Prélèvement de glandes parathyroïdes à partir de porcs donneurs vivants et identification ex vivo

Résumé

Ce protocole présente une méthode rapide et non létale pour obtenir des glandes parathyroïdes à partir de porcs. La procédure se compose de trois étapes principales : la préparation porcine sous anesthésie, le prélèvement unilatéral du thymus et l’identification et l’extraction ex vivo de la glande parathyroïde intrathymique.

Résumé

L’hypoparathyroïdie, souvent résultant de complications chirurgicales, perturbe gravement l’homéostasie calcique, entraînant des symptômes invalidants. Les traitements actuels offrent un soulagement limité, soulignant la nécessité de thérapies alternatives comme la transplantation de parathyroïde. Cette étude présente une méthode simple pour l’obtention de parathyroïde de donneur vivant à partir de porcs, avec des applications potentielles dans la recherche sur la transplantation, en particulier dans le domaine de la xénotransplantation. La procédure comporte trois étapes clés : la préparation porcine sous anesthésie, le prélèvement unilatéral du thymus et l’identification et l’extraction ex vivo de la glande parathyroïde intrathymique. Le protocole utilise des porcs Landrace, avec des procédures garantissant un traitement éthique et une récupération après l’opération. Nous avons réussi à extraire les glandes parathyroïdes, confirmant leur viabilité et leur intégrité grâce à une analyse ultérieure. Les niveaux de PTH dans le surnageant tissulaire dépassaient 1 000 pg/mL, et la coloration par immunofluorescence distinguait les glandes parathyroïdes du tissu thymique, validant la fiabilité de la procédure. Ce protocole offre une méthode rapide, non létale et éthiquement rationnelle pour l’obtention de glandes parathyroïdes chez les porcs, en tenant compte des différences anatomiques entre les porcs et les humains. Il propose une approche durable avec des implications importantes pour la recherche sur l’hypoparathyroïdie et la xénotransplantation.

Introduction

Ce protocole présente une méthode rapide et non létale pour l’obtention de glandes parathyroïdes chez les porcs. L’hypoparathyroïdie, caractérisée par une sécrétion insuffisante de parathormone, perturbe gravement l’homéostasie calcique¹. Cette affection, principalement une complication chirurgicale après une parathyroïdectomie ou une thyroïdectomie, se manifeste par des symptômes tels que l’asthénie, la douleur chronique, la tachycardie, les convulsions et même l’insuffisance rénale terminale². Parfois, il résulte de maladies auto-immunes ou génétiques rares. Les traitements actuels, principalement la supplémentation orale en calcium et en vitamine D ou la parathormone recombinante, ne procurent qu’un soulagement partiel des symptômes systémiques tels que la fatigue et la dépression ^3,4. La nécessité croissante de l’allotransplantation parathyroïdienne comme remède potentiel à l’hypoparathyroïdie sévère souligne la nécessité d’établir des protocoles de transplantation uniformes 5,6,7,8,9. Cependant, les études précliniques sur la transplantation de parathyroïdes restent limitées et il y a un manque de modèles animaux standardisés. De plus, l’essor récent dans le domaine de la xénotransplantation^10,11 augmente l’intérêt pour les applications cliniques de la xénotransplantation, en particulier dans le domaine de la thérapie cellulaire endocrinienne^12,13. Cependant, les modèles porcins de xénotransplantation parathyroïdienne sont difficiles en raison de la complexité de l’identification du tissu parathyroïdien chez les porcs. Il est donc nécessaire de fournir une technique reproductible, durable et éthique pour prélever des glandes parathyroïdes chez les porcs afin de développer davantage la xénotransplantation parathyroïdienne.

Contrairement aux êtres humains, qui ont généralement quatre glandes parathyroïdes situées derrière la thyroïde, les porcs possèdent, pour la plupart, deux glandes parathyroïdes, chacune située dans la partie crânienne du thymus. Des études antérieures visant à localiser les glandes parathyroïdes chez les porcs reposaient soit sur des méthodes létales pour l’identification ex vivo, soit sur des techniques basées sur des fluorophores, qui peuvent être difficiles à mettre en œuvre dans la xénotransplantation 14,15,16. Nous proposons ici une technique simple et non létale, adaptée à la xénotransplantation, basée sur deux étapes clés : le prélèvement du thymus porcin et l’identification ex vivo dela glande parathyroïde par transillumination. Cette technique pourrait être utile pour la recherche sur la physiologie parathyroïdienne, ainsi que pour la transplantation.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’Université de Lille (référencé #20491-20190219161313).

