Method Article

Identification de lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans des poumons de souris avec un peptide : tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité

DOI:

10.3791/66939

⸱

July 19th, 2024

 ,  , 
1Center for Immunology and Inflammatory Diseases, Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology, Massachusetts General Hospital, 2Division of Immunology, Boston Children's Hospital, 3Harvard Medical School, 4Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Massachusetts General Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous fournissons un protocole détaillé pour isoler et identifier des populations rares de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les poumons de souris grâce à l’enrichissement des lymphocytes T à base de billes magnétiques et aux tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).

Abstract

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L’identification et la caractérisation des lymphocytes T spécifiques de l’antigène au cours de la santé et de la maladie restent essentielles pour améliorer notre compréhension de la physiopathologie immunitaire. Les défis techniques du suivi des populations de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans le répertoire des lymphocytes T endogènes ont été considérablement avancés par le développement de réactifs peptide :tétramère CMH. Ces multimères solubles marqués par fluorescence de molécules du CMH de classe I ou de classe II complexées à des épitopes peptidiques antigéniques se lient directement aux lymphocytes T avec la spécificité correspondante du récepteur des lymphocytes T (TCR) et peuvent donc identifier les populations de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans leur état natif sans qu’il soit nécessaire de disposer d’une réponse fonctionnelle induite par ex vivo stimulation. Pour les populations extrêmement rares, les lymphocytes T liés aux tétramères peuvent être enrichis magnétiquement pour augmenter la sensibilité et la fiabilité de la détection.

À mesure que l’étude de l’immunité des lymphocytes T résidents des tissus s’approfondit, il est urgent d’identifier les lymphocytes T spécifiques de l’antigène qui circulent vers les tissus non lymphoïdes et y résident. Dans ce protocole, nous présentons un ensemble détaillé d’instructions pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes T spécifiques de l’antigène présents dans les poumons de souris. Cela implique l’isolement des lymphocytes T à partir de tissus pulmonaires digérés, suivi d’une étape générale d’enrichissement magnétique des lymphocytes T et d’une coloration au tétramère pour l’analyse et le tri par cytométrie en flux. Les étapes mises en évidence dans ce protocole utilisent des techniques courantes et des réactifs facilement disponibles, ce qui le rend accessible à presque tous les chercheurs engagés dans l’immunologie des lymphocytes T de souris, et sont hautement adaptables pour une variété d’analyses en aval de toute population de lymphocytes T spécifiques à l’antigène à basse fréquence résidant dans les poumons.

Introduction

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Au cœur du système immunitaire adaptatif se trouve la capacité d’un lymphocyte T à reconnaître et à répondre à un antigène spécifique. Le moment et l’endroit où un lymphocyte T répond à son antigène apparenté déterminent l’équilibre entre l’infection et l’auto-immunité, l’homéostasie et le cancer, la santé et la maladie1. Il s’ensuit que l’étude des lymphocytes T dans un contexte spécifique d’immunité devrait se concentrer sur les cellules présentant une spécificité pour un antigène pertinent d’intérêt. Parmi les avancées technologiques qui ont considérablement amélioré la capacité à caractériser les populations de lymphocytes T spécifiques de l’antigène, on trouve des multimères solubles marqués par fluorescence (généralement des tétramères) de molécules de classe I ou de classe II de complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) complexées à des épitopes de peptides antigéniques, mieux connus sous le nom de « tétramères peptides :CMH »2,3,4,5 . En représentant les ligands naturels des récepteurs de l’antigène des lymphocytes T (TCR), les tétramères peptide :CMH de classe I et de classe II permettent d’identifier directement les lymphocytes T CD8+ et CD4+ spécifiques de l’antigène, respectivement, dans le répertoire endogène des lymphocytes T du système immunitaire sans qu’il soit nécessaire de répondre à la stimulation de l’antigène dans un essai. Les tétramères représentent une approche plus élégante de l’étude des lymphocytes T spécifiques de l’antigène que les modèles de transfert adoptif de lymphocytes T transgéniques TCR6, et ont été de plus en plus utilisés pour identifier les populations de lymphocytes T étrangers et auto-spécifiques de l’antigène dans des modèles murins expérimentaux et des maladies humaines 4,5.

