Article de méthode

Étude de l’angiogenèse aux niveaux fonctionnel et moléculaire en exploitant le test de migration des plaies par égratignures et le test de germination des sphéroïdes

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DOI :

10.3791/66954

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31 mai 2024

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1Eye Center, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine I, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Institute of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Chemistry and Pharmacy, University of Freiburg, 4Pharmacy, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Ophtha-Lab, Department of Ophthalmology, St. Franziskus Hospital Muenster

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente le test de migration bidimensionnel (2D) et le test de germination de sphéroïdes tridimensionnel (3D), ainsi que leurs méthodes d’analyse respectives en aval, y compris l’extraction d’ARN et l’immunocytochimie, comme des tests appropriés pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Résumé

L’angiogenèse joue un rôle crucial dans les processus physiologiques et pathologiques du corps, y compris la croissance tumorale ou les maladies oculaires néovasculaires. Une compréhension détaillée des mécanismes moléculaires sous-jacents et des modèles de dépistage fiables sont essentiels pour cibler efficacement les maladies et développer de nouvelles options thérapeutiques. Plusieurs essais in vitro ont été mis au point pour modéliser l’angiogenèse, en capitalisant sur les possibilités qu’offre un environnement contrôlé pour élucider les facteurs angiogéniques au niveau moléculaire et rechercher des cibles thérapeutiques.

Cette étude présente des flux de travail pour l’étude de l’angiogenèse in vitro à l’aide de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Nous détaillons un test de migration de plaie par égratignure à l’aide d’un système d’imagerie de cellules vivantes mesurant la migration des cellules endothéliales dans un cadre 2D et le test de germination de sphéroïdes évaluant la germination de cellules endothéliales dans un cadre 3D fourni par une matrice de collagène. De plus, nous décrivons des stratégies de préparation des échantillons pour permettre d’autres analyses moléculaires telles que la transcriptomique, en particulier dans le cadre de la 3D, y compris l’extraction d’ARN ainsi que l’immunocytochimie. Dans l’ensemble, ce cadre offre aux scientifiques un ensemble d’outils fiables et polyvalents pour poursuivre leurs recherches scientifiques dans les essais d’angiogenèse in vitro .

Introduction

L’angiogenèse, qui fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants1, est un processus crucial au cours du développement physiologique et des conditions pathologiques. Il est indispensable pour fournir de l’énergie aux tissus hautement métaboliquement actifs tels que la rétine2 ou le système nerveux central en développement3 et lors de la cicatrisation des tissus endommagés4. L’angiogenèse anormale, en revanche, est à la base de nombreuses maladies. Les tumeurs solides, comme le cancer colorectal ou le cancer du poumon non à petites cellules, facilitent leur croissance et l’apport énergétique nécessaire en favorisant l’angiogenèse5. Outre le cancer, les maladies néovasculaires de l’œil comme la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l’âge, qui représentent les principales causes de cécité dans le monde développé, résultent d’une croissance aberrante des vaisseaux 6,7. Une compréhension détaillée du mécanisme pathologique sous-jacent est cruciale pour comprendre comment l’angiogenèse physiologique peut être améliorée, par exemple, dans la cicatrisation des plaies tout en contrôlant mieux les conditions pathologiques telles que les maladies oculaires vasoprolifératives.

Au niveau cellulaire, les cellules endothéliales vasculaires sont activées par diverses molécules de signalisation dans l’angiogenèse, initiant la prolifération et la migration cellulaires8. Les cellules s’organisent ensuite en une hiérarchie, les cellules de pointe non proliférantes formant des filopodes sur le bord d’attaque de la branche8 du vaisseau en développement. À côté, des cellules pédonculaires à prolifération rapide suivent les cellules de pointe, contribuant à la formation du vaisseau émergent. Par la suite, d’autres types de cellules, telles que les péricytes ou les cellules musculaires lisses, sont recrutés pour stabiliser davantage la branche naissante9.

Pour explorer les processus moléculaires au niveau des cellules endothéliales vasculaires, de nombreux protocoles in vitro ont été développés et récemment examinés10. Ces tests se répartissent généralement en deux catégories : les approches 2D plus simplistes mais évolutives et les protocoles 3D plus élaborés. Dans le cadre d’un projet récent, nous avons effectué une analyse comparative complète entre l’essai de migration des plaies par égratignures 2D et l’essai de germination des sphéroïdes3D 11 afin d’évaluer l’étendue de leurs différences et leur capacité à modéliser divers aspects de l’angiogenèse12.

Bien que les deux offrent l’avantage d’être fiables et facilement mis en œuvre, au niveau moléculaire, le test de germination de sphéroïdes 3D était favorable pour aborder des aspects clés de l’angiogenèse par rapport aux données in vivo, tels que les commutateurs métaboliques ou les interactions cellule-matrice. Étant donné que les essais d’angiogenèse in vitro sont utilisés pour évaluer le potentiel angiomodulateur des voies de signalisation13 et pour dépister des agents thérapeutiques, la transférabilité des résultats in vitro aux contextes in vivo est essentielle. De plus, la possibilité d’effectuer des analyses omiques sur les niveaux d’ARN et de protéines pour caractériser les changements moléculaires en réponse à la modulation ciblée des processus angiogéniques dans des conditions contrôlées reste un avantage important par rapport aux environnements in vivo 14,15.

Dans cette publication, nous présentons des tests clés pour explorer les questions liées à l’angiogenèse grâce à l’utilisation d’un test de migration d’imagerie de cellules vivantes et d’un test de germination de sphéroïdes, y compris des analyses moléculaires ultérieures telles que le séquençage de l’ARN pour l’analyse transcriptomique et l’immunohistochimie au niveau des protéines.