1. Anesthésie porcine

1. Administrer de la buprénorphine (0,015 mg/kg, par voie intramusculaire) 30 min avant la première incision pour fournir une analgésie préopératoire.
2. Effectuez une injection intramusculaire de kétamine (50 mg/kg) et de xylazine (3 mg/kg) pour induire une sédation. Administrer 5 % d’isoflurane par inhalation pendant 3 à 5 minutes pour approfondir l’anesthésie.
3. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de fermeture des paupières et le réflexe de déglutition. Intubez le porc et placez-le en décubitus dorsal sur la table d’opération. Réduire la concentration d’isoflurane à 2 % par inhalation pour le maintien de l’anesthésie.
4. Surveillez en permanence la fréquence cardiaque et la saturation en oxygène à l’aide d’un moniteur vétérinaire multiparamètre portable pour assurer une profondeur d’anesthésie et une stabilité physiologique optimales tout au long de la procédure.

2. Exposition de la zone d’intérêt

1. Rasez et nettoyez méticuleusement la région cervicale, s’étendant de la zone sous-mandibulaire au sternum.
2. Appliquez du savon antiseptique, suivi de chlorhexidine, pour assurer un champ stérile. Séchez soigneusement toute la zone.
3. Positionnez les champs stériles pour isoler la région cervicale antérieure pour une intervention chirurgicale.

3. Exposition au thymus porcin

1. Effectuez une incision verticale de 10 cm le long de la ligne cervicale blanche à l’aide d’un scalpel. Disséquez soigneusement la zone avec des ciseaux Metzenbaum pour séparer les muscles préthyroïdiens, créant ainsi un champ opératoire clair.
2. Placez un écarteur auto-retenant entre le muscle omohyoïdien et le cartilage thyroïdien pour faciliter la dissection du tissu conjonctif et exposer le thymus.
   REMARQUE : Évitez une pression excessive sur la trachée pour éviter les blessures.
3. Exposez progressivement la partie crânienne du thymus et séparez-la soigneusement de la gaine carotide, qui contient le nerf vague, la veine jugulaire interne et l’artère carotide commune.
   REMARQUE : Pour éviter les blessures, utilisez l’électrocoagulation pour obtenir l’hémostase.

4. Récupération du thymus porcin

1. Une fois relâché, extrayez la partie crânienne du thymus, qui mesure généralement 5 à 8 cm.
2. Rincer le thymus extrait dans une solution saline isotonique pour faciliter l’identification de la glande parathyroïde.
   REMARQUE : Cette étape est cruciale pour améliorer la visualisation et la différenciation de la texture distincte de la glande parathyroïde

5. Identification de la glande parathyroïde intrathymique ex vivo

1. Aplatissez doucement le tissu thymique pour faciliter l’identification de la glande parathyroïde.
   REMARQUE : La glande parathyroïde présente une texture distinctive, en particulier par rapport aux tissus environnants. La capsule fibreuse de la glande parathyroïde est plus ferme et de taille similaire à celle d’un pois.
2. Utilisez une source lumineuse pour identifier la glande parathyroïde par transillumination.
   REMARQUE : Le système vasculaire entourant la glande parathyroïde doit être clairement visible, ce qui aide à sa différenciation.
3. Excise soigneusement la capsule et extrait toute la glande parathyroïde. Utilisation de pinces Debakey pour les manipulations délicates et de ciseaux Metzenbaum pour une dissection précise. Isolez la glande du tissu thymique environnant.
4. Placez la glande parathyroïde isolée dans une solution de conservation au froid et maintenez-la à 4 °C pour préserver sa viabilité pour les procédures ultérieures.
5. Incorporez le tissu dans de la paraffine pour un traitement ultérieur.

6. Fermeture chirurgicale et réveil

1. Après le prélèvement de la glande parathyroïde, fermez le site chirurgical en couches. Suturer les muscles et les tissus sous-cutanés à l’aide de sutures résorbables. Fermez la peau avec des sutures non résorbables.
2. Sevrez progressivement le porc de l’anesthésie. Une fois de retour à la conscience, surveillez le porc pour détecter des complications postopératoires immédiates.
3. Administrer des analgésiques et des antibiotiques selon le protocole postopératoire (buprénorphine 0,03 à 0,05 mg/kg et Clamoxyl 15 mg/kg pendant 48 h). Retournez les porcs dans leur logement pour qu’ils soient récupérés sous la surveillance d’un vétérinaire.