Alors que les tétramères peuvent facilement identifier les populations à haute fréquence de lymphocytes T qui se sont développées en réponse à la stimulation de l’antigène, leur utilisation pour les lymphocytes T naïfs, spécifiques de l’antigène ou mémoire est limitée par les très faibles fréquences de ces populations7. Notre groupe et d’autres ont développé et popularisé des stratégies d’enrichissement magnétique basées sur les tétramères qui augmentent la sensibilité de la détection pour permettre l’étude de ces populations cellulaires dans les tissus lymphoïdes de souris 8,9,10,11.

L’émergence des lymphocytes T résidents dans les tissus sur le terrain a mis l’accent sur le développement de nouvelles façons d’étudier les lymphocytes T dans l’espace non lymphoïde. Comme de nombreuses autres surfaces muqueuses, les lymphocytes T des poumons rencontrent une gamme d’antigènes propres et étrangers dérivés de l’épithélium de l’hôte, des microbes commensales et infectieux et des entités environnementales, y compris les allergènes. L’analyse transcriptionnelle des lymphocytes T prélevés dans des tissus non lymphoïdes (NLT) démontre un phénotype de type mémoire qui porte un destin et une fonction spécifiques aux tissus uniques, souvent dirigés vers le trafic et l’homéostasie tissulaire12. De plus, les lymphocytes T mémoires (Trms) résidents des tissus ont tendance à être plus limités par le clonage que ceux en circulation13. Il est essentiel de déterminer comment et pourquoi les antigènes entraînent la résidence des lymphocytes T dans la NLT pour comprendre comment le système immunitaire protège contre les infections, maintient l’homéostasie tissulaire et, parfois, se transforme en auto-immunité. Cependant, il semble y avoir une plus grande attrition parmi les lymphocytes T résidents des tissus des poumons par rapport aux autres NLT14. En conséquence, la capacité d’identifier et de caractériser les lymphocytes T endogènes du poumon avec une spécificité antigénique donnée est limitée par leur rareté inhérente.

En combinant l’utilisation de techniques d’enrichissement cellulaire à base de billes magnétiques et la coloration peptide :CMH tétramère, nous avons réussi à détecter des cellules T spécifiques de l’antigène du soi élargies mais rares dans les poumons de souris15,16. Nous présentons ici une description détaillée d’un protocole que nous avons optimisé pour isoler et caractériser de manière fiable toute population rare de lymphocytes T spécifiques de l’antigène présente dans les poumons de souris (Figure 1). Ce protocole comprend une étape de coloration des anticorps in vivo pour distinguer les cellules T résidentes des cellules T vasculaires17, suivie de deux méthodes différentes de traitement des tissus pulmonaires pour tenir compte de la disponibilité des ressources. S’ensuit une étape générale d’enrichissement magnétique des lymphocytes T, une coloration au tétramère et une analyse par cytométrie en flux. La viabilité cellulaire et la coloration des tétramères sont encore améliorées dans ce protocole par l’ajout d’aminoguanidine, qui bloque l’apoptose18 induite par l’activation des lymphocytes T induite par l’oxyde nitrique synthase (iNOS) et le dasatinib qui limite la régulation négative du TCR19. Les étapes mises en évidence dans ce protocole utilisent des techniques courantes et des réactifs facilement disponibles, ce qui le rend accessible à presque tous les chercheurs engagés dans l’immunologie des lymphocytes T de souris et est hautement adaptable à une variété d’analyses en aval. Bien qu’il soit peu probable que les lymphocytes T naïfs soient trouvés dans les poumons, nous pensons que ce protocole sera particulièrement utile pour l’étude des lymphocytes T spécifiques de l’antigène auto-spécifique et des Trms dans les poumons.

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Figure 1 : Vue d’ensemble du flux de travail du protocole. Les poumons sont prélevés sur des souris et dissociés en cellules uniques. Les échantillons sont ensuite enrichis pour les lymphocytes T avant d’être colorés avec des tétramères peptide :CMH et des anticorps marqués par fluorescence pour l’analyse cytométrique en flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

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Les procédures décrites dans ce protocole sont approuvées et élaborées conformément aux lignes directrices établies par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Massachusetts General Hospital, un programme de gestion des animaux accrédité par l’American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Des expériences ont été réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 8 à 12 semaines sur un fond génétique C57BL/6 élevé et maintenu dans l’animalerie de l’HGM dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes.