Protocole

1. Culture cellulaire HUVEC

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

  1. Expansion des HUVECs
    1. Pour les deux tests d’angiogenèse, utilisez des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) ou des cellules endothéliales microvasculaires humaines (HMVEC).
    2. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 % de confluence dans un ballon T75 non enrobé avec un milieu de croissance cellulaire endothéliale (EGM) avant d’effectuer une séparation. Effectuez un changement moyen 3 fois par semaine.
      REMARQUE : Pour accélérer la croissance, le milieu peut être changé quotidiennement. N’utilisez pas les HUVECs au-delà du sixième passage. L’étude a reçu les résultats les plus cohérents en exécutant toutes les expériences avec des HUVEC du même passage.
  2. Fendre les HUVECs
    1. Lorsque les HUVEC atteignent la confluence souhaitée dans la fiole T75, rincez-les une fois avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis incubez les cellules avec de la trypsine à 0,5 % pendant 2 min dans l’incubateur.
      REMARQUE : Une exposition prolongée à la trypsine peut endommager la fonction HUVEC.
    2. Détachez doucement les cellules en tapotant sur la fiole. Confirmez le décollement réussi à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé.
    3. Ajouter 8 mL d’EGM, transférer la solution dans un tube et granuler les cellules par centrifugation à 250 x g pendant 3 min.
    4. Si le comptage des cellules est nécessaire, remettre les cellules en suspension dans 5 mL d’EGM et utiliser une chambre Neubauer. Sinon, ajoutez 40 ml d’EGM et répartissez-le dans 4 flacons de culture cellulaire T75 frais.

2. Essai de migration des plaies par égratignure

REMARQUE : L’essai de migration par égratignures nécessite une durée de 3 jours (Figure 1). Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

  1. Placage et affamation des cellules (jour 1)
    1. À l’aide d’une plaque spécialisée de 96 puits pour l’imagerie de cellules vivantes, ensemencez 20 000 HUVEC dans 100 μL d’EGM par puits. Laissez les cellules se stabiliser pendant 6 h dans l’incubateur.
      REMARQUE : Il est conseillé d’optimiser le nombre de cellules en tenant compte de la vitesse variable de croissance des cellules endothéliales vasculaires entre les fournisseurs et les laboratoires. L’objectif est d’obtenir une monocouche parfaite le lendemain avant d’initier le scratch. Les puits surpeuplés peuvent modifier le comportement des cellules endothéliales, par exemple par l’inhibition de contact16, tandis qu’une monocouche incomplète entrave considérablement l’analyse.
    2. Affamez tous les puits pendant la nuit avec 100 μL d’EBM par puits complété par 2% de FBS.
      REMARQUE : Veillez à ne pas endommager la monocouche cellulaire, en particulier lors de l’utilisation d’une pipette multicanaux.
  2. Préparation des solutions de stimulation (jour 2)
    1. Diluer les substances et les contrôles souhaités dans le milieu basal de croissance des cellules endothéliales (EBM) complété par 2% de FBS. Pour chaque puits, utilisez 100 μL de solution.
      REMARQUE : L’EBM complété par 2 % de FBS sert de témoin négatif, tandis que le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain (VEGF) recombinant à 25 ng/mL peut être utilisé comme témoin positif. À l’aide de plaques de 96 puits, il est recommandé de concevoir les expériences avec un minimum de répétitions techniques (4 puits dans des conditions identiques), bien qu’il soit suggéré d’en utiliser 8 pour des résultats optimaux. Efforcez-vous de minimiser les effets potentiels sur les bords ou les coins lors de la planification de l’aménagement.
  3. Création du scratch (jour 2)
    1. Vérifiez les cellules au microscope pour vérifier une monocouche cellulaire confluente et la viabilité cellulaire. Positionnez la plaque à 96 puits dans un outil de bobinage à 96 puits et générez la rayure en appuyant sur le levier de l’appareil. Soulevez avec précaution le couvercle de l’outil de fabrication de plaies avant de relâcher le levier pour éviter les doubles rayures.
    2. Lavez tous les puits deux fois avec 200 μL d’EBM par puits complété par 2 % de FBS. Confirmez au microscope que les débris ont été enlevés avec succès.
  4. Stimulation cellulaire (jour 2)
    1. Ajouter 100 μL des solutions de stimulation ou de contrôle préparées par puits.
  5. Imagerie (jours 2-3)
    1. Acquérez des images une fois par heure pendant une période allant jusqu’à 24 h à l’aide d’un programme automatisé fourni par le microscope d’imagerie sur cellules vivantes.
      REMARQUE : Pour assurer une bonne qualité d’image, balayez chaque puits immédiatement après l’avoir transféré dans l’incubateur abritant le système d’imagerie de cellules vivantes. Un temps d’acclimatation de 30 minutes dans l’incubateur permet d’obtenir une meilleure qualité d’image. Le logiciel du microscope est programmé pour acquérir une image par heure pour chaque puits situé sur la ligne médiane de l’égratignure définie.
  6. En l’absence d’un outil de fabrication de plaies et d’un imageur de cellules vivantes, suivez les étapes décrites ci-dessous.
    1. Utilisez une pointe de pipette dans une plaque de 24 puits pour induire une égratignure. Prenez des images avec un microscope de culture cellulaire classique à des intervalles précis. À cette fin, utilisez un microscope motorisé équipé de capacités de suivi x et y précises. Cela permet un positionnement automatique, assurant une capture d’image cohérente à des endroits prédéfinis.
      REMARQUE : Lorsque l’imagerie manuelle est nécessaire, il est possible de n’imager que T0 ainsi qu’un point temporel 'x' heures après le traitement. Dans le protocole décrit utilisant des HUVEC, le point temporel T12 (12 h après la stimulation) était un point temporel attrayant avec une séparation claire entre le contrôle négatif et le contrôle positif stimulé par le VEGF. Cependant, il est recommandé d’effectuer des expériences initiales d’imagerie toutes les 2 h ou 1 h afin de déterminer le point temporel optimal pour les paramètres expérimentaux spécifiques de chaque laboratoire.
  7. Analyse (jour 3)
    1. Le logiciel du microscope imageur de cellules vivantes peut permettre une analyse directe des images acquises. Définissez des masques délimitant les zones de pelouse cellulaire, d’égratignure initiale et de densité relative de la plaie. Déterminez les limites des cellules en fonction des différences de contraste.
      REMARQUE : Un ajustement de segmentation de 1,6, un fichier de trous de 500 μm2, une taille ajustée de 1 pixel, une zone > 500 μm et une excentricité >0,6 ont été utilisés pour les expériences menées avec des HUVECs. Un contrôle visuel approfondi des paramètres de détection des cellules par rapport aux images réelles est essentiel. Grâce à des configurations optimisées, le logiciel calcule automatiquement la densité relative de l’enroulement (RWD) au fil du temps et génère les graphiques temporels correspondants avec l’écart-type (SD) des répliques techniques. Ces données peuvent ensuite être utilisées pour l’analyse statistique.

