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Article de méthode

Préparation de suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux

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DOI :

10.3791/66945

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26 juillet 2024

 ,  ,  ,  , 
1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons des protocoles pour la préparation de la suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et la coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux.

Résumé

Les cellules épithéliales thymiques (TEC) jouent un rôle essentiel dans la promotion du développement et de la sélection du répertoire des cellules T. Les TECs corticaux (cTEC) dans le cortex thymique induisent le développement précoce des lymphocytes T et la sélection positive des thymocytes corticaux. En revanche, les TECs médullaires (mTEC) dans la moelle thymique attirent des thymocytes sélectionnés positivement du cortex et établissent une auto-tolérance dans les lymphocytes T. Une variété de molécules, y compris DLL4 et beta5t exprimées dans les cTEC, ainsi qu’Aire et CCL21 exprimées dans les mTEC, contribuent à la fonction du thymus soutenant le développement et la sélection des lymphocytes T. L’analyse cytométrique en flux de molécules fonctionnellement pertinentes dans les cTEC et les mTEC est utile pour améliorer notre compréhension de la biologie des TEC, même si les méthodes actuelles de préparation de suspensions unicellulaires de TEC ne peuvent récupérer qu’une petite fraction des TEC (environ 1 % pour les cTEC et environ 10 % pour les mTEC) du thymus de souris jeunes adultes. Étant donné que bon nombre de ces molécules fonctionnellement pertinentes dans les TEC sont localisées dans les cellules, nous décrivons nos protocoles pour la préparation de la suspension unicellulaire de TEC de souris et la coloration des molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux.

Introduction

Le thymus est un organe mésenchymateux épithélial qui favorise le développement et la sélection du répertoire des lymphocytes T. Dans les microenvironnements corticaux et médullaires du thymus, les cellules épithéliales thymiques (TEC) jouent un rôle crucial dans la direction du développement et de la sélection des lymphocytes T. Il est bien admis que les TEC corticaux (cTEC) dans le cortex thymique contribuent principalement à l’induction du développement précoce des lymphocytes T et à la sélection positive des thymocytes exprimant l’antigène des lymphocytes T (TCR) nouvellement générés. En revanche, les TEC médullaires (mTEC) dans la moelle thymique sont essentielles à l’attraction des thymocytes sélectionnés positivement du cortex et à l’établissement de l’auto-tolérance centrale en éliminant les lymphocytes T auto-réactifs et en générant des lymphocytes T régulateurs1,2. Ces fonctions des TECs dans le soutien du développement et de la sélection des lymphocytes T sont médiées par une variété de molécules exprimées dans les cTECs et les mTEC.

Il s’agit notamment du ligand 4 de type Delta (DLL4), important pour la spécification de la lignée des lymphocytes T)3,4, beta5t (également connu sous le nom de Psmb11, important pour la sélection positive des lymphocytes T CD8)5,6, et Prss16 (également connu sous le nom de protéase à sérine spécifique du thymus, ou TSSP, important pour la sélection positive des lymphocytes T CD4)7,8 exprimé dans les cTEC, et Régulateur auto-immun (Aire, important pour l’expression de la promiscuité des gènes du soi)9,10, Fez famille du doigt de zinc 2 (Fezf2, important pour l’expression de la promiscuité des gènes du soi indépendant d’Aire et la génération des cellules de la touffe thymique)11,12,13,14, et le ligand de chimiokine 21 du motif C-C (CCL21, important pour la migration médullaire et l’accumulation de thymocytes sélectionnés positivement)14,15,16 exprimés en mTEC. La cytométrie en flux fournit un moyen de détecter quantitativement ces molécules fonctionnellement significatives dans les TEC, facilitant ainsi l’évaluation du développement et de la fonction des cTEC et des mTEC. Étant donné que de nombreuses molécules des CET sont principalement exprimées dans les cellules, comme dans le cytoplasme (par exemple, le composant du protéasome bêta5t) et le noyau (par exemple, le régulateur transcriptionnel Aire), il est avantageux d’analyser quantitativement les molécules intracellulaires dans les cTEC et les mTEC à l’aide de la cytométrie en flux.