1. Préparation des solutions mères

  1. Préparez le tampon HEPES en dissolvant 10 mM de HEPES, 5 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 150 mM de NaCl et 1 mM de MgCl2, et ajustez à pH 7,4.
  2. Préparez 10 fois la solution mère de Liberase en dissolvant 700 μg/mL de Liberase Thermolysin Medium (TM) (voir le tableau des matériaux) dans la solution saline équilibrée de Hank avec du Ca++ et du Mg++ (voir le tableau des matériaux).
  3. Préparez une solution mère d’aminoguanidine 10x en dissolvant 100 mM de sel d’hémisulfate d’aminoguanidine (voir le tableau des matériaux) dans la solution saline équilibrée de Hank avec du Ca++ et du Mg++ (voir le tableau des matériaux).
  4. Préparez un milieu complet d’acides aminés de jambon d’Eagle (EHAA) en mélangeant un milieu EHAA (voir le tableau des matériaux) avec 10 % de sérum de veau fœtal, 100 μ/mL de pénicilline/streptomycine, 50 μg/mL de gentamycine, 2 mM de L-glutamine et 55 μM de 2-mercaptoéthanol.
    REMARQUE : D’autres supports de cellules T courants, tels que RPMI ou DMEM, peuvent également être utilisés.
  5. Préparez le tampon du trieur en mélangeant 1 PBS avec 2 % de FBS et 0,05 % d’azoture de sodium.
  6. Préparez le bloc Fc en diluant l’anticorps CD16/32 anti-souris purifié (voir la table des matériaux) à 1:100 v/v dans le tampon du trieur.
  7. Préparez la solution de digestion de Liberase TM/DNase en ajoutant 100 μg/mL de Liberase TM et 50 μg/mL de DNase I (voir le tableau des matériaux) dans un milieu RPMI 1640 sans L-glutamine (voir le tableau des matériaux).
  8. Préparez un mélange de kétamine et de xylazine en ajoutant 10 mg/mL de kétamine (voir le tableau des matériaux) et 1 mg/mL de xylazine (voir le tableau des matériaux) dans une solution saline normale (0,9 % de NaCl) (voir le tableau des matériaux).

2. Génération d’une suspension unicellulaire à partir de tissu pulmonaire via un dissociateur tissulaire automatisé

  1. Pour chaque souris, préparez 4 ml de tampon HEPES glacé dans un tube de dissociation tissulaire spécialisé (voir le tableau des matériaux) et conservez-le sur de la glace.
  2. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 150 à 200 μL de mélange de kétamine et de xylazine. Injecter 1 à 3 μg d’anticorps anti-souris CD45 conjugué au fluorophore (voir le tableau des matériaux) dilué dans 100 μL de solution saline normale par voie intraveineuse dans chaque souris anesthésiée. Euthanasier la souris 3 minutes après l’administration de l’anticorps avec une injection intrapéritonéale de 500 à 600 μL de mélange de kétamine et de xylazine.
  3. Réséquez les poumons et placez-les dans leur tube de dissociation tissulaire respectif refroidi sur de la glace. Placez les tubes sur le dissociateur tissulaire automatisé (voir tableau des matériaux) et exécutez le premier programme (programme prédéfini) pour le tissu pulmonaire.
  4. Ajouter 500 μL de solution mère de Liberase et 500 μL de solution mère d’aminoguanidine dans chaque tube contenant le tissu pulmonaire dissocié. Incuber sur un mélangeur à nutation pendant 30 min à 37 °C.
  5. Remettez les tubes sur le dissociateur et lancez le deuxième programme (programme prédéfini) pour le tissu pulmonaire.
  6. Verser la suspension unicellulaire du tube de dissociation tissulaire à travers une crépine cellulaire de 100 μm (voir le tableau des matériaux) dans un tube conique de 50 mL. Rincez le tube de dissociation tissulaire avec 5 ml d’EHAA complet (ou tout milieu de cellule T équivalent) et passez-le à travers la passoire dans le tube de 50 ml.
  7. Retirer la crépine et augmenter le volume de la suspension cellulaire à 50 mL avec l’EHAA complet. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez soigneusement le surnageant, en laissant derrière lui environ 100 μL de surnageant et de pastilles cellulaires.
  8. Ajouter environ 100 μL de solution Fc Block pour porter le volume total à 200 μL et agiter vigoureusement pour remettre la pastille en suspension.