7. Protocole d’immunomarquage

1. Effectuer la déparaffinisation et la déshydratation à partir d’échantillons inclus dans la paraffine : xylène pendant 5 min, xylène pendant 10 min, 100 % éthanol pendant 5 min, 90 % d’éthanol pendant 7 min 30, 70 % d’éthanol pendant 7 min 30, 50 % d’éthanol pendant 5 min, eau distillée pendant 5 min et tampon phosphate salin (PBS) pendant 5 min.
2. Effectuer la récupération de l’antigène en passant les échantillons au micro-ondes dans un tampon de citrate pH 6, à 650 W pendant 9 min. Laissez les échantillons refroidir dans la mémoire tampon pendant 20 min. Rincer trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
3. Incuber les échantillons, entourés d’un Dako-pen, à température ambiante pendant 20 min avec une solution de blocs de protéines pour bloquer la liaison non spécifique.
4. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire (anticorps PTH (H-7), IgG-α-humain de souris, sc-398856, 1:100 ) dilué dans 1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Lavez deux fois avec du PBS pendant 5 minutes chacun.
5. Incuber pendant 1 h et 30 min à température ambiante avec l’anticorps secondaire (Alexa Fluor 488, souris α chèvre, A11001, 1:500) dilué dans 1 % d’albumine sérique bovine. Lavez deux fois avec du PBS et une fois avec de l’eau distillée deux fois pendant 5 min.
6. Montez les lames avec la solution DAPI et stockez-les à 4 °C.

Résultats

Les principaux résultats de cette étude comprennent l’extraction réussie des glandes parathyroïdes de porcs Landrace et l’analyse ultérieure pour confirmer leur viabilité et leur intégrité. Les résultats sont résumés ci-dessous. L’identification du tissu parathyroïdien a été confirmée en peropératoire par transillumination (Figure 1A). Après l’extraction, deux petits échantillons de tissu ont été prélevés (environ 10 % chacun). Un échantillon a été haché dans une assiette plate dans...

Discussion

Ce protocole présente une méthode rapide et non létale pour l’obtention de glandes parathyroïdes chez les porcs. L’étape clé du protocole consiste à localiser le thymus porcin afin d’assurer une récupération complète pour une investigation ex vivo plus approfondie. Une fois le thymus extrait, la glande parathyroïde peut être facilement identifiée grâce à la transillumination.

L’un des principaux défis de cette technique est la nécessité d’éviter de s’...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Equipment
22G Cathéter périphérique court	Smiths Medical	5060
Basic set II, crêpe	Hartmann	9389253
Bupaq (bupré ; norphine)	Virbac
Clippers Favorita II	Aesculap Schermaschinen	GT104
Scalpels jetables	Swann-Morton	0510
Spatule à électrodes	Erbe	21191-002
Générateur d’électrochirurgie BE VIO 200p	Erbe	10140-400
Euroklav 23 VS+	MELAG	10056
Valve d’infusion par gravité à 3 voies avec embout mobile Luer Lock	Care Fusion	A64-3V
Poignée avec deux boutons pour électrodes Slim-Line  ;	Erbe	20190-065
Isoflurane Funnel Fill Vaporisateur	Supera Anesthesia Innovations	VAP3000
Isorane (isoflurane)	Axience
Ketamidor (ké ;	Axience
Light Ceiling Double	RIMSA	PENTA81+30E
Medisorb Absorbeur de dioxyde de carbone	Vyaire	8570043
Mersutures 0	Ethicon	F2520
Microtome	LEICA RM2255
Miller Blade	Opticlar	600.020
Concentrateur d’oxygène	DeVilbiss	525KS
Paxman (xylazine)	Moniteur
	Mindray	IPM 10
Poignées de laryngoscope réutilisables	Opticlar	600.080
Ventilateur d’anesthésie pour petits animaux	Midmark	91806001
Injection de chlorure de sodium Viaflo	Baxter
Instruments chirurgicaux	Kohler medizintechnik
Table chirurgicale	Vetinox	TA700005
Tube trachéal	Smiths Medical	100/179/070
Vicryl 2-0	Ethicon	JV453
VMS	Midmark	91800003
Matériaux et réactifs
DMEM F-12 moyen	ThermoFischer	11320033
Anticorps anti-parahormone	SantaCruz	sc-398856
Dosage peropératoire rapide de la pth	Beckman Coulter	A16972

vétérinaire multiparamètre portable Virbac