incuber les 5 souches dans le milieu TSB jusqu’à ce que leur OD600 atteigne 1 pour les activer.
- Préparez plusieurs plaques de 24 puits avec du milieu TSB et placez-y des filtres à cellules en nylon de 100 μm.
REMARQUE : Si le biofilm de la dernière étape n’est pas bien cultivé, le milieu TSB-MSgg est un substitut efficace au milieu TSB. - Incuber les 31 combinaisons de communautés synthétiques dans le média. Assurez-vous que le nombre de bactéries inoculées est constant dans chaque puits. Établissez trois répétitions pour chaque combinaison.
- Cultivez le biofilm à 30 °C pendant 36 h.
- Quantification du biofilm pelliculaire
- Suivez la même procédure qu’à l’étape 2.2.3.
- Transférez le biofilm dans une nouvelle plaque à 24 puits contenant 180 μL de solution de violet cristallin et colorez-le pendant 20 min.
- Transférez l’échantillon coloré dans une autre plaque à 24 puits contenant 200 μL d’éthanol à 96 %, éluez-le pendant 30 min et mesurez la DO590.
4. Quantification du nombre de cellules pelliculaires
REMARQUE : Pour déterminer la proportion de chaque espèce et le nombre de cellules dans la pellicule et la solution restante, une PCR quantitative est nécessaire. Pour plus de détails, voir Sun et al.16.
- Concevez des amorces spécifiques à la souche pour les communautés microbiennes synthétiques sélectionnées.
- Utilisez Roary pour effectuer des comparaisons de génome et découvrir les gènes à copie unique spécifiques à la souche de chaque isolat. Assurez-vous que les amorces ciblent ces gènes.
- Ligase les fragments amplifiés en plasmides PMD19T. Générez des courbes standard à l’aide des plasmides contenant les fragments correspondants comme modèles.
- Suivez les mêmes étapes que celles mentionnées à l’étape 2.2.
- Préparez les composants réactionnels comme suit : 7,2 μL de H2O, 10 μL de 2 mélanges maîtres qPCR, 0,4 μL de 10 μM de chaque amorce et 2 μL d’ADN matrice.
- Effectuez la PCR à l’aide d’un instrument de PCR en temps réel dans les conditions suivantes : 95 °C pendant 10 min, 40 cycles de 95 °C pendant 30 s et 60 °C pendant 45 s, suivis d’un segment de courbe de fusion standard.
- Effectuez six répétitions biologiques pour chaque traitement.
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Résultats
Suite à la procédure mentionnée, des gradients significatifs de la capacité de formation de biofilms à partir du microbiote du sol de la rhizosphère du concombre sont observés (Figure 1). Le séquençage de l’amplicon du biofilm a confirmé la présence de l’espèce dans la pellicule (Figure 2). D’après la cartographie thermique des données de séquençage, les cinq principales espèces bactériennes dont l’abondance dans la pellicule est supérieure à celle de la solutio...
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Discussion
Conformément au protocole, une série de communautés de biofilms synthétiques multi-espèces robustes sont construites sur la base du microbiote dans le sol de la rhizosphère à partir de différentes plantes. À l’aide de techniques de PCR quantitative, la composition de chaque communauté est clairement déchiffrée. La biomasse du biofilm indique la force de leurs interactions métaboliques potentielles, bien que diverses propriétés et mécanismes à l’origine de la coopération n’aient pas pu être révélés ici19...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (42307173 et 42107328) et le Programme national de recherche et de développement clés (2022YFD1500202 et 2022YFF1001800). P.W, Z.X ont conçu l’étude. P.W, B.X, Z.C, J.X et N.Z ont analysé les données et créé les chiffres. P.W a écrit la première ébauche du manuscrit. Z.X., R.Z. et Q.S. révisèrent le manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,2 % Na4P2O7 solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20041418 | Utilisé pour diluer la suspension de terre. |
| 100 &mu ; m Filtre cellulaire en nylon | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F613463-0001 | Utilisé pour filtrer la solution de culture et séparer le biofilm de la pellicule. |
| Solution de NaClO à 2 % | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | L03336903 | Utilisé pour stériliser les graines. |
| Plaque à 24 puits | Merck & Co., Inc. | PSRP010 | Utilisé pour la culture micobiale et la séparation du biofilm pelliculaire. |
| Acide 3-(N-morpholino) propane sulfonique (MOPS) | Bioolook Scientific Research | Special 2360010 | Utilisé pour préparer les milieux MSgg. |
| Tube de centrifugation de 50 ml | Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. | 62.547.254 | Tubes à centrifuger correctement dimensionnés pour notre protocole. |
| 75 % C2< / sub>H5< / sub>OH solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 801769680 | Utilisé pour stériliser les graines. |
| Acinetobacter baumannii XL-1 | Université agricole de Nanjing | N/A | Souches isolées du sol de la rhizosphère. |
| Bacillus velezensis SQR9 | Nanjing Agricultural University | N/A | Souches isolées du sol de la rhizosphère. |
| Kit d’ADN de bactéries | Nanjing Dinsi Biotechnology Co., Ltd. | D3350020000K04U021 | Utilisé pour extraire l’ADN bactérien. |
| Sol noir I | Université agricole de Nanjing | N/A | Sol noir de la province de Jilin. |