3. Protocole alternatif : Génération d’une suspension unicellulaire à partir de tissu pulmonaire par dissociation manuelle

  1. Pour chaque souris, préparez 1 mL d’EHAA complet dans un tube de microfuge de 1,5 mL et conservez-le sur de la glace.
  2. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale de 150 à 200 μL de mélange de kétamine et de xylazine. Injecter 1 à 3 μg d’anticorps anti-souris CD45 conjugué au fluorophore dilué dans 100 μL de solution saline normale par voie intraveineuse dans chaque souris anesthésiée. Euthanasier la souris 3 minutes après l’administration de l’anticorps avec une injection intrapéritonéale de 500 à 600 μL de mélange de kétamine et de xylazine.
  3. Réséquez les poumons et placez-les dans leur tube microfuge respectif de 1,5 mL refroidi sur de la glace.
  4. Une fois que tous les poumons ont été prélevés, transférez chaque poumon dans un tube de microfuge frais sans aucun milieu cellulaire.
  5. Coupez les poumons en petits fragments (morceaux de ~2-3 mm) à l’aide de ciseaux à l’intérieur du tube de microfuge.
  6. Ajouter 1 mL de cocktail de digestion Liberase TM/DNase I dans chaque tube.
  7. Incuber 30 min à 37 °C au bain-marie. Remettez les échantillons dans la glace par la suite pour éviter une digestion excessive.
  8. Verser l’échantillon sur une passoire à cellules de 100 μm placée sur un tube conique de 50 mL. Écrasez le tissu contre le grillage avec l’extrémité en caoutchouc du piston à partir d’une seringue stérile de 1 ml.
  9. Rincer la passoire avec un tampon de tri à froid, en recueillant un volume final de 7 mL dans le tube. Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez soigneusement le surnageant, en laissant environ 100 μL de surnageant et de pastille cellulaire.
  10. Ajouter 100 μL de solution Fc Block pour porter le volume total à 200 μL et agiter vigoureusement pour remettre la pastille en suspension.

4. Enrichissement de l’échantillon pulmonaire pour les lymphocytes T par enrichissement en billes magnétiques

  1. Ajouter 50 μL de microbilles CD90.2 anti-souris (voir le tableau des matériaux). Vortex et incuber pendant 10 min à 4 °C.
    REMARQUE : CD90.2 correspond à l’allèle exprimé par les lymphocytes T chez les souris C57BL/6. Vérifiez le génotype de l’allèle si d’autres souches de souris sont utilisées.
  2. Pendant ce temps, placez une colonne de séparation de cellules paramagnétique (voir Tableau des matériaux) sur un aimant de séparation de cellules à une ou quatre positions (voir Tableau des matériaux). Placez un tube conique ouvert de 15 mL sous chaque colonne pour capter le débit. Amorcez la colonne avec 3 ml de tampon de tri à froid, permettant à la colonne de s’écouler par gravité dans le tube conique situé en dessous.
  3. Une fois que les cellules ont incubé avec les microbilles pendant 10 min, ajoutez un tampon de tri à froid à un volume de 1 mL et transférez-les à travers une passoire cellulaire de 100 μm placée au sommet de la colonne. Recueillir le flux de la colonne dans un nouveau tube conique de 15 mL placé sous la colonne.
  4. Une fois que la suspension de la cellule s’est complètement écoulée à travers la colonne par gravité, lavez la colonne en rinçant le tube d’origine avec 3 ml supplémentaires de tampon de tri à froid et en l’appliquant sur la colonne à travers le grillage, rinçant ainsi la crépine. Retirez la passoire.
  5. Lorsque l’échantillon s’est de nouveau complètement écoulé dans la colonne et qu’aucun autre écoulement ne sort de la colonne, retirez la colonne de l’aimant et placez-la sur un tube conique neuf de 15 ml.
  6. Ajouter 5 mL de tampon de tri à froid dans la colonne.
  7. Éluez immédiatement les cellules liées à la colonne en poussant le piston de la colonne vers le haut en un mouvement continu et en forçant le tampon de tri hors du bas de la colonne dans le nouveau tube.
  8. Centrifuger les échantillons élués à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez soigneusement le surnageant, en laissant derrière lui environ 100 μL de surnageant et de pastilles cellulaires.
  9. Ajoutez 100 μL de tampon de tri à froid pour porter le volume total à 200 μL et agitez vigoureusement pour remettre la pastille en suspension.
  10. Analysez l’échantillon à flux continu contenant la fraction cellulaire non liée, si vous le souhaitez.

5. Coloration des lymphocytes T spécifiques de l’antigène avec des tétramères peptide :CMH

  1. Ajouter 1 μL de Dasatinib 10 μM (voir le Tableau des matières) à chaque échantillon, vortex et incuber pendant 5 min à RT.
  2. Ajouter un tétramère peptide :CMH conjugué PE ou APC à une concentration finale de 10 nM (ou une concentration optimisée empiriquement pour un tétramère donné).
  3. Vortex et incuber dans l’obscurité pendant 1 h à RT (ou temps et température optimisés empiriquement).