TEC sont rares dans le thymus. Une souris femelle âgée de 5 semaines a environ 1 × 10 6 cTECs et environ 2,5 × 106 mTEC, tandis que le cortex thymique contient environ 3 ×10 8 thymocytes CD4+CD8+ et que la moelle thymique contient environ 5 × 107 thymocytes CD4+CD8- et CD4-CD8+17. Par conséquent, la grande majorité (>99 %) des cellules du thymus sont des cellules hématopoïétiques, y compris les thymocytes, plutôt que les TEC, chez les jeunes souris adultes. De plus, les TEC sont étroitement associés aux cellules voisines (par exemple, les thymocytes) et aux composants extracellulaires architecturaux (par exemple, le collagène) dans le thymus, de sorte que la libération des TEC en suspension cellulaire nécessite la digestion de la protéase du thymus. Les méthodes conventionnelles de digestion enzymatique ne produisent qu’une petite fraction des TEC ; environ 1 % (1 × 104) et 10 % (2 × 105) pour les cTEC et les mTEC, respectivement, chez des souris de 5 semaines thymus17,18,19. La faible efficacité de la libération des TEC par le thymus est probablement due à la sensibilité des TEC aux enzymes protéolytiques et au stress mécanique et à l’association étroite des TEC avec les cellules voisines, en particulier entre les CET et les thymocytes CD4+CD8+20. À cet égard, les résultats de l’analyse unicellulaire des TEC de souris, y compris l’analyse cytométrique en flux et l’analyse de séquençage de l’ARN sur cellule unique, basée sur les méthodes actuelles de préparation cellulaire médiée par la digestion enzymatique, ne sont représentatifs que d’une petite partie des TEC et sont donc loin d’être exhaustifs. Néanmoins, malgré ces limitations dans la récupération enzymatique des TEC, l’analyse par cytométrie en flux des TEC de souris en suspension unicellulaire reste utile pour l’analyse quantitative de molécules fonctionnellement pertinentes dans les cTEC et les mTEC. Dans la suspension cellulaire, les TEC ont été définies comme des cellules positives pour la molécule de surface épithéliale EpCAM (CD326) et négatives pour la molécule de surface hématopoïétique CD45. Dans les TEC EpCAM+CD45-, les niveaux d’expression à la surface cellulaire des molécules Ly51 (également connues sous le nom de BP-1 et CD249) et la capacité de liaison de l’agglutinine I d’Ulex Europaeus (UEA1) (principalement la liaison aux glycoprotéines et aux glycolipides contenant du fucose lié à l’α) ont été utilisés pour marquer phénotypiquement les cTEC (Ly51élevé, UEA1faible) et les mTECs (Ly51,faible, UEA1,élevé, élevé,). Nous décrivons ici nos protocoles expérimentaux pour la préparation conventionnelle de suspension unicellulaire de TEC de souris et la coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux, en nous concentrant sur l’analyse quantitative des molécules intracellulaires beta5t, CCL21 et Aire dans des TEC de souris fraîchement préparés.

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Protocole

Toutes les expériences sur des souris ont été réalisées avec l’approbation du Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut national du cancer (ASP21-431, ASP21-432 et EIB-076-3).

1. Préparation de la suspension de cellules de thymus

NOTE : L’ontogenèse de la souris affecte l’efficacité de la libération enzymatique des TEC du thymus. Trois méthodes en fonction de l’âge de la souris sont décrites ci-dessous.