3. Extraction de l’ARN avec des cellules cultivées en 2D

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes jusqu’à l’étape 3.3 dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

  1. Cellules de placage (jour 1)
    1. Détachez les HUVEC conformément à l’étape 1.2 du protocole de culture cellulaire HUVEC.
    2. Ensemencez 50 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits avec 2 ml d’EGM par puits.
    3. Changer le milieu après 6 h en EBM contenant 2% de FBS (milieu affamé) pour mourir de faim pendant la nuit.
  2. Traitement des cellules (jour 2)
    1. Agents dilués d’intérêt en EBM complétés par 2% FBS. Remplacez le milieu affamé par la dilution préparée et incubez les cellules pendant le temps souhaité dans un incubateur.
  3. Extraction de l’ARN (jours 2-3)
    1. Lyser les cellules avec 750 μL de Trizol par puits et incuber pendant 10 min sur un agitateur orbital.
    2. Remettez les échantillons en suspension à l’aide d’une pipette de 1000 μL à quelques reprises, puis stockez-les dans des tubes d’ARN spécifiques à faible liaison (volume 1,5 mL). Conserver à -80 °C.

4. Immunocytochimie avec des cellules cultivées en 2D

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes jusqu’à l’étape 4.4 dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

  1. Préparation des lamelles
    1. Incuber 100 lamelles d’un diamètre de 12 mm dans de l’hydroxyde de potassium à 5 % dans du méthanol dans un tube de 50 mL pendant 30 min tout en agitant la solution appliquée.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape très importante dans la déprotonation de la surface des lamelles et l’amélioration des conditions d’enrobage et de culture. À ce stade, il est fortement recommandé de s’assurer que les lamelles sont bien réparties dans le support et qu’elles ne sèchent pas et ne sont pas collées ensemble.
    2. Lavez les lamelles pendant 30 min 4 fois avec de l’eau déminéralisée.
    3. Après le lavage, transférez-les dans une solution isopropylique à 70 % pour le stockage.
  2. Revêtement des lamelles
    1. Appuyez les lamelles individuellement contre la paroi d’une boîte de Pétri carrée pour permettre l’évaporation de l’alcool isopropylique.
    2. Après 5 minutes, transférez les lamelles dans une plaque de 24 puits (une lamelle par puits). Appliquer 1 mL d’une solution de 10 mg/mL de collagène I dans du PBS dans chaque puits et incuber pendant 60 min à 37 °C.
    3. Ensuite, lavez les lamelles 4 à 5 fois pendant 5 minutes avec du PBS.
  3. Culture des cellules
    1. Détachez les HUVEC en suivant les procédures décrites à l’étape 1.2 du protocole de culture cellulaire HUVEC.
    2. Ensemencez 50 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits avec 2 ml d’EGM par puits.
    3. Après 6 h, changez le milieu en EBM contenant 2% de FBS pour permettre aux cellules de se fixer au puits et affamer les cellules pendant la nuit.
    4. Le lendemain, les agents dilués d’intérêt dans l’EBM ont été complétés par 2% de FBS. Remplacez la solution affamée dans les puits par la dilution préparée et incubez les cellules pendant le temps souhaité dans un incubateur.
  4. Fixation et blocage
    1. Cultivez les cellules pendant le temps souhaité, puis lavez les cellules avec du PBS pendant 5 min.
    2. Fixez les cellules avec 2% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 20 min à température ambiante (RT).
    3. Laver avec du PBS 3-4 fois pendant 5 min.
    4. Incuber les échantillons avec un tampon bloquant contenant 5 % de sérum de chèvre normal (NGS), 0,1 % de Triton-X-100 dans du PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE : À cette étape, il est important de laver les échantillons pour garantir l’élimination complète du PFA. Choisissez l’espèce du sérum en fonction de l’origine de l’anticorps secondaire.
  5. Coloration
    1. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 °C dans le tampon de blocage avec l’anticorps primaire.
    2. Le lendemain, pour éliminer tout anticorps primaire non lié, lavez les échantillons 3 à 4 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacun.
    3. Par la suite, incubez les échantillons pendant 1 h à RT avec l’anticorps secondaire correspondant et la phalloïdine-FITC, dilués ensemble dans le tampon de blocage.
    4. Lavez 3 à 4 fois supplémentaires.
    5. Retournez les lamelles sur les lames avec une petite gouttelette de support de montage contenant du DAPI, laissez sécher dans l’obscurité et scellez avec du vernis à ongles. Conservez les échantillons dans l’obscurité à 4 °C.