6. Analyse des lymphocytes T marqués au tétramère par cytométrie en flux

  1. Pendant que l’échantillon est coloré avec des tétramères peptide :CMH, préparez un mélange maître d’anticorps pour colorer les marqueurs de surface des cellules (tableau 1).
    REMARQUE : Évitez les fluorophores qui entrent en conflit avec l’anticorps CD45 administré par voie intraveineuse ou les tétramères.
  2. Avec 15 minutes restantes dans la période d’incubation pour la coloration au tétramère, ajoutez un mélange maître d’anticorps de surface à 1:100 (ou une concentration optimisée empiriquement) à chaque échantillon.
  3. Continuer à incuber dans l’obscurité à RT pour le reste de la période d’incubation de 1 h.
  4. Ajouter 50 000 billes de comptage par cytométrie en flux (voir le tableau des matériaux) et ajouter un tampon de tri à froid jusqu’à un volume final d’environ 5 ml. Centrifuger l’échantillon coloré à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer soigneusement le surnageant, en laissant derrière lui environ 100 μL de surnageant et de pastilles de cellules/billes.
  5. Remettez l’échantillon en suspension avec 200 μL supplémentaires de tampon de tri et transférez l’échantillon dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de 5 mL.
  6. Analysez l’échantillon sur un cytomètre en flux. Collectez autant de cellules que possible, jusqu’à un maximum de 2 500 000 événements au total. Assurez-vous qu’au moins 20 000 événements de cordon de comptage ont été collectés. Maintenez le taux d’acquisition à 5 000 événements par seconde ou moins.
  7. Enregistrez toutes les données sous forme de fichiers FCS.

  

FluorochromeAnticorps
BUV395CD90.2
Bleu PacifiqueCD45 (ajouté plus tôt par injection intraveineuse)
Orange du PacifiqueCD8
Violet brillant 785CD4
FITCCD3
PerCP-Cy5.5Vidage (B220, CD11b, CD11c, F4/80)
PETétramère pMHC ou marqueur phénotypique
PE-Cy7Marqueur phénotypique (par exemple CD44,-1, CD69, etc.)
APCTétramère pMHC ou marqueur phénotypique
AlexaFluor 700Marqueur phénotypique (par exemple CD44,-1, CD69, etc.)
APC-Cy7Taches vivantes/mortes

Tableau 1 : Matrice de coloration de l’échantillon. Un panel typique d’anticorps de cytométrie en flux conjugués aux fluorophores utilisés pour identifier et caractériser les lymphocytes T spécifiques de l’antigène.

7. Analyse des données

  1. Analyser les fichiers de données FCS à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux approprié.
    1. Mettre en place une séquence de portes d’inclusion successives pour identifier 1) les événements de type lymphocytaire, 2) uniques, 3) vivants, 4) extravasculaires, 5) négatifs et 6) CD90.2 positifs qui sont CD4 ou CD8 positifs (Figure 2).
    2. Identifier les lymphocytes T positifs aux tétramères au sein de ces populations.
  2. Déterminez le nombre absolu de cellules tétramères positives en calculant le rapport entre les billes ajoutées (50 000) et le nombre de billes collectées pendant l’échantillonnage et en multipliant la valeur par le nombre total de cellules tétramères positives collectées.
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Results

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La figure 2 illustre la stratégie de contrôle représentative utilisée dans l’identification des lymphocytes T CD4+ spécifiques de l’antigène rare dans les poumons avec des tétramères peptide :CMH de classe II. Le même processus peut être appliqué aux lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène avec des tétramères peptide :CMH de classe I (données non présentées).

En raison du nombre élevé de cellules non lymphoïdes dans les poumons, la détection fiable des lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène par le tétramère nécessite une certaine forme d’enrichissement préalable pour que les lymphocytes T d’intérêt améliorent le rapport signal/bruit. La figure 3 illustre l’efficacité de l’enrichissement magnétique par anticorps CD90.2 des lymphocytes T totaux du tissu pulmonaire que nous avons décrit dans ce protocole. En moyenne, nous récupérons plus de 99 % de tous les lymphocytes T CD90.2+ des poumons avec une pureté supérieure à 90 % grâce à ce processus d’enrichissement. La figure 4 illustre l’amélioration de la détection des lymphocytes T CD4+ rares positifs aux tétramères résultant de cet enrichissement par rapport à l’absence d’enrichissement ou à une stratégie d’enrichissement cellulaire directe à base de tétramères.