  1. Pour les souris postnatales de plus de 3 semaines
    1. Récoltez le thymus (deux lobes du thymus) d’une souris. Placez le thymus dans 5 mL de RPMI1640 contenant 10 mM d’HEPES dans un plat en plastique de 60 mm sur de la glace.
    2. Retirez le sang, les tissus non thymiques et la graisse à l’aide d’une pince à épiler incurvée à pointe fine sous un microscope à dissection. Coupez le thymus en petits morceaux (d’environ 1 à 2 mm) avec des ciseaux à disséquer.
    3. Transvaser les morceaux de thymus dans un tube conique de 15 mL contenant 3 mL de collagénase/dispase à 1 mg/mL et 1 solution U/mL de DNase dans RPMI1640 contenant 2 % de sérum de veau fœtal (FBS). Incuber dans un bain-marie ou un bloc chauffant à 37 °C pendant 20 min.
    4. Mélanger délicatement à l’aide d’une pipette de transfert en plastique de 3 ml. Incuber encore 20 minutes au cas où les fragments de tissu seraient encore visibles.
    5. Mélanger délicatement à l’aide d’une pipette de transfert en plastique de 3 ml. Incuber encore 10 minutes au cas où les fragments de tissu seraient encore visibles.
    6. Mélanger délicatement à l’aide d’une pipette de transfert en plastique de 3 ml. Ajouter 5 mL de 5 mM d’EDTA dans 1x HBSS contenant 1 % FBS.
    7. Filtrez la suspension cellulaire à travers une maille en nylon de 60 μm et dans un nouveau tube conique de 50 ml. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 × g à 4 °C pendant 5 min.
    8. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de tampon FACS (1x HBSS contenant 1 % d’albumine sérique bovine [BSA] et 0,1 % de NaN3).
    9. Rangez les cellules sur de la glace et déterminez les numéros de cellule à l’aide d’un compteur de cellules.
  2. Pour les souris néonatales âgées de 1 à 2 semaines
    1. Effectuez l’étape 1.1.1.
    2. Prélever le sang et les tissus non thymiques à l’aide d’une pince à épiler à dissection sous un microscope à dissection. Transférez le thymus dans un tube en plastique de 1,5 ml contenant 200 μL de RPMI1640 avec 10 mM de HEPES et coupez le thymus en petits morceaux (d’environ 1 à 2 mm) avec des ciseaux à dissectionner.
    3. Laissez les fragments de thymus se déposer au fond du tube, puis retirez délicatement la suspension à l’aide d’une micropipette de 200 μL.
    4. Transvaser les morceaux de thymus dans un tube à fond rond en polypropylène de 5 mL contenant 2 mL de collagénase/dispase à 0,5 mg/mL et 1 solution U/mL de DNase dans RPMI1640 contenant 2 % de FBS. Incuber au bain-marie ou dans un bloc chauffant à 37 °C pendant 10 min.
    5. Mélanger délicatement à l’aide d’une pipette de transfert en plastique de 3 ml, puis à l’aide d’une micropipette de 1 ml munie d’un embout en plastique pour une homogénéisation supplémentaire.
    6. Ajouter 2 mL de 5 mM d’EDTA dans 1x HBSS contenant 1 % de FBS. Filtrez la suspension cellulaire à travers une maille en nylon de 60 μm et dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 16 mL de RPMI1640 contenant 10 mM d’HEPES.
    7. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 × g à 4 °C pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de tampon FACS.
    8. Rangez les cellules sur de la glace et déterminez les numéros de cellule à l’aide d’un compteur de cellules.
  3. Pour les souris embryonnaires et les souris néonatales jusqu’à l’âge de 1 semaine
    1. Récoltez le thymus (deux lobes du thymus) d’une souris. Placez le thymus dans un plat en plastique de 60 mm et retirez le sang, les tissus autres que le thymus et la graisse à l’aide d’une pince à épiler incurvée à pointe fine sous un microscope de dissection.
    2. Placez le thymus dans 0,2 mL de RPMI1640 contenant 10 mM d’HEPES dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Jetez le liquide à l’aide d’une micropipette de 200 μL.
    3. Ajouter 0,5 mL de collagénase/dispase à 0,5 mg/mL et 1 solution U/mL de DNase dans RPMI1640 contenant 2 % de FBS. Incuber au bain-marie ou dans un bloc chauffant à 37 °C pendant 10 min. Mélanger délicatement à l’aide d’une micropipette de 1 mL munie d’un embout en plastique.
    4. Ajouter 0,5 mL de 5 mM d’EDTA dans 1x HBSS contenant 1 % FBS. Filtrez la suspension cellulaire à travers un treillis en nylon de 60 μm et dans un nouveau tube conique de 15 ml. Ajouter 9 mL de RPMI1640 contenant 10 mM d’HEPES.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 × g à 4 °C pendant 5 min. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 à 3 mL de tampon FACS.
    6. Rangez les cellules sur de la glace et déterminez les numéros de cellule à l’aide d’un compteur de cellules.
  4. Méthode alternative : Méthanisation Liberase
    1. Effectuez les étapes 1.1.1 et 1.1.2.
    2. Laissez les fragments de thymus se déposer au fond du tube, puis retirez délicatement la suspension à l’aide d’une micropipette de 200 μL. Transvasez les morceaux de thymus dans un tube de 5 mL contenant 1 mL de Liberase à 0,5 U/mL et 1 U/mL de DNase dans RPMI1640 contenant 10 mM d’HEPES. Incuber au bain-marie ou dans un bloc chauffant à 37 °C pendant 15 min.
    3. Mélanger délicatement à l’aide d’une micropipette de 1 mL munie d’un embout en plastique. Incuber encore 15 minutes au cas où les fragments de tissu seraient encore visibles.
    4. Mélanger délicatement à l’aide d’une micropipette de 1 mL munie d’un embout en plastique. Ajouter 1 mL de 5 mM d’EDTA dans 1 HBSS contenant 1 % de FBS.
    5. Filtrez la suspension cellulaire à travers une maille en nylon de 60 μm et dans un nouveau tube conique de 50 ml. Ajouter 18 mL de RPMI1640 contenant 10 mM de HEPES.
    6. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 × g, 4 °C pendant 5 min. Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de tampon FACS (1x HBSS contenant 1 % de BSA et 0,1 % de NaN3).
    7. Rangez les cellules sur de la glace et déterminez les numéros de cellule à l’aide d’un compteur de cellules.