5. Essai de germination de sphéroïdes

REMARQUE : L’essai de germination des sphéroïdes prend 3 jours (figure 2). Effectuez toutes les étapes suivantes jusqu’à l’étape 5.7 dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

  1. Génération de sphéroïdes dans des gouttes suspendues (jour 1)
    1. Détachez les HUVEC en suivant les procédures décrites à l’étape 1.2 du protocole de culture cellulaire HUVEC.
    2. Combinez 200 000 cellules avec 8 ml d’EGM et 2 ml de solution mère de méthocel, en assurant un mélange minutieux. Veuillez vous référer au fichier supplémentaire 1 pour obtenir des instructions sur la préparation de la solution mère de méthocel.
    3. Versez des gouttelettes de 25 μL de la solution sur la surface interne inversée d’une grande boîte de Pétri carrée. Faites pivoter doucement le couvercle de 180° et positionnez-le au fond du récipient de culture cellulaire de manière à ce que les gouttelettes pendent. Placez le récipient dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit.
  2. Préparation du gel de collagène (jour 2)
    1. Mélangez soigneusement 2,3 ml de collagène de queue de rat de type I avec 0,280 ml de 10x Medium 199 jusqu’à ce que le mélange obtienne une teinte jaune uniformément uniforme. Gardez ce mélange sur de la glace tout au long du processus.
  3. Titrer le gel de collagène (jour 2)
    1. Titrer le mélange pour obtenir un pH physiologique, indiqué par une couleur orange, à l’aide de NaOH (2 N).
    2. Ajoutez 50 μL de tampon HEPES au produit final.
      REMARQUE : Pour assurer une plage dynamique optimale pour le dosage, il est impératif de s’approcher au plus près d’un pH physiologique. Différents lots de collagène peuvent nécessiter différentes quantités de NaOH. Gardez le mélange strictement sur de la glace tout au long du processus et mélangez-le uniformément tout le temps.
  4. Récolte des sphéroïdes (jour 2)
    1. Rincer les gouttes suspendues des couvercles de culture cellulaire avec 20 ml de PBS.
    2. Centrifuger la solution pendant 7 min à 250 x g. Jetez le surnageant et remettez les sphéroïdes en suspension dans 0,1 mL de FBS et 0,4 mL d’EGM en tapotant doucement le tube.
    3. Ajouter 2 ml de solution mère de méthocel et bien mélanger. Utilisez une pipette d’une contenance minimale de 5 ml pour éviter d’endommager les sphéroïdes.
  5. Ajout de sphéroïdes à la matrice de collagène 3D (jour 2)
    1. Ajouter 2 ml du mélange de collagène préparé aux sphéroïdes remis en suspension et bien mélanger.
    2. Versez 0,5 mL du mélange obtenu dans les puits d’une plaque à 24 puits et incubez dans un incubateur cellulaire pendant 30 min.
  6. Stimulation des sphéroïdes dans une matrice de collagène 3D (jour 2)
    1. Préparez une dilution des substances souhaitées dans l’EBM. Pour chaque puits, utilisez 100 μL de solution.
      REMARQUE : L’EBM sert de contrôle négatif, tandis que le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) à 25 ng/mL (concentration finale dans 500 μL de matrice de collagène et 100 μL de couche d’EBM) peut être utilisé comme contrôle positif.
    2. Incuber pendant le temps souhaité.
      REMARQUE : Dans un test standard, il est recommandé de prendre 18 à 24 h, mais le temps doit être soigneusement optimisé dans chaque laboratoire.
  7. Imagerie des sphéroïdes (jour 3)
    1. Utilisez un microscope inversé et une plate-forme d’imagerie pour capturer des images de tous les sphéroïdes qui ne sont pas en contact avec le bord du puits, les uns avec les autres ou qui montrent des signes de dommages. Maintenez des paramètres et des niveaux de zoom cohérents dans toutes les conditions.
  8. Analyse (jour 3)
    1. Utilisez l’outil de mesure d’ImageJ Fiji pour déterminer la longueur de toutes les pousses de chaque sphéroïde dans chaque image.
      REMARQUE : Utilisez le plug-in fourni dans le fichier supplémentaire 2, ce qui rend l’analyse plus efficace et génère une sortie .txt fichier.
    2. Importez les données dans une feuille de calcul, R ou tout autre logiciel de votre choix, et utilisez la longueur cumulative moyenne de toutes les germinations par sphéroïde comme lecture pour chaque condition.
      REMARQUE : Les résultats de différents gels ne peuvent pas être combinés sous la forme de longueurs de germination absolues. Les données de chaque groupe de traitement doivent être normalisées en fonction du groupe témoin EBM ou VEGF (longueur de germination relative) avant de pouvoir fusionner les données.

6. Extraction d’ARN avec des cellules cultivées en 3D

  1. Essai de germination de sphéroïdes
    1. Effectuez le test de germination des sphéroïdes comme décrit dans la rubrique 5.
  2. Lyse du gel de collagène
    1. Lavez les gels sphéroïdes avec du PBS chaud pendant 5 min.
    2. Coupez les gels sphéroïdes en quartiers et transférez les 4 quartiers dans un tube de 50 ml. Utilisez un scalpel pour la dissection mécanique des gels.
    3. Traiter des échantillons de gel avec une solution de lyse (contenant 2 mg/mL de collagénase D dans du PBS) et incuber pendant 45 min à 37 °C sur un agitateur.
    4. Laver délicatement les gels avec du PBS complété par 2 mM d’EDTA pour stopper la réaction du tampon de lyse.
  3. Extraction de l’ARN
    1. Remettre les gels lysés en suspension dans 750 μL de Trizol et incuber pendant 10 min pour garantir une extraction suffisante de l’ARN comme décrit à l’étape 3.3.
    2. Remettre les échantillons en suspension à l’aide d’une pipette de 1000 μL à quelques reprises et transférer les échantillons dans des tubes d’ARN spécifiques à faible liaison (volume 1,5 mL). Conservez les échantillons à -80 °C.