La figure 5 illustre l’amélioration du marquage par tétramère des lymphocytes T spécifiques de l’antigène traités par le dasatinib, en particulier dans les populations rares.

figure-results-1
Figure 2 : Stratégie de déclenchement pour l’analyse par cytométrie en flux. Portes d’inclusion et d’exclusion séquentielles utilisées pour identifier les lymphocytes T CD4+ spécifiques de l’antigène auto-spécifique qui s’accumulent dans les poumons à la suite d’une lésion tissulaire aiguë. Les billes de comptage peuvent être identifiées directement en fonction de leur fluorescence le long du canal FITC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Enrichissement magnétique à base d’anticorps CD90.2 des lymphocytes T totaux dans les poumons. Des graphiques représentatifs de cytométrie en flux sont présentés pour les fractions non liées (à gauche) et liées (à droite) d’un échantillon pulmonaire après enrichissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Comparaison des stratégies d’enrichissement cellulaire pour aider à la détection des lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans les poumons. Trois souris exprimant un antigène self modèle dans l’épithélium pulmonaire ont été immunisées par voie sous-cutanée avec un épitope peptidique de l’antigène self émulsionné dans l’adjuvant de Freund complet (CFA). Après 7 jours, les poumons de souris ont été prélevés, combinés et divisés en trois échantillons égaux pour la coloration au tétramère après l’absence d’enrichissement cellulaire (à gauche), l’enrichissement cellulaire à base d’anticorps CD90.2 (au centre) ou l’enrichissement cellulaire à base de tétramère (à droite). Les échantillons ont été analysés par cytométrie en flux pour un maximum de 1 500 000 événements au total (événements CD4+ activés). Le nombre d’événements positifs pour les tétramères est indiqué en noir, tandis que le nombre total calculé de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les échantillons pulmonaires est indiqué en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Le traitement au dasatinib améliore la coloration des tétramères. Des souris de type sauvage (à gauche) ou des souris exprimant un auto-antigène modèle dans l’épithélium pulmonaire (à droite) ont été immunisées par voie sous-cutanée avec un épitope peptidique de l’auto-antigène émulsionné dans le CFA. Les rates et les organes lymphoïdes des souris ont été prélevés, combinés et divisés en deux échantillons égaux pour le marquage avec des tétramères peptide :CMH de classe II avec ou sans prétraitement au dasatinib. Des histogrammes de coloration au tétramère sont superposés, comparant les échantillons traités avec (rouge) et sans dasatinib (bleu). L’intensité médiane de fluorescence de chaque échantillon est indiquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les caractérisations antérieures des lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les poumons ont bénéficié du nombre robuste de lymphocytes T spécifiques de l’antigène qui se développent à la suite d’un événement d’amorçage aigu tel qu’une immunisation intranasale ou une infection 20,21,22. Cependant, les populations de lymphocytes T plus rares dans les poumons, telles que les lymphocytes T spécifiques de l’antigène lui-même ou les lymphocytes T mémoires résidant dans les tissus, sont difficiles à détecter sans une certaine forme d’enrichissement de l’échantillon pour les lymphocytes T d’intérêt 15,16,23. Nous avons atteint cet objectif en combinant des techniques de dissociation du tissu pulmonaire décrites précédemment pour produire un pourcentage élevé de lymphocytes viables24,25 avec une stratégie visant à distinguer les cellules T intravasculaires des cellules T parenchymateuses et un processus général d’enrichissement basé sur les cellules T suivi d’une coloration des tétramères17. En utilisant ce protocole, nous avons démontré la capacité d’identifier et de caractériser des lymphocytes T rares qui sont spécifiques contre les antigènes du soi dans le poumon qui se forment en réponse à l’immunisation directe avec un peptide exogène ou à l’activation indirecte de la libération d’antigènes lors de lésions tissulaires15,16. Plusieurs considérations ont été prises en compte dans l’élaboration de ce protocole.