| Sol noir II | , Université agricole de Nanjing | , N/A | Sol noir de la province du Heilongjiang. |
| Burkholderia cenocepacia XL-2 | Nanjing Agricultural University | N/A | Souches isolées du sol de la rhizosphère. |
| CaCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10035048 | Utilisé pour préparer les médias MSgg. |
| Centrifugeuse | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | G508009-0001 | Centrifugeuse à grande vitesse. |
| ChamQ SYBR qPCR Master Mix | Vazyme Biotech Co., Ltd. | Q311-02 | Utilisé pour l’amplification de l’ADN dans la qPCR. |
| Banc propre | Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. | NB026143 | Utilisé pour un fonctionnement aseptique. |
| Incubateur à température constante | ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd | GNP-9080BS- | Utilisé pour la culture microbienne. |
| Cristal Violet Dye | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600331 | Utilisé pour la coloration et la quantification du biofilm de la pellicule. |
| Graine de concombre | Université agricole de Nanjing | N/A | « Jinchun I » graine de concombre. |
| Culturome v 1.0 | L’Institut de génétique et de biologie du développement de l’Académie chinoise des sciences | N/A | Utilisé pour la rhizosphère à haut débit, la culture et l’identification |
| FeCl3 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | Utilisé pour préparer les milieux MSgg. |
| Réfrigérateur | Hefei Midea Fridge Co., Ltd. | BCD-556WKPM(Q) | Utilisé pour la préservation des souches. |
| Glutamate | Bioolook Scientific Research | Special 2180020 | Utilisé pour préparer les milieux MSgg. |
| Glycérol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Utilisé pour préparer les milieux MSgg. |
| Panier de plantation hydroponique | Yulv Furniture Store | 6526262626 | Utilisé pour la culture hydroponique du concombre. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10017618 | Utilisé pour préparer les médias MSgg. |
| MgCl2 | Xilong Scientific Co., Ltd. | 7791186 | Utilisé pour préparer les médias MSgg. |
| MnCl2 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10400101 | Utilisé pour préparer les médias MSgg. |
| Msgg Medium | Shanghai Bioesn Biotechnology Co., Ltd. | BES20791KB | Milieu de culture du biofilm Pellicule. |
| Na2HPO4· ; 7H2O | Merck & Co., Inc. | S9390-100G | Utilisé pour préparer les supports TSB. |
| NaCI | Chinasun Specialty Products co., Ltd. | HS0416 | Utilisé pour préparer les supports TSB. |
| NaH2PO4· ; H2O | Merck & Co., Inc. | S9638-25G | Utilisé pour préparer les supports TSB. |
| PBS-S Buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E607008-0001 | Tampon de base pour tissus vivants. |
| Phénylalanine | RYON | RT3486L005 | Utilisé pour préparer les milieux MSgg. |
| Pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. | BS-1000-T | Utilisé pour l’inoculation de souches. |
| PMD19T Plasmide | Takara Biomedical Technology (Pékin) Co., Ltd. | D102A | Utilisé pour générer des courbes standard qPCR. |
| Pot | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | YHHWS2401 | Utilisé pour la culture du sol de concombre. |
| Amorce pour qPCR | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | Utilisé pour l’amplification de l’ADN dans la qPCR. |
| Instrument de PCR en temps réel | Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd. | 4484073 | Utilisé pour effectuer une qPCR sur le biofilm pellicaire sélectionné. |
| Roary | The Wellcome Trust SangerInstitute | N/A | Utilisé pour concevoir des amorces de qPCR |
| Shaker | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd | ZQTY-50S | Utilisé pour le mélange de solutions et la culture microbienne. |
| Silwet L-77 | Cytiva Bio-technology (Hangzhou) Co., Ltd. | SL77080596 | Utilisé pour préparer les supports TSB. |
| Peptone de soja | Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd | HB8275 | Utilisé pour préparer les milieux TSB. |
| Spectrophotomètre | Shanghai Yidian Analysis Instrument Co., Ltd. | 76713100010 | Utilisé pour la quantification du biofilm pelliculaire cristal violet. |
| Eau stérile | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | SW150302 | Utilisé pour laver le biofilm de la pellicule. |
| Gants en nitrile stérilisés | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. | 223016852LLZA | Utilisé pour les opérations expérimentales de base. |
| Modèle ADN | Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd. | N/A | Utilisé pour l’amplification de l’ADN dans la qPCR. |
| Thiamine | Bioolook Scientific Research | Special 2180020 | Utilisé pour préparer les milieux MSgg. |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Utilisé pour préparer les milieux TSB. |
| Tryptophane | Bioolook Scientific Research | Special 2190020 | Utilisé pour préparer les milieux MSgg. |
| TSB Medium | Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co., Ltd. | 024048 | Milieu bactérien à large spectre. |
| TSB-Msgg Meidium | Nanjing Agricultural University | N/A | Milieu mixte pour la culture de biofilms pelliculaires avec une applicabilité plus large. |
| ZnCl2 | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | C0310520123 | Utilisé pour préparer les milieux MSgg. |
Références
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Réimpressions et autorisations