7. Immunocytochimie de sphéroïdes dans une matrice de collagène 3D

  1. Essai de germination de sphéroïdes
    1. Effectuez le test de germination des sphéroïdes comme décrit dans la rubrique 5.
  2. Fixation et blocage
    1. Fixez les gels avec 4% de PFA dans du PBS pendant 1 h.
      REMARQUE : Pour assurer une bonne fixation des cellules dans le gel, les gels doivent être soigneusement détachés sur les côtés des puits à l’aide d’un scalpel et d’une pince à épiler après un rinçage au PBS.
    2. Lavez doucement les gels 3 à 4 fois avec du PBS, puis détachez-les complètement de la surface des puits et transférez-les dans de nouvelles plaques à 24 puits.
    3. Incuber les gels pendant 1 h à RT avec la solution de blocage (contenant 5% de NGS et 0,1% de Triton-X-100 dans PBS) sur un agitateur orbital.
  3. Coloration
    1. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur orbital avec l’anticorps primaire dilué dans un tampon de blocage.
      REMARQUE : Le retournement des gels pendant cette incubation n’a pas amélioré la qualité de la coloration.
    2. Le lendemain, lavez doucement les gels 4 à 5 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacun.
    3. Incuber l’anticorps secondaire correspondant, dilué avec de la phalloïdine-FITC dans un tampon de blocage pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur orbitaire.
    4. Effectuez 4 à 5 étapes de lavage supplémentaires avec PBS.
    5. Transférez les gels sur des lames de microscope et montez-les avec deux gouttes de support de montage contenant du DAPI sur une lamelle placée sur chaque gel. Laissez sécher les échantillons avant de les sceller avec du vernis à ongles et conservez-les dans l’obscurité à 4 °C.
  4. Microscopie
    1. Imagez tous les échantillons au microscope confocal. Utilisez l’objectif 20x et concentrez-vous sur la région qui vous intéresse. Acquérez des images sous forme d’empilements Z, ainsi que des images de plan focal individuel.
      REMARQUE : L’acquisition d’images de la pile Z et du plan focal à plusieurs sections de l’échantillon 3D est essentielle pour capturer la représentation complète, en particulier pour les échantillons 3D épais.

8. Cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMVEC)

REMARQUE : Toutes les étapes décrites peuvent également être réalisées avec des cellules endothéliales microvasculaires, par exemple des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMVEC). Dans ce cas, le milieu doit être remplacé par un milieu de cellules endothéliales microvasculaires spécifique contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) pour la culture ainsi que des étapes spécifiques de chaque essai. Les différences spécifiques au HRMVEC par rapport aux protocoles d’essai sont décrites ci-dessous :

  1. Essai de blessure par égratignure
    1. Cultivez des cellules dans un milieu de cellules endothéliales microvasculaires FBS à 10 % au lieu de EGM.
    2. Ensemencer 20 000 cellules/puits.
    3. N’affamez pas les cellules pendant la nuit.
    4. Après avoir effectué le grattage, changez le milieu en milieu de cellules endothéliales basales contenant 5 % de FBS au lieu d’EBM avec 2 % de FBS.
  2. Immunocytochimie des HRMVECs cultivés en 2D
    1. Cultivez les cellules dans un milieu de cellules endothéliales microvasculaires à 10 % au lieu de l’EGM.
    2. N’affamez pas les cellules pendant la nuit.
    3. Changez le milieu juste avant le traitement en EBM + 5% FBS au lieu de EBM + 2% FBS.
  3. Essai de germination de sphéroïdes
    1. Ensemencez les cellules sous forme de gouttes suspendues avec un milieu cellulaire endothélial microvasculaire contenant 10 % de FBS au lieu d’EGM.
  4. Immunocytochimie de sphéroïdes dans une matrice de collagène 3D
    1. Ensemencez les cellules sous forme de gouttes suspendues avec un milieu cellulaire endothélial microvasculaire contenant 10 % de FBS au lieu d’EGM.

Résultats

Pour l’essai de migration, il est crucial d’examiner minutieusement les images capturées au point temporel t = 0 h pour s’assurer que la présence d’une monocouche cellulaire entièrement formée est détectée avec précision par le système (Figure 1B). De plus, la clarté et la rectitude de la bordure scratch doivent être confirmées (Figure 1B). La zone sans cellules doit être en grande partie exempte de débris. À la fin de l’essai, un groupe stimulé avec, par exemple, 25 ng/mL de VEGF comme témoin positif devrait montrer une migration réussie dans la zone d’origine grattée (Figure 1B). Un cas de problèmes techniques peut se manifester par une croissance cellulaire inégale, un double grattage ou une ondulation des bordures de rayure (Figure 1C). De plus, il est important d’établir une plage dynamique substantielle entre le témoin négatif (échantillons stimulés par l’EBM) et le témoin positif (échantillons VEGF) (Figure 1D). Dans notre dispositif expérimental, nous considérons qu’une augmentation de 25 % de la RWD après 12 h est une plage optimale (Figure 1D). Dans un test technique problématique, les témoins positifs et négatifs ne se séparent pas correctement, ce qui indique une faible plage dynamique (Figure 1E).