Nous avons décrit deux protocoles différents de traitement des tissus pulmonaires qui ont bien fonctionné. L’un implique l’utilisation d’un instrument automatisé de dissociation tissulaire, tandis que l’autre repose sur un processus manuel. Il est important de noter que les deux méthodes utilisent Liberase TM, un mélange de collagénases I et II qui contient également une thermolysine métalloprotéase. Il a été démontré que ce mélange d’enzymes augmente l’activité digestive par rapport à un seul cocktail de collagénase et qu’il fonctionne bien avec la récupération des leucocytes du tissu pulmonaire26.

Le protocole automatisé de dissociation des tissus nécessite un coût initial important pour la machine et des tubes de dissociation des tissus spécialisés, mais les tubes peuvent être lavés et réutilisés avec des passoires cellulaires, qui sont également généralement réutilisables. Le protocole de dissociation manuelle n’entraîne pas le coût initial d’un équipement spécialisé, mais il demande beaucoup de main-d’œuvre et prolonge la récolte car chaque échantillon est haché individuellement. Il existe d’autres différences entre les protocoles concernant l’utilisation de l’aminoguanidine ou de la DNase I pour limiter la mort cellulaire et l’agglutination cellulaire, mais nous n’avons pas soigneusement comparé l’impact de ces additifs. La décision d’utiliser l’un ou l’autre protocole devrait dépendre de l’expérience personnelle dans le type d’étude réalisée ainsi que de la disponibilité d’un instrument automatisé de dissociation des tissus, ce qui représenterait le facteur de coût le plus important. En effet, les éléments des deux protocoles peuvent être mélangés et assortis pour fournir les meilleures performances aux besoins spécifiques de l’étude.

Le protocole mentionné ci-dessus exclut notamment l’utilisation d’un gradient de densité pour isoler les lymphocytes de la suspension unicellulaire préparée à partir de la dissociation tissulaire. Nous avons constaté que l’étape d’enrichissement des lymphocytes T magnétiques nécessaire à l’identification des lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène permet d’éviter cette étape. Cependant, dans les cas où les fréquences des lymphocytes T spécifiques de l’antigène sont suffisamment élevées pour éliminer complètement la nécessité d’une étape d’enrichissement des lymphocytes T, un gradient de densité est recommandé car il fournira une quantité substantielle d’enrichissement des cellules cibles en éliminant un grand nombre de cellules non lymphoïdes. De plus, si les préparations de cellules uniques pulmonaires sont particulièrement volumineuses et/ou salissantes, une étape de gradient de densité peut être utilisée avant l’enrichissement magnétique pour éliminer les débris cellulaires excessifs qui pourraient plus tard obstruer les colonnes (étapes 4.4-4.7).

Nous avons opté pour un enrichissement général de tous les lymphocytes T basé sur le marqueur de lymphocytes T pan-CD90 (CD90.2 pour l’allèle exprimé chez les souris C57BL/6) au lieu d’une stratégie d’enrichissement cellulaire plus directe basée sur les tétramères. Cela offre plusieurs avantages. (1) L’enrichissement à base de CD90 entraîne un nombre plus élevé d’événements spécifiques de l’antigène détectés par cytométrie en flux que les échantillons d’enrichissement non enrichis ou à base de tétramères (Figure 4). Cela contribue à de meilleures estimations des fréquences rares des lymphocytes T spécifiques de l’antigène sans qu’il soit nécessaire de collecter un nombre excessif d’événements totaux (2 500 000 >), ce qui prolonge les temps de collecte des échantillons et détériore la résolution signal/bruit. (2) Contrairement à l’enrichissement à base de tétramères, l’enrichissement à base de CD90 permet d’évaluer l’ensemble du compartiment des lymphocytes T du poumon, y compris les lymphocytes T CD4+ et CD8+ , les lymphocytes T intravasculaires par rapport aux lymphocytes extravasculaires et les lymphocytes T spécifiques de l’antigène par rapport aux antigènes non spécifiques, le tout dans un seul échantillon (Figure 2). (3) Étant donné que l’étape d’enrichissement basée sur le CD90 se produit avant la coloration des tétramères, elle minimise le temps avant que les cellules marquées au tétramère ne soient analysées sur le cytomètre en flux, limitant ainsi la perte potentielle de signal due au détachement du tétramère.

