Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon de construire, de stériliser, d’assembler, d’utiliser et de réutiliser les colonnes d’autoroutes fongiques pour enrichir les paires bactéries-fongiques interagissant par le biais d’autoroutes fongiques à partir de divers substrats environnementaux.
Article de méthode
Étude des interactions bactéries-fongiques à l’aide de colonnes d’autoroutes fongiques dans divers environnements et substrats
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les interactions bactéries-fongiques (IAB) jouent un rôle essentiel dans la composition des communautés microbiennes, les fonctions biogéochimiques, la dynamique spatiale et la dispersion microbienne. Les réseaux mycéliens créés par des champignons filamenteux ou d’autres micro-organismes filamenteux (par exemple, les oomycètes) agissent comme des « autoroutes fongiques » qui peuvent être utilisées par les bactéries pour se déplacer dans des environnements hétérogènes, facilitant grandement leur mobilité et leur donnant accès à des régions qui peuvent être difficiles ou impossibles à atteindre par elles-mêmes (par exemple, en raison des poches d’air dans le sol). Plusieurs appareils et protocoles expérimentaux ont été créés pour étudier ces autoroutes fongiques, y compris les colonnes d’autoroutes fongiques. La colonne d’autoroute fongique conçue par notre groupe peut être utilisée pour une variété d’applications in situ ou in vitro , ainsi qu’avec divers types d’échantillons environnementaux et associés à l’hôte. Nous décrivons ici les méthodes d’exécution d’expériences avec ces colonnes, y compris la conception, l’impression, la stérilisation et la préparation des dispositifs. Les options d’analyse des données obtenues grâce à l’utilisation de ces appareils sont également abordées ici, et des conseils de dépannage concernant les pièges potentiels associés aux expériences utilisant des colonnes d’autoroutes fongiques sont proposés. Ces dispositifs peuvent être utilisés pour acquérir une compréhension plus complète de la diversité, des mécanismes et de la dynamique des BFI fongiques des autoroutes afin de fournir des informations précieuses sur la dynamique structurelle et fonctionnelle dans des environnements complexes (par exemple, les sols) et dans divers habitats dans lesquels les bactéries et les champignons coexistent.
Introduction
Les interactions bactéries-fongiques (IAB) sont extrêmement importantes dans la formation des propriétés structurelles, spatiales et fonctionnelles des microbiomes environnementaux. Par exemple, la croissance et l’expansion de champignons filamenteux ou d’autres micro-organismes filamenteux semblables à des champignons génèrent un réseau biologique qui peut fonctionner comme une « autoroute » pour faciliter le mouvement d’autres micro-organismes, tels que les bactéries. L’hétérogénéité et la saturation incohérente au sein des substrats environnementaux peuvent entraver la motilité bactérienne ; Cependant, les bactéries peuvent utiliser ces autoroutes pour faciliter l’accès à d’autres zones de l’environnement 1,2. Ces interactions sont essentielles à la compréhension de la dynamique spatiale des communautés microbiennes. Plusieurs techniques et méthodes ont été utilisées pour examiner les autoroutes fongiques, mais elles sont largement limitées à des enquêtes en laboratoire 3,4.
Dans une méthode basée sur une plaque, une grande section de gélose est retirée du milieu de la boîte de Pétri, créant un espace entre deux îlots de gélose. Les hyphes fongiques peuvent traverser cet espace, fournissant les moyens aux bactéries compatibles de passer d’une île de gélose à l’autre5. D’autres méthodes modifiées de boîte de Petri comprennent des plaques inversées où la terre est placée dans le couvercle afin que les hyphes fongiques puissent se développer verticalement et coloniser le milieu sans contact direct, fournissant ainsi les moyens de transport bactérien 5,6. Une méthode basée sur des gouttelettes de milieu de croissance qui a récemment été mise au point peut être utilisée pour évaluer le transport sélectif des hyphes des bactéries vers certains profils nutritionnels7. Des dispositifs de pont et de traînée bactériens ont également été utilisés pour étudier l’effet des facteurs abiotiques sur le mouvement bactérien8. Bien que plusieurs méthodes et techniques aient été utilisées pour étudier les autoroutes fongiques, il reste nécessaire de disposer d’appareils normalisés qui maintiennent un microenvironnement stérile tout en favorisant l’établissement de routes fongiques à partir de substrats environnementaux complexes tels que le fumier, le sol et les rhizosphères.