2. Coloration des cellules du thymus par anticorps

  1. Placez 16 × 106 cellules dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml. Centrifuger les cellules à 350 × g à 4 °C pendant 5 min. Jetez le surnageant.
  2. Ajouter 10 μL de concentration de travail d’anticorps monoclonaux anti-récepteur Fc (mAb, clone 2.4G2) dans le tampon FACS pour bloquer la liaison non spécifique des IgG de coloration au récepteur Fc à la surface cellulaire. Incuber à 4 °C pendant 5 min.
  3. Ajouter 40 μL de chacune des concentrations de travail d’anticorps monoclonaux anti-CD45 (spécifiques aux cellules hématopoïétiques ; p. ex., marqués au BV421), d’anticorps monoclonaux anti-EpCAM (spécifiques aux cellules épithéliales ; p. ex., marqués au PE-Cy7), d’anticorps monoclonaux anti-Ly51 (détectant le cTEC ; p. ex., marqués à l’AF647) et d’agglutinine I d’Ulex europaeus I (UEA-1) (détectant le mTEC ; p. ex., marqués à l’AF594) dans le tampon FACS. En parallèle, préparer des tubes pour les cellules colorées unicolores et les cellules non colorées pour la mise en place d’un cytomètre en flux.
  4. Incuber à 4 °C pendant 45 min. Bien mélanger toutes les 10 min. Ajouter 2 mL de tampon FACS.
  5. Cellules de centrifugation 350 × g à 4 °C pendant 5 min. Jeter le surnageant.
  6. Ajouter 1 μL de colorant fantôme Violet 510 (pour distinguer les cellules viables des cellules mortes dans l’analyse cytométrique en flux des cellules fixes et perméabilisées). Utilisez un réactif de colorant fantôme non dilué ; Bien mélanger. Incuber à 4 °C pendant 30 min ; Bien mélanger toutes les 10 min.
  7. Ajouter 2 ml de tampon FACS. Cellules de centrifugation 350 × g à 4 °C pendant 5 min. Jetez le surnageant.
  8. Fixez les cellules en ajoutant 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % dans du PBS et en incubant à température ambiante pendant 10 min.
  9. Ajouter 3,5 mL de PBS dans le tube et centrifuger les cellules 700 × g à 4 °C pendant 8 min. Jeter le surnageant.
  10. Perméabiliser les cellules en ajoutant 1 mL de tampon de fixation/perméabilisation intracellulaire et en incubant à 4 °C pendant 20 min.
  11. Centrifuger les cellules à 700 × g à 4 °C pendant 8 min. Jeter le surnageant.
  12. Ajouter 1 mL de 1 tampon de perméabilisation. Centrifuger les cellules à 700 × g à 4 °C pendant 8 min. Jetez le surnageant.
  13. Ajouter 100 μL de concentrations de travail d’anticorps anti-bêta5t ou d’anticorps anti-CCL21, ou 40 μL de concentrations de travail d’anticorps anti-Aire (p. ex., marqué AF488), dans 1 tampon de perméabilisation, bien mélanger et incuber pendant 60 minutes à température ambiante.
  14. Ajouter 1 mL de 1 tampon de perméabilisation. Centrifuger les cellules à 700 × g à 4 °C pendant 8 min. Jetez le surnageant.
  15. Répétez l’étape 2.14.
  16. Ajouter 100 μL de concentrations de travail d’IgG anti-lapin (p. ex., marquées AF555) et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
  17. Ajouter 1 mL de 1 tampon de perméabilisation. Centrifuger les cellules à 700 × g à 4 °C pendant 8 min. Jetez le surnageant.
  18. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS et mélangez bien.
  19. Conservez les cellules dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’analyse cytométrique en flux.
  20. Filtrez les cellules à travers un treillis en nylon de 60 μm avant l’analyse cytométrique en flux.

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Résultats

L'analyse nécessite un cytomètre en flux permettant la détection d'au moins six canaux de fluorescence (pour CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye et beta5t, CCL21 et/ou Aire) ainsi que les paramètres de diffusion avant et latérale. Des profils cytométriques représentatifs de cellules thymiques digérées par collagénase/dispase provenant de souris âgées de 0 jour et de 2 semaines sont présentés respectivement dans la Figure 1 et la Figure 2. Dans les deux figures, l...

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Discussion

La collagénase, avec ou sans dispase, est largement utilisée pour digérer le thymus de souris afin de préparer les TECs 4,5,9,18,21. La libérase, qui contient un mélange de protéases, dont la collagénase, est également utilisée pour digérer le thymus afin de préparer les TECs17,22. L’utilisation de la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions le Dr Izumi Ohigashi d’avoir lu le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros ZIA BC 011806 des National Institutes of Health, le National Cancer Institute et le Center for Cancer Research.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagénase/Dispase  ;Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SeteBioscience00-5523-00
Ghost Dye Violet 510  ;Tonbo13-0870-T500
BV421 anticorps monoclonal anti-souris CD45, Clone 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 anticorps monoclonal anti-souris Ly51, Clone 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 Anticorps monoclonal anti-souris EpCAM/CD326, Clone G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)Vecteur LaboratoiresDL-1067-1
Alexa Fluor 488 anticorps monoclonal anti-souris Aire, Clone 5H12eBioscience53-5934-82
Anticorps monoclonal anti-souris Psmb11/beta5t lapin, Clone CPTC-PSMB11(souris)-1NIH NCICPTC-PSMB11(souris)-1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
Anticorps polyclonal anti-souris CCL21/exodus 2 lapinBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anti-lapin IgG lourd chèvre recombinantanticorps InvitrogenA27039
Anti-souris CD32/CD16 &ndash ; Purifié (Fc Block Anticorps)Leinco TechnologiesC247
Nylon Mesh 60 MicronComponent SupplyW31436
Équipement
ThermomixeurEppendorfHeat block
Cellometer Auto 2000 Compteur de viabilité cellulaireNexcelomComptage de cellules viables
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesCytomètre en fluxCinq lasers (355, 408, 488, 595 et 637 nm)
Logiciel FACSDiva version 9.0.1BD BiosciencesAnalyse
FlowJo 10.9.0BD Biosciencesdonnées par cytométrie en flux
des anticorps(concentration de travail)Tampon
Anti-souris CD32/CD16 &ndash ; Purifié (anticorps Fc Block)Tampon FACS:40
monoclonal anti-souris CD45 Anticorps monoclonal1:25Tampon
PE/Cy7 anti-souris EpCAM/CD326 Tampon FACS1:100Tampon
Alexa Fluor 647 anti-souris Anticorps monoclonal Ly51 Tampon1:100DyLight
594 Ulex Europaeus Agglutinine I (UEA1)1:400Tampon FACS Anticorps
polyclonal anti-souris CCL21/exodus 2 lapin1:200perméabilisation
Anticorps monoclonal de lapin anti-souris Psmb11/beta5t, Clone CPTC-PSMB11(souris)-11:1000perméabilisation
Alexa Fluor 555 Anticorps recombinant IgG de chèvre à chaîne lourde1:4001x Tampon
Objectif
RPMI1640 contenant 10 mM d’HEPES  ;Pour la préparation
RPMI1640 contenant 2 % de FBSPour la préparation
Tampon FACS (1x HBSS contenant 1 % de BSA  ; et azoture de sodium à 0,1 %)Pour la préparation cellulaire et la coloration des
1 mg/ml de collagénase/dispase et solution de DNase 1U/ml dans RPMI1640 contenant 2 % de FBSPour la digestion
2 % de PFA dans le PBSPour la fixation
Tampon de fixation/perméabilisation (1 partie de concentré de fixation/perméabilisation avec 3 parties de diluant de fixation/perméabilisation)Pour la fixation cellulaire
1x tampon de perméabilisation (1 partie de concentré 10X avec 9 parties d’eau distillée)Pour la coloration intercellulaire des anticorps  ;
par cytométrie en flux Analyse des Taux de dilutionde dilution 1 Anticorps FACS FACS 1x Tampon de 1x Tampon de de perméabilisationcellulairede cellulesanticorpsenzymatiquecellulaire

Références

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