Le processus d’enrichissement des lymphocytes T dans ce protocole est basé sur la sélection positive avec des billes magnétiques CD90.2, mais des résultats similaires peuvent être obtenus avec des stratégies de sélection négative fournies par des kits d’isolement de lymphocytes CD4, CD8 ou pan-T. Nous décrivons l’utilisation d’une marque spécifique de microbilles, de colonnes et d’aimants, mais d’autres systèmes d’enrichissement magnétique devraient également fonctionner. Encore une fois, les décisions doivent être fondées sur le rendement de l’étude spécifique réalisée ainsi que sur les coûts globaux, qui peuvent être substantiels. D’après notre expérience avec les protocoles d’enrichissement, il existe un compromis général entre le rendement et la pureté des cellules cibles, et dans le but de détecter un nombre extrêmement limité de cellules T spécifiques de l’antigène, le rendement prime.

Bien que les résultats représentatifs décrivent des expériences impliquant des lymphocytes T CD4+ et des tétramères peptide :CMH de classe II, ce protocole est tout aussi efficace pour les lymphocytes T CD8+ et les tétramères peptide :CMH de classe I. Dans de tels cas, il convient de tenir compte des conditions potentiellement différentes requises par la coloration des tétramères de classe I (concentration, temps, température). De plus, nous ne voyons aucune raison d’empêcher son utilisation pour des études sur les lymphocytes B spécifiques de l’antigène avec des réactifs d’antigène de lymphocytes B appropriés marqués au fluorochrome27.

Enfin, le protocole décrit ici comprend l’ajout de l’inhibiteur de la protéine kinase Dasatinib à l’échantillon avant la coloration au tétramère. Le dasatinib bloque la signalisation et l’internalisation du TCR, ce qui améliore le marquage des tétramères des lymphocytes T tout en réduisant potentiellement la mort des lymphocytes T induite par les tétramères19. Nous avons constaté que le bénéfice du traitement par le dasatinib était le plus important dans la détection de la population plus rare spécifique de l’auto-antigène. Cela est probablement dû au fait que les lymphocytes T spécifiques de l’antigène auto-spécifique expriment une TCR d’affinité plus faible en raison des effets de la sélection négative pendant la tolérance centrale 28,29,30,31.

Le protocole utilisé ici a été combiné avec succès avec des protocoles de coloration intracellulaire pour analyser l’expression des facteurs de transcription et des cytokines dans les lymphocytes T spécifiques de l’antigène résident dans les poumons. Nous avons également réussi à trier ces populations rares pour des analyses en aval, y compris la transcriptomique unicellulaire et le séquençage TCR. L’utilisation et le développement continus de ce protocole devraient grandement bénéficier aux études sur l’immunité adaptative dans la physiopathologie pulmonaire.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions L. Kuhn pour son assistance technique pour le traitement des tissus et la production de tétramères. Ce travail a été financé par les National Institutes of Health (R01 AI107020 et P01 AI165072 à J.J.M., T32 AI007512 à D.S.S.), le Massachusetts Consortium on Pathogen Readiness (J.J.M) et le Massachusetts General Hospital Executive Committee on Research (J.J.M.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Crépine à cellules de 100 mmFisher Scientific22-363-549
10x PBS sans Ca++ ou Mg++Corning46-013-CM
1x PBS sans Ca++ ou Mg++Corning21-031-CV
AccuCheck Counting BeadsInvitrogenPCB100
Sel d’hémisulfate d’aminoguanidineSigma-AldrichA7009
CD90.2 microbilles, sourisMiltenyi130-121-278
Aimant de séparation cellulaire (séparateur MidiMACS)Miltenyi130-042-302Peut contenir une seule colonne LS
Aimant de séparation cellulaire (séparateur QuadroMACS)Miltenyi130-090-976Peut contenir 4 colonnes LS
DasatinibSigma-AldrichCDS023389
DNase IRoche10104159001
Eagle' s Ham' s Acides aminés moyensSigma-AldrichC5572
douxMACSMiltenyi130-093-235Dissociateur tissulaire automatisé
douxMACS C TubesMiltenyi130-093-237Tubes dissociateurs tissulaires automatisés
saline équilibrée de Hank’s avec Ca++ ou Mg++Corning21-020-CM
HEPESGibco15630080
KétamineVedcoNDC 50989-996-06
Liberase TMRoche5401119001
Pacific Blue anticorps anti-souris CD45 (Clone : 30-F11)Biolegend103126
Colonnes de séparation cellulaire paramagnétiques (LS Columns)Miltenyi130-042-401Livré avec piston
Purifié anti souris Anticorps CD16/32 (Clone : 93)Biolegend101302
RPMI 1640 milieu sans L-glutamineCorning15-040-CM
Chlorure de sodium 0,9 % (solution saline normale)CytivaZ1376
XylazinePivetalNDC 466066-750-02
Solution

References

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