Coloration immunocytochimique des HUVECs sur lamelles, visualisée au microscope à fluorescence pour valider la réussite de la coloration (Figure 1F). Il est important d’examiner la majorité des cellules et d’identifier une région caractéristique de la lame. La spécificité de la coloration est évaluée à l’aide d’une lame de contrôle traitée uniquement avec un anticorps secondaire afin d’exclure la liaison non spécifique (Figure 1F). Des signaux de coloration spécifiques doivent être examinés de manière critique en fonction de la localisation subcellulaire connue de la protéine cible. Nous utilisons des modèles de localisation subcellulaire ainsi que l’absence de signal dans l’échantillon de contrôle comme indices d’un protocole d’immunomarquage réussi.

De même, certains aspects doivent être pris en compte pour des essais de germination de sphéroïdes de haute qualité. La qualité devrait, dans ce cas, être évaluée à la fin du test à, par exemple, t = 24 h. La matrice de collagène observée au microscope doit présenter une homogénéité et ne doit pas apparaître friable ou rugueuse (Figure 2B). Les sphéroïdes stimulés avec un milieu de base seulement comme témoin négatif et 25 ng/mL de VEGF comme témoin positif devraient être clairement distingués (figure 2B). De plus, les sphéroïdes doivent flotter dans le gel et ne pas tomber au sol, où ils se dispersent, ce qui indique une mauvaise qualité (figure 2C). Ce problème provient souvent d’un refroidissement inadéquat du collagène pendant le titrage du mélange ou d’un titrage excessif ou insuffisant du pH (Figure 2C). Un minimum de 10 sphéroïdes par puits doit être imagable pour chaque puits. Le témoin négatif (échantillons stimulés par l’EBM) doit présenter un taux de germination de base modéré, tandis que le VEGF, qui sert de contrôle positif, double ou, de préférence, triple idéalement le RSL par rapport aux témoins (figure 2D, graphique de gauche). Le nombre de germes doit également présenter une plage dynamique similaire (figure 2D, graphique de droite). Un test technique sous-optimal ne montrera pas cette plage dynamique entre les témoins et pourrait donc conduire à une fausse interprétation des données (Figure 2E).

Les colorations analogiques à 2D, l’examen des lames au microscope à fluorescence et l’évaluation critique des structures colorées sont d’une grande importance pour une coloration réussie (Figure 2F). Si la localisation cellulaire des structures et l’intensité du signal par rapport au contrôle sont compréhensibles, on peut supposer que la coloration a réussi.

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Figure 1 : Essai d’imagerie sur cellules vivantes pour l’essai de migration des plaies par égratignures. (A) Schéma de l’essai de migration des plaies par égratignures. (B) Images présentant une réplique technique de haute qualité à t = 0 h et t = 12 h. Les cellules ont été stimulées avec 25 ng/mL de VEGF pour servir de contrôle positif. (C) Exemples de deux répliques techniques de mauvaise qualité à t = 0 h en raison d’une égratignure inappropriée ou d’une double égratignure. (D) Résultats d’un essai de migration par grattage. La séparation correcte du témoin positif stimulé avec 25 ng/mL de VEGF et du témoin négatif simplement traité avec un milieu basal a été visualisée par un graphique de violon à t = 12 h. Les données comprennent 7 à 8 répétitions techniques par groupe. (E) Résultats exemplaires mettant en évidence l’échec d’un test de migration par égratignures. La séparation sous-optimale du témoin positif stimulé avec 25 ng/mL de VEGF et du témoin négatif simplement traité avec un milieu basal a été visualisée par un graphique en violon à t = 12 h. Les données comprennent 7 à 8 répétitions techniques par groupe. (F) Exemples d’images de HUVEC ensemencées sur des lamelles et colorées pour le DAPI, la phalloïdine et le VEGF-R2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Le test de germination des sphéroïdes. (A) Schéma de l’essai de germination des sphéroïdes. (B) Images montrant le contrôle négatif (sphéroïdes stimulés en milieu basal) et le contrôle positif (sphéroïdes stimulés par le VEGF 25 ng/mL) d’un essai technique idéal à la fin à t = 24 h. (C) Exemples de deux sphéroïdes de faible qualité à t = 24 h. Les images de gauche montrent un sphéroïde endommagé qui est tombé au fond de la plaque, ce qui entraîne un corps sphéroïde desserré et un taux de germination anormalement élevé. L’image de droite visualise le collagène avec des taches de couleur visibles, créant un environnement très hétérogène qui compromet considérablement la qualité du test. (D) Analyse de la RSL (graphique de gauche) et du nombre de germes (graphique de droite) d’un test réussi avec une bonne plage dynamique entre le contrôle négatif et le contrôle positif. Les données sont visualisées à l’aide d’un graphique de violon et comprennent 10 à 25 sphéroïdes par groupe. (E) Analyse de la RSL (graphique de gauche) et du nombre de germes (graphique de droite) d’un test problématique technique avec une plage dynamique sous-optimale entre le contrôle négatif et le contrôle positif. Les données sont visualisées à l’aide d’un graphique de violon et comprennent 10 à 25 sphéroïdes par groupe. (F) Images exemplaires de HUVECs de l’essai de germination de sphéroïdes colorés pour le DAPI, la phalloïdine et le VEGF-R2.c

Fichier supplémentaire 1 : Instructions pour la préparation de la solution mère de méthocel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Plug-in SpheroidCount.ijm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans ce rapport, nous avons présenté un éventail de techniques avec des lectures fonctionnelles et moléculaires pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Le test de migration représente une technique bien établie utilisée dans tous les domaines du travail de laboratoire humide. Nous avons choisi l’approche d’imagerie de cellules vivantes disponible dans le commerce pour tirer parti du format 96 puits adapté aux expériences de criblage et de dose-réponse, de la taille standardisée et reproductible de la plaie créée par l’outil WoundMaker, de la possibilité d’observer la cinétique de migration grâce à l’imagerie time-lapse jusqu’à 24 h ainsi que du logiciel de quantification d’images automatisé. Cependant, la présence d’un système d’imagerie de cellules vivantes équipé d’un logiciel d’analyse de l’angiogenèse en laboratoire ou dans une plateforme est nécessaire. De nombreux dispositifs expérimentaux alternatifs ont été mis en place qui ne nécessitent pas de microscopes d’imagerie de cellules vivantes spécifiques ou d’autres équipements spéciaux10.

D’après notre expérience, il est crucial d’optimiser les paramètres de l’analyseur, car les HUVECs et autres types de cellules endothéliales vasculaires peuvent avoir tendance à fournir un faible contraste, ce qui entrave la lecture automatique par le logiciel du microscope. Pour résoudre ce problème, une étape supplémentaire de coloration par fluorescence (par exemple, la coloration de cellules vivantes) peut être introduite. Les systèmes d’imagerie de cellules vivantes prennent en charge une telle coloration et même une coloration multicolore pour le suivi d’une protéine d’intérêt. L’une des principales limites de l’essai est qu’il n’est pas toujours facile de faire la distinction entre la migration cellulaire et la prolifération et que les résultats de l’essai représentent une combinaison des deux processus. La solution d’imagerie de cellules vivantes utilisée dans cette étude tente de résoudre ce problème en introduisant la densité relative de la plaie (RWD). Contrairement à la confluence traditionnellement utilisée dans la zone rayée, le RWD évalue la confluence à l’intérieur de la zone rayée par rapport à la zone rayée extérieure. La migration dans la zone rayée élève le RWD en augmentant la confluence à l’intérieur de celle-ci tout en réduisant simultanément la confluence à l’extérieur de la zone rayée en raison de la migration cellulaire. À l’inverse, la prolifération cellulaire augmente également la confluence à l’extérieur de la zone rayée, diminuant ainsi la RWD. Il est important de reconnaître qu’il s’agit d’une approche d’analyse stratégique visant à réduire l’impact de la prolifération sur le résultat final. Des essais complémentaires de prolifération pourraient être nécessaires pour résoudre ce problème. Alternativement, des inhibiteurs du cycle cellulaire tels que la mitomycine C peuvent être ajoutés au test pour bloquer la prolifération. La mise en œuvre de protocoles avec ces inhibiteurs doit être soigneusement optimisée dans chaque laboratoire pour obtenir l’effet souhaité sans réduire la plage dynamique du test. De plus, en augmentant la fréquence de balayage de chaque puits, cette configuration offre une opportunité facilement réalisable de suivre avec précision les cellules en mouvement à un niveau individuel si un tel suivi détaillé présente un intérêt particulier.

Alors que le test de migration d’imagerie de cellules vivantes démontre l’avantage de l’évolutivité et des analyses automatisées et impartiales, notre étude précédente a mis en évidence la capacité du test de germination de sphéroïdes à capturer des détails plus complexes de l’angiogenèse. Cela inclut des aspects fondamentaux tels que la formation des cellules de pointe et de tige, l’interaction cellule-matrice et un commutateur glycolytique12. Pour garantir la reproductibilité du test, un enquêteur doit avoir de l’expérience dans la préparation de la matrice de collagène, car les variations de pH et de température au cours de ce processus peuvent avoir un impact sur les résultats. De plus, l’analyse est effectuée manuellement. L’analyse des images prend donc beaucoup de temps et comporte un risque de biais. Il est essentiel de bien masquer les conditions pendant l’analyse pour éviter l’introduction de biais. Pour répondre à cette préoccupation, nous avons récemment proposé une approche basée sur les réseaux neuronaux pour identifier et atténuer les biais potentiels dans l’analyse des tests de germination, qui peut être facilement mise en œuvre17. En conclusion, la meilleure approche pour valider les résultats est de combiner les deux essais. Cependant, il est crucial de reconnaître que des différences peuvent survenir en raison de la nature distincte des paramètres 2D et 3D12.

Comme il existe une large sélection de tests d’angiogenèse in vitro 2D et 3D, il est important de considérer les avantages et les inconvénients des tests présentés par rapport aux autres méthodes. Le test de blessure par égratignure, par exemple, se concentre sur la migration horizontale 2D sur une boîte en plastique, tandis que le test de la chambre Boyden caractérise la migration verticale à travers un insert en maille avec un chimioattractant dans la « chambre extérieure ». Basé sur sa configuration et sa lecture simples, le test de bobinage par égratignure permet des expériences à haut débit, en particulier dans son format à 96 puits, offrant une reproductibilité élevée ainsi que la possibilité de visualiser l’expérience et d’effectuer un time-lapse. Malheureusement, les inconvénients du test de blessure par égratignure sont la difficulté de différencier la prolifération et la migration, la nécessité de cellules adhérentes et, en l’absence d’un outil de fabrication de plaies, une variabilité plus élevée due à des rayures inégales. La lecture du test de la chambre de Boyden a l’avantage de mesurer l’effet chimiotactique des substances solubles sur les cellules mobiles18 et met en évidence à la fois l’invasion et la migration. Malheureusement, les inconvénients sont la faible reproductibilité et la variance élevée du test, l’incapacité à visualiser le mouvement des cellules, le nombre élevé de cellules migrées nécessaires pour obtenir un signal, la configuration et la lecture assez longues et élaborées, ainsi que l’absence de possibilité de réglage du time-lapse19.

Le test de germination sphéroïde quantifie la germination des cellules endothéliales dans une matrice de gel 3D, tandis que le test de formation de tubes caractérise la formation de tubes cellulaires à la surface d’une matrice de gel20. Le test de germination présente l’avantage de caractériser l’invasion des cellules dans une matrice ainsi que la prolifération et la migration. Les inconvénients sont la variance plus élevée du gel de collagène titré et, sur cette base, la qualité des sphéroïdes. L’avantage du test de formation de tubes est la formation de tubes vasculaires après un certain temps (en fonction de la cytokine) et une approche facile. Les inconvénients sont l’absence d’invasion des cellules et l’effet du Matrigel lui-même sur la formation du tube21.

Toutes les expériences présentées ont été réalisées avec des HUVEC. Il est bien connu qu’il existe des différences significatives dans le comportement des cellules endothéliales vasculaires de différentes origines (par exemple, macro-vasculaire vs micro-vasculaire)22,23. Il peut donc être nécessaire de valider les résultats expérimentaux avec d’autres lignées cellulaires endothéliales vasculaires. Les paramètres expérimentaux étaient transférables pour l’endothélium microvasculaire rétinien humain (HRMVECS), sauf que les HRMVEC nécessitent des concentrations plus élevées de FBS. D’autre part, la lignée cellulaire endothéliale aortique bovine (BAEC) couramment utilisée n’a pas pu être utilisée dans l’essai de germination sphéroïde en raison d’un taux de germination basale excessif.

Les deux tests présentés partagent la limitation d’être confinés à un seul type de cellule. Étant donné que l’angiogenèse in vivo est un processus multicellulaire complexe, cet aspect crucial n’est pas saisi avec précision par l’un ou l’autre des essais. Des variations de co-culture pour les deux essais ont été développées, avec un accent particulier sur l’essai de germination de sphéroïdes, et ont récemment fait l’objet de discussions10,24. Alternativement, la validation des données directement dans des modèles d’angiogenèse in vivo pertinents représente une option viable. Les tests établis à cette fin comprennent le modèle murin pour la rétinopathie induite par l’oxygène (OIR)25, le modèle de néovascularisation choroïdienne induite par laser (Laser-CNV)26 et le test de prise27.

Dans l’ensemble, le test de migration d’imagerie 2D de cellules vivantes et le test de germination de sphéroïdes 3D, en conjonction avec les outils d’analyse moléculaire présentés, offrent une plate-forme solide pour la recherche sur l’angiogenèse et sont largement reconnus au sein de la communauté de l’angiogenèse. La combinaison de ces tests avec des analyses in vivo ultérieures pour valider les résultats fournit une base solide pour étudier des questions spécifiques liées à l’angiogenèse.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts dans ce projet.

Remerciements

Les auteurs remercient Sophie Krüger et Gabriele Prinz pour leur excellent support technique. Nous remercions Sebastian Maier pour le développement du plugin ImageJ pour quantifier les pousses de sphéroïdes et le Lighthouse Core Facility, Zentrum für Translationale Zellforschung (ZTZ), Département de médecine I, Hôpital universitaire de Fribourg pour l’utilisation du système IncuCyte. Les graphiques ont été créés avec biorender.com. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft [Bu3135/3-1 + Bu3135/3-2 à F.B], la Medizinische Fakultät der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg [Programme Berta-Ottenstein pour les cliniciens-chercheurs et les cliniciens-chercheurs avancés à F.B.], la Else Kröner-Fresenius-Stiftung [2021_EKEA.80 à F.B.], le Consortium allemand contre le cancer [bourse CORTEX pour les cliniciens-chercheurs à J.R.] et la Volker Homann Stiftung [à J.N.+F.B.] et la "Freunde der Universitäts-Augenklinik Freiburg e.V. [à P.L.]

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10x Medium 199Sigma-AldrichM0650
Alexa Fluor 647-conjugué AffiniPure F(ab)' 2-FragmentJackson IR  ;115-606-072
Axio Vert. A1Zeiss
CapturePro 2.10.0.1JENOTIK Optical Systems
Collagène Type 1 queue de ratCorning354236
Collagénase DRoche  ;
Cellule endothéliale Milieu BasalLonzaCC-3156EBM
Milieu de croissance des cellules endothélialesLonzaCC-3162EGM
Ethylènediamineacide tétraacétique  ;Serva11290.02EDTA
Sérum fœtal bovinBio& SELLS 0615FBS
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine, regroupéesLonzaC2519AHUVEC
IncuCyte ImageLock 96 puits  ;Sartorius4379
Incucyte S3 Système d’analyse de cellules vivantesSartorius
MethocelSigmam-0512
Milieu cellulaire endothélial microvasculaire avec 10 % FBSPB-MH-100-4090-GFPPELOBiotech
NaOHCarl RothP031.2
Isothiocyanate de phalloïdine-fluorescéine marqué (0,5 mg/mL de méthanol)Sigma-AldrichP5282-.1MGPhalloidin-FITC
Solution saline tamponnée au phosphateThermo Fisher Scientfic14190-094PBS
Cellules endothéliales microvasculaires primaires de la rétine humaineACBRI181
ProLong Glass Antifade Mountant avec NucBlueInvitrogen de ThermoFisher Scientific2260939
Réactifde lyse QIAzolQIAGEN79306
recombinant humain Facteur de croissance endothéliale vasculairePeproTech100-20VEGF
Boîte de Pétri carréeGreiner688102
TrizolQiagen79306
TrypsinePAN-BiotecP10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)ThermoFisher Scientific Inc.B.309.4
Faiseur de plaiesSartorius4493
11088858001 Cellules systémiques

Références

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