Notre groupe a conçu une version imprimée en 3D de colonnes d’autoroutes fongiques où les champignons peuvent transporter les bactéries d’un bout à l’autre9. Ces dispositifs sont assemblés à partir de quatre composants imprimés : la colonne elle-même en forme de sablier et une structure en treillis interne complexe, un anneau fileté et deux capuchons (un grand capuchon et un petit capuchon), ainsi qu’un morceau de maille de nylon stérilisé (Figure 1). La colonne assemblée est ajoutée directement au substrat environnemental souhaité. La colonne permet ensuite aux microbes de coloniser un bouchon de milieu de croissance gélosé connu sous le nom de bouchon de milieu « appât » qui se trouve au bas de la colonne et en contact avec le substrat environnemental à travers le maillage. Cette pièce de maille de nylon exclut les autres habitants du sol qui peuvent transporter des bactéries, limitant ainsi le mouvement des bactéries à l’intérieur des colonnes vers les autoroutes fongiques. Une fois que ce bouchon d’appât a été colonisé, les champignons filamenteux peuvent s’étendre et se développer à travers le treillis intérieur au centre de la colonne qui est conçu pour créer un système non saturé qui ressemble à de la terre (ou à d’autres milieux insaturés) et minimiser la contamination potentielle du milieu d’appât. Les champignons se développent ensuite vers le mottes de milieu cible en haut de la colonne et le colonisent. Les colonnes peuvent soit être inoculées avec des isolats fongiques spécifiques pour tester leur capacité à transporter des bactéries, soit être laissées non inoculées pour identifier les champignons du substrat capables de transporter des bactéries. Les organismes qui atteignent le milieu cible peuvent être cultivés, isolés et soumis à des analyses de séquençage (soit à partir de cultures pures, soit à partir de communautés mixtes à l’aide d’approches de séquençage d’amplicons ou métagénomiques). Dans l’ensemble, les colonnes fournissent une méthode standardisée, reproductible, réutilisable et intuitive pour interroger les autoroutes fongiques dans divers substrats. Ces appareils peuvent être utilisés pour la recherche et comme outil d’enseignement en classe, et dans ce document, nous fournissons des étapes pédagogiques pour leur utilisation basées sur les expériences qui ont été réalisées dans le passé. Bien que cette méthode facilite la normalisation des protocoles, la conception et la construction des dispositifs peuvent être modifiées pour d’autres applications et substrats supplémentaires.
Protocole
Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Modification de la conception de la colonne, des matériaux et des paramètres
- Téléchargez les conceptions de colonnes9 accessibles au public et utilisez-les telles quelles ou modifiez-les dans un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) compatible.
- Procurez-vous de la résine de guidage chirurgical dentaire ou sélectionnez un autre matériau d’impression 3D, tel que d’autres résines transparentes photosensibles.
- Ajustez les spécifications de la colonne si nécessaire si l’imprimante 3D, la technologie d’impression 3D ou le matériau d’impression 3D choisi est modifié par rapport à ce qui a été utilisé précédemment9.
2. 3D’impression des colonnes
- Réglez les paramètres d’impression pour utiliser une épaisseur de tranche de 0,05 mm et un temps d’exposition de 0,8 s, ou ajustez les paramètres d’impression en fonction de l’imprimante, du matériau d’impression et du logiciel d’impression sélectionnés.
- Imprimez les colonnes d’autoroute, les anneaux filetés et les capuchons à l’aide d’une imprimante 3D compatible (Figure 1).
Figure 1 : Composants de la colonne fongique de la route. (A,B) Vues de dessus et de côté du petit capuchon, de l’anneau fileté et du grand capuchon (de gauche à droite). (C, D) Vue de dessus et de côté de la petite casquette. (E, F) Vue de dessus et de côté de l’anneau fileté. (G,H) Vue de dessus et de côté de la grande calotte. (I) Une pièce de filtre à mailles en nylon (25 μm) placée à l’extrémité de la colonne, et insérée dans le substrat environnemental pour empêcher la microfaune de pénétrer dans la colonne. (J) Colonne non montée. (K) Colonne assemblée : l’extrémité « appât » va dans le substrat, et l’extrémité « cible » reste découverte et hors du substrat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Nettoyage des composants de la colonne imprimés en 3D
- Immergez les colonnes, les capuchons et les anneaux filetés imprimés dans de l’alcool isopropylique à 99 % à température ambiante pendant 15 minutes et agitez en déplaçant le bain d’avant en arrière à la main pendant 10 à 15 s toutes les minutes pour éliminer l’excès de résine.
- Transférez les composants dans un bain d’alcool isopropylique frais à 99 %. Immerger pendant 5 minutes et agiter à la main de la même manière qu’à l’étape 3.1.
- Transférez les composants dans un appareil de nettoyage à ultrasons rempli d’eau pure, immergez-les et agitez pendant 2 minutes à vitesse moyenne. Ne chauffez pas l’eau. Retirez les composants.
- Faites sécher tous les composants à l’air libre pendant au moins 30 min.
- Pour effectuer la post-polymérisation de la résine, exposez tous les composants imprimés en 3D à une lumière de 405 nm pendant 30 min à 60 °C.
4. Stérilisation des colonnes
- Si le matériau choisi est autoclavable, autoclavez les colonnes, les anneaux filetés, les capuchons et les feuilles de filtre à mailles en nylon de 25 μm individuellement ou dans un bécher plus grand pendant 20 à 30 min à 121 °C, 1 atm.
REMARQUE : Les composants de la colonne peuvent changer de forme et de couleur après l’autoclavage, mais ils conserveront les propriétés de matériau souhaitées. La taille, la forme et la couleur finales des composants de la colonne après autoclave sont illustrées à la figure 1.
5. Préparation des supports pour les colonnes
- Préparez des boîtes de Pétri de 90 mm à partir de milieux à base de gélose stérilisée : soit un milieu de carboxyméthylcellulose sodique (CMC), soit une gélose à l’extrait de malt (MEA), soit une gélose au dextrose de pomme de terre (PDA), soit une gélose 2A de Reasoner (R2A)9,10. Préparez le support en suivant les instructions du fabricant.
- Stériliser le milieu à l’autoclave pendant 21 minutes ou pendant la durée recommandée par le fabricant à 121 °C, 1 atm, et verser dans des boîtes de Pétri de 90 mm jusqu’à ce que la gélose soit près du haut des côtés des boîtes de Pétri (figure 2). Effectuez cette étape dans une enceinte de sécurité biologique pour augmenter la stérilité.
- Laisser la gélose se solidifier et sécher selon les instructions du fabricant.
Figure 2 : Processus d’assemblage des colonnes d’autoroutes fongiques. À l’aide d’une extrémité ouverte de la colonne elle-même, un bouchon est découpé et inséré, et le chercheur tord la colonne au fur et à mesure qu’elle est retirée du support pour s’assurer que le bouchon reste à l’intérieur de l’extrémité de la colonne. Cette extrémité est coiffée par le petit bouchon. Une prise de média est ensuite ajoutée à l’autre extrémité de la colonne de la même manière. La pièce de maille est ensuite placée sur cette extrémité et fixée avec l’anneau fileté. Le grand capuchon est ensuite utilisé à l’extrémité de cet appât sur l’anneau fileté. Le côté avec le treillis sera placé dans le substrat environnemental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
6. Préparation des colonnes d’autoroutes fongiques
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité des composants de la colonne et du milieu. La figure 2 illustre le processus d’assemblage de la colonne fongique de la route.
- Utilisez l’extrémité de la colonne elle-même (sans aucun capuchon) pour extraire un bouchon de support qui s’insère étroitement à une extrémité de la colonne. Utilisez un mouvement de torsion lorsque la colonne est soulevée du support afin que la gélose reste à l’intérieur de l’extrémité de la colonne. Vous pouvez également utiliser l’extrémité de la colonne comme modèle, découper le support et le transférer dans la colonne à l’aide d’une pointe de pipette.
- Une fois le premier bouchon ajouté à l’extrémité de la colonne, ajoutez le petit capuchon à cette extrémité pour maintenir un microenvironnement stérile pour le milieu cible.
- Retournez la colonne et répétez l’étape 6.1 pour l’autre extrémité de la colonne.
- Coupez un morceau circulaire de ~2 cm de diamètre de la maille de nylon autoclavée (taille des pores de 25 μm) à l’aide de ciseaux stérilisés (Figure 1). Posez le treillis sur l’extrémité exposée de la colonne. Tournez l’anneau fileté sur cette extrémité du support d’appât de la colonne tout en fixant le treillis à l’intérieur des fils.
- Placez le grand capuchon au bas de la colonne sur le treillis et l’autre extrémité de l’anneau fileté, et maintenez ce capuchon lorsque vous stockez ou transportez la colonne.
7. Pré-inoculation du substrat ou du milieu d’appât avec un champignon d’intérêt
REMARQUE : Cette étape est facultative.
- Inoculer un champignon d’intérêt (p. ex., un champignon connu pour créer des autoroutes fongiques) sur le substrat désiré en cultivant d’abord le champignon sur un milieu de croissance fongique solide (p. ex., MEA, PDA ; préparé comme décrit à l’étape 5) dans une boîte de Pétri et en transférant une petite section (~1 cm) de gélose avec une croissance fongique visible sur le substrat.
REMARQUE : Des expériences antérieures9 ont utilisé un substrat de fumier précolonisé avec Coprinopsis cinerea pendant 10 jours avant d’ajouter les colonnes au substrat précolonisé. - Au lieu de pré-coloniser le substrat, ajoutez un champignon d’appât dans une boîte de Pétri ou directement au fond du milieu d’appât à l’intérieur de la colonne en utilisant une petite quantité de mycélium fongique (p. ex., à partir du glissement d’une boucle stérile).
- Pour la boîte de Pétri, attendez qu’il y ait une croissance visible couvrant une grande partie de la boîte de Pétri (environ 50 % à 75 % de la plaque couverte), puis éradiquez la section du milieu d’appât directement de la boîte de Pétri colonisée la plus proche du bord extérieur de la croissance fongique (comme décrit à l’étape 6.1).
- Lorsque vous précolonisez directement le milieu d’appât, attendez qu’il y ait une croissance claire dans tout le milieu d’appât avant d’ajouter la colonne au substrat (cela prendra probablement plusieurs jours).
REMARQUE : Des expériences antérieures9 ont utilisé des milieux de 14 jours précolonisés avec C. cinerea comme milieu d’appât ; Les périodes de pré-colonisation varient en fonction du taux de croissance du champignon, du type de milieu et des conditions d’incubation.
8. Préparation des traitements de contrôle et des réplications
- Préparez des colonnes de contrôle négatif (comme décrit aux étapes 1 à 6), ne les inoculez pas et ne placez pas ces colonnes dans le substrat. Utilisez-les pour fournir une base de référence pour les analyses ultérieures et pour évaluer toute contamination dans le processus de préparation.
- Incluez au moins trois répétitions de colonnes pour chaque expérience.
9. Ajout de la colonne au substrat
- Mettre en place un microcosme de laboratoire (p. ex., sol dans une boîte, un pot ou un tube ; Graphique 3A) ou apportez les colonnes à un site de terrain d’intérêt.
- Retirez le grand capuchon du bas de la colonne pour exposer l’anneau fileté et le treillis.
- Ajoutez la colonne au substrat d’intérêt (figure 3) en suivant les considérations spécifiques à chaque type de substrat décrites ci-dessous. Si nécessaire, et pour minimiser les dommages au treillis, faites une dépression dans le substrat à l’aide d’une main gantée ou d’un petit outil (par exemple, une petite truelle) avant d’insérer la colonne dans le substrat.
- Excréments : Les colonnes étaient auparavant utilisées avec succès dans le fumier de cheval frais. Stockez le fumier à 4 °C avant de l’utiliser et ajoutez-le dans des chambres, telles que des boîtes Magenta, avant d’ajouter les colonnes. Insérez la colonne dans le substrat pour couvrir 1 à 2 cm de la hauteur totale de la colonne.
- Sol : Insérez les colonnes de manière à ce que toute la partie inférieure soit à l’intérieur du sol (~1 à 2 cm de profondeur du sol) (figure 3B). Les colonnes peuvent reposer sur le dessus du sol ou être enterrées jusqu’à juste en dessous du petit capuchon du côté cible.
- Rhizosphère : Insérez les colonnes dans le sol entourant les racines des plantes comme indiqué à l’étape 9.3.2 tout en inclinant et en plaçant la colonne près de certaines racines pour augmenter les chances de capturer les microorganismes de la rhizosphère (figure 3C).
- Substrats à l’intérieur des tubes : Ajouter ~10 mL d’un substrat d’intérêt à un tube conique de 50 mL ou similaire et mouiller le substrat si désiré (p. ex., dans des environnements à très faible humidité) avec de l’eau pure. Insérez la colonne dans le tube de manière à ce que le fond soit enterré et qu’aucune partie de l’anneau fileté ou du treillis ne soit visible (Figure 3A). Vissez le couvercle du tube de 50 ml et placez-le dans un support de tube de 50 ml pour le maintenir en position verticale.
10. Sortie de la colonne dans le substrat
- Laissez la colonne dans le substrat pendant 3 à 21 jours.
REMARQUE : La durée pendant laquelle les colonnes doivent être laissées dans leur substrat dépend du taux de croissance des champignons appâts utilisés, du taux de croissance des champignons qui colonisent le milieu d’appât et des conditions environnementales (p. ex., les conditions sèches entraînent une dessiccation plus rapide du milieu et ne peuvent donc pas être utilisés aussi longtemps). - Établir un cycle lumière/obscurité souhaité pour l’expérience ; Des expériences antérieures ont maintenu les colonnes du laboratoire dans l’obscurité, tandis que les colonnes sur le terrain ont été soumises aux conditions locales jour/nuit9.
11. Retrait de la colonne du substrat
- Une fois que la colonne a été en contact avec le substrat pendant la durée souhaitée, retirez la colonne, secouez soigneusement tout excès de substrat et rajoutez le grand capuchon au bas de la colonne sous le treillis pour transporter la colonne.
- Placez la colonne dans un bécher stérile ou un tube de 50 ml pour le transport. Gardez la colonne droite pendant le transport.
12. Culture des isolats à partir du milieu cible de la colonne
- Dans un environnement stérile tel qu’une enceinte de sécurité biologique, retirez le grand capuchon du milieu d’appât, l’anneau fileté et le grillage. Jetez le maillage.
REMARQUE : Si un chercheur s’intéresse aux organismes qui ont colonisé le milieu d’appât, il doit suivre les étapes 12.3 à 12.4 avec la prise de milieu d’appât en plus de la prise de milieu cible. - Retirez le petit capuchon de l’extrémité de la colonne contenant le fluide cible.
- Retirez le bouchon du milieu cible en retournant la colonne pour permettre au bouchon cible de tomber hors de la colonne, ou en utilisant des pinces stérilisées ou des pointes de pipette pour extraire le bouchon. Placez le bouchon du milieu cible directement au centre d’une boîte de Pétri de 90 mm remplie d’un milieu gélosé de votre choix (comme préparé à l’étape 5).
REMARQUE : Des milieux fongiques ou bactériens spécifiques peuvent être utilisés ici pour améliorer la croissance des membres de l’un ou l’autre règne ; Le bouchon peut également être divisé en deux ou plusieurs morceaux à l’aide de ciseaux stérilisés ou d’une pointe de pipette, ce qui permet de placage sur plusieurs types de milieux et/ou de préserver les milieux cibles pour les extractions d’ADN (voir étape 14). - Incuber la boîte de Pétri inoculée avec le bouchon de milieu cible pendant au moins 72 h à 25 °C dans l’obscurité.
13. Sous-culture pour isoler les micro-organismes
REMARQUE : Cette étape est facultative.
- Pour les bactéries : À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, balayez une seule colonie d’intérêt tout en minimisant le contact avec d’autres zones de la boîte de Pétri. Étalez la colonie sur une boîte de Pétri fraîche de 90 mm contenant le milieu bactérien préféré, tel que R2A (tel que préparé à l’étape 5), en utilisant n’importe quelle méthode qui permet la formation de colonies uniques (p. ex., en striant en quatre zones). Incuber la boîte de Pétri pendant 24 à 72 h à 25-37 °C, en vérifiant la croissance des colonies.
- Pour les champignons : À l’aide d’une anse d’inoculation stérile, d’un rasoir stérile ou d’une pointe de pipette stérile, découpez une section minimale (1 mm2) de gélose contenant une croissance hyphale. Placez le petit morceau de gélose sur une boîte de Pétri fraîche de 90 mm contenant le milieu fongique préféré, tel que le MEA ou le PDA, comme préparé à l’étape 5. Incuber la boîte de Pétri jusqu’à une semaine à 25 °C dans l’obscurité, en vérifiant quotidiennement pour éviter la prolifération.
- Répétez l’étape 1 ou l’étape 2 si nécessaire jusqu’à ce que la morphologie des organismes soit uniforme.
14. Extraction de l’ADN de la plaque ou directement du milieu cible
- Congeler les bouchons de gélose entiers (cible et/ou appât) ou les morceaux sélectionnés des colonnes dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL à -20 °C ou immerger des morceaux de mottes dans un agent de préservation dans un tube à centrifuger de 1,5 mL avant l’extraction si les extractions n’ont pas lieu immédiatement.
- Si l’élevage à partir du milieu cible et/ou de l’appât a été effectué, et si des étapes de sous-culture ultérieures ont été prises, estampiller ou découper un morceau de gélose de ~1 cm avec une croissance fongique ou bactérienne (ou un mélange des deux si les étapes d’isolement ultérieures n’ont pas été prises).
- Pour l’extraction de colonies bactériennes isolées, balayez une colonie de la plaque à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile et faites-la tourner directement dans le tampon d’extraction associé à la trousse d’extraction d’ADN commerciale (étape 14.4).
- Broyez les morceaux de gélose séparément dans de l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon et transférez les tissus broyés dans des tubes d’extraction.
- Utilisez un kit d’extraction d’ADN commercial optimisé pour le sol ou les bactéries et les champignons, et suivez les instructions du fabricant pour extraire l’ADN (voir la table des matériaux).
- Quantifiez l’ADN résultant à l’aide d’un fluorimètre ou d’un système comparable.
15. Évaluation de la diversité taxonomique microbienne dans le milieu cible et/ou l’appât à l’aide d’approches de séquençage d’amplicons ou métagénomiques
- Effectuez soit le séquençage d’amplicons (16S et/ou espaceur transcrit interne [ITS]), soit le séquençage métagénomique en suivant les étapes ci-dessous :
- Séquençage d’amplicon : Amplifiez la région du gène de l’ARNr V3-V4 16S à l’aide des amorces Bakt 341F (5′-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3′) et Bakt 805R (5′-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3′). Amplifiez la région fongique ITS2 à l’aide des amorces ITS3 KYO2 (5′-GAT GAA GAA CGY AGY RAA-3′) et ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)9.
- Préparez des banques d’amplicon à l’aide de kits de préparation de bibliothèques commerciaux compatibles avec le séquenceur choisi. Séquencez les amplicons à l’aide d’un séquenceur à lecture courte pour générer des lectures d’extrémités appariées de 150 ou 250 paires de bases avec une couverture suffisante en suivant les instructions du fabricant de la plate-forme de séquençage pour la concentration de chargement.
- Séquençage métagénomique : Créez une banque métagénomique à partir de l’ADN extrait à l’aide d’un kit de préparation de banque métagénomique disponible dans le commerce et compatible avec le séquenceur choisi. Séquencez la bibliothèque de métagénomes à l’aide d’un séquenceur à lecture courte réglé pour générer 150 ou 250 paires de paires de bases avec une couverture suffisante (~10-20 Go par métagénome) en suivant les instructions du fabricant de la plate-forme de séquençage pour la concentration de chargement.
16. Analyse des données de séquençage
- Analyser les données d’amplicon : Utilisez la plateforme QIIME2 11 avec DADA212 pour analyser les données d’amplicon avant de visualiser les résultats13. Suivez les étapes ci-dessous pour exécuter QIIME2 dans la plateforme bioinformatique Web EDGE (Empowering the Development of Genomics Expertise)14. QIIME2 peut également être exécuté à l’aide de tutoriels accessibles au public, tels que le guide « Moving Pictures » fourni en ligne (https://docs.qiime2.org/2024.2/tutorials/moving-pictures/).
- Accédez à https://edgebioinformatics.org/ et connectez-vous ou créez un compte.
- Sélectionnez RUN QIIME2 sur la page d’accueil. Sélectionnez Télécharger des fichiers dans la barre de menu de gauche pour télécharger des fichiers à partir des exécutions de séquençage d’amplicons.
- Créez un fichier de mappage de métadonnées en suivant les instructions fournies lorsque le « i » à côté de « Fichier de mappage de métadonnées » est survolé.
- Ajoutez toutes les informations requises (nom du projet/de l’exécution, type de lecture, paramètres, etc.) et sélectionnez les données d’entrée correctement téléchargées. S’assurer que DADA2 est sélectionné comme méthode de contrôle de la qualité12 ; Les autres paramètres peuvent être conservés comme valeurs par défaut, sauf si d’autres modifications sont souhaitées.
- Sélectionnez le type d’amplicon 16S Greengenes (http://greengenes.lbl.gov) pour les amplicons bactériens ou Fungal ITS pour les amplicons fongiques. Analysez les données bactériennes (16S) et fongiques (ITS) de manière indépendante.
- Appuyez sur Soumettre et attendez la fin de l’exécution pour afficher les résultats.
- Générer des visualisations de données d’amplicon (facultatif) : effectuez des analyses de données de communauté supplémentaires dans R à l’aide de packages courants tels que phyloseq (https://github.com/joey711/phyloseq), VEGAN (https://github.com/vegandevs/vegan) et APE (https://emmanuelparadis.github.io/) en suivant les instructions fournies dans GitHub et via l’aide du package R disponible dans R Studio en accédant au menu Packages , en cliquant sur le package téléchargé et en consultant la documentation.
- Analyser les données métagénomiques
- Accédez au site NMDC EDGE 15 (https://nmdc-edge.org/home) et connectez-vous à l’aide d’un compte ORCiD (https://orcid.org/).
- Sélectionnez Télécharger des fichiers dans la barre de menu sur le côté gauche de l’écran et faites glisser et déposez ou recherchez le(s) fichier(s) FASTQ d’entrée correct(s).
- Sélectionnez Métagénomique, puis l’option Exécuter plusieurs flux de travail dans la barre de menu sur le côté gauche de l’écran, puis définissez tous les flux de travail sur Activé. Ajoutez un nom de projet et une description facultative.
- Sélectionnez le(s) fichier(s) de lecture brute (fastq) téléchargé(s) et sélectionnez le format de fichier approprié (entrelacé ou apparié).
- Démarrez l’exécution en cliquant sur Soumettre et en affichant les tableaux récapitulatifs et les visualisations une fois l’exécution terminée en sélectionnant le projet dans l’onglet Mes projets en haut de l’écran.
17. Création de visualisations supplémentaires de données de taxonomie à partir d’amplicon et/ou de résultats métagénomiques
- Générez des cladogrammes circulaires à l’aide du package GraPhlAn (https://github.com/biobakery/graphlan) en suivant les instructions fournies dans GitHub.
REMARQUE : Les identificateurs de taxonomie (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy) du National Center for Biotechnology Information (NCBI) peuvent être obtenus à partir d’attributions de séquences représentatives et transmis au programme « eftech » des E-utilities Entrez Direct pour recueillir les informations de cumul de taxonomie requises par GraPhlan16.
18. Réutilisation des colonnes
- Si les colonnes sont toujours assemblées, dévissez et retirez les capuchons, l’anneau fileté et le treillis. Jetez le maillage. Retirez tous les bouchons de gélose restants, lavez les colonnes avec de l’alcool isopropylique à 99 % et de l’eau purifiée, et nettoyez et séchez les composants comme décrit aux étapes 3.1 à 3.4.
- Préparez de nouvelles feuilles de maille de nylon à autoclaver.
- Autoclavez les composants en suivant les instructions fournies à l’étape 4.1.
Résultats
La colonne d’autoroute fongique entièrement assemblée mesure environ 5 cm de longueur (figure 1). La colonne ne doit être cassée dans aucun endroit, et les capuchons et l’anneau fileté doivent s’emboîter facilement et étroitement pour créer des microenvironnements à l’intérieur de la colonne. La maille du filtre peut s’étendre au-delà de l’anneau fileté (comme illustré à la figure 1 et à la figure 2), ou elle peut être coupée avec des ciseaux stérilisés. Les bouchons de gélose doivent être bien ajustés à chaque extrémité de la colonne. Lorsqu’elle est placée dans le substrat, la maille filtrante doit entrer en contact avec le substrat et la colonne ne doit pas être complètement enterrée.
Les colonnes ont déjà été testées dans du fumierde cheval 9. Les colonnes ont également été placées dans du sol en vrac et de la rhizosphère sur un terrain de recherche, ainsi que dans de petits volumes de sol dans des tubes de 50 mL en laboratoire (figure 3). Une fois que les colonnes fongiques de la route ont été retirées du substrat et démontées, la croissance microbienne était visible sur l’appât et les bouchons du milieu cible (exemples illustrés à la figure 4A). Les bactéries et les champignons ont été isolés des milieux cibles et des amorces à l’aide de techniques de sous-culture (figure 4B), et les microbes présents sur les bouchons de milieu ont été identifiés taxonomiquement à l’aide du séquençage d’amplicons (figures 4C et D). Les figures 4C et D représentent les résultats combinés du séquençage des amplicons dans plusieurs expériences, montrant quels microbes ont pu atteindre le bouchon du milieu cible à partir de colonnes ajoutées à la bouse de cheval9. Des visualisations de ces données bactériennes et fongiques ont été générées comme indiqué à l’étape 17. Les résultats peuvent également être présentés sous forme d’abondances relatives de taxons.
Des résultats sous-optimaux ont été obtenus dans des cas où les colonnes ont été ajoutées à des environnements extrêmement peu humides, et les bouchons de média ont été complètement desséchés en quelques jours, ce qui n’a entraîné aucune récupération des microbes colonisés (Figure 5A). Nous avons également vu des cas où les microbes ne se développent tout simplement pas à partir du bouchon du milieu cible (figure 5B), et des cas où nous ne récupérons pas suffisamment de données de séquençage du bouchon du milieu cible pour des analyses significatives. D’autres cas où des champignons prolifèrent hors des colonnes ont également entraîné la nécessité de refaire les expériences (Figure 5C).
Figure 3 : Exemples de colonnes placées dans des échantillons environnementaux en laboratoire et sur le terrain. (A) Colonne placée à l’intérieur d’un tube de 50 mL avec un sol humidifié en laboratoire. Également illustré avec une règle pour l’échelle. (B) Colonne placée dans le sol dans le champ. (C) Colonne placée dans le réseau racinaire d’une plante dans le champ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats représentatifs d’expériences réussies sur colonnes. (A) Exemples de bouchons de médias colonisés extraits de colonnes. (B) Exemples d’isolats fongiques sous-cultivés à partir de milieux cibles. Le substrat était de la terre. Séquence ITS du haut Identité NCBI BLAST de gauche à droite : Rhizopus azygosporous, Aspergillus novofumigatus, Curvularia subpapendorfii et Phaeomycocentrospora cantuariensis. (C,D) Cladogrammes circulaires montrant la diversité phylogénétique de (C) séquences fongiques ITS et (D) bactériennes 16S récupérées dans le milieu cible à la suite de multiples expériences sur des autoroutes fongiques utilisant de la bouse de cheval. Les sections sont colorées et étiquetées par embranchement, les nœuds finaux représentant des genres uniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 5. Résultats sous-optimaux des expériences en colonne. (A) Un exemple de bouchon de média desséché résultant de conditions environnementales de faible humidité. (B) Exemple d’absence de croissance microbienne à partir d’un bouchon de support de colonne. (C) Exemple de prolifération du champignon par le haut (milieu cible) de la colonne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Lors de la génération des composants de la colonne, la sélection d’une imprimante 3D et du matériau d’impression peut être modifiée en fonction de la disponibilité et des propriétés du matériau souhaitées17,18. La biocompatibilité, la texture de surface, l’autoclavabilité, la capacité d’imprimer des détails à petite échelle et la transparence relative ont toutes été prises en compte dans la sélection des matériaux de notre groupe. D’autres caractéristiques, telles que la porosité, l’hydrophobie, les paramètres d’impression, etc., doivent également être prises en compte. Diverses résines ont été testées (voir la table des matériaux) avant la sélection finale, et de nombreux matériaux biocompatibles fonctionneront pour l’impression de ces colonnes. Le matériau choisi pour la construction des composants de la colonne déterminera les approches de nettoyage, de post-polymérisation et de stérilisation à utiliser. Tous les matériaux ne seront pas autoclavables, et la lumière ultraviolette, l’eau de Javel ou d’autres techniques de stérilisation peuvent être nécessaires, selon les instructions du fabricant du matériau. Certaines techniques de stérilisation ou de nettoyage peuvent également endommager ou ne pas être compatibles avec le matériau choisi, une attention particulière doit donc être accordée à ces informations par le fabricant du matériau. Pour les imprimantes 3D, certaines considérations incluent le temps d’impression, la compatibilité des matériaux, la taille de la plate-forme de construction, la technologie d’impression et le coût19. Les composants imprimés en 3D des colonnes peuvent être fragiles et se casser s’ils sont manipulés avec trop de force. Le filetage de l’anneau et des capuchons peut ne pas toujours s’aligner exactement, c’est pourquoi nous recommandons d’imprimer et de stériliser les composants supplémentaires avant l’étape d’assemblage, ou de procéder à une impression préliminaire pour tester comment les paramètres et le matériau choisis affectent le filetage. Les spécifications de conception pour le filetage à l’intérieur des capuchons et de l’anneau peuvent devoir être ajustées en fonction du matériau d’impression 3D choisi. Les dimensions, la complexité du treillis et d’autres caractéristiques physiques peuvent toutes être modifiées dans un logiciel de conception CAO avant l’impression. Comme conçu, la colonne elle-même mesure 4 cm de haut et la structure en treillis au centre de la colonne a une cellule unitaire de 2 mm, un diamètre d’entretoise de 0,5 mm et la hauteur totale du treillis est de 22 mm9. Ces paramètres peuvent être ajustés si un chercheur souhaite, par exemple, une structure en treillis plus grande ou plus complexe. Dans l’ensemble, la fabrication imprimée en 3D de ces appareils permet une flexibilité de conception tout en garantissant qu’un seul design peut être utilisé de manière standardisée dans toutes les organisations et tous les groupes, et même utilisé comme outil d’enseignement en classe9.
Plusieurs étapes du protocole peuvent nécessiter un dépannage en fonction de l’environnement ou de la configuration expérimentale. Les colonnes fongiques d’autoroute ne sont pas très efficaces dans des conditions de faible humidité, car les bouchons de média se dessèchent rapidement avant de faciliter la croissance fongique, ce qui peut limiter la durée des expériences dans ces environnements (Figure 5A). Les techniques qui ont amélioré l’efficacité des colonnes dans les environnements à faible humidité comprennent l’augmentation artificielle de l’humidité par l’ajout d’humidité au substrat et/ou le scellement de la colonne et du substrat dans un récipient secondaire avec une source d’eau (p. ex., un petit récipient d’eau pure). La forme du sablier et la structure en treillis ont été incorporées pour empêcher le mouvement bactérien seul (sans l’établissement d’une autoroute fongique) si de la condensation devait se former dans des environnements très humides. Les champignons à croissance rapide peuvent envahir la surface du milieu cible et de l’appât et s’étendre au-delà du haut ou du bas de la colonne (figure 5C). La diminution du temps d’incubation du champignon appât ou de la durée de l’expérience peut minimiser ou éliminer cette prolifération excessive. De plus, l’une des limites de ces dispositifs est que les champignons à croissance rapide dans le substrat d’intérêt peuvent limiter la colonisation des appâts et des milieux cibles par des champignons à croissance lente, ce qui peut biaiser les interactions routières observées. Certains champignons, en particulier les champignons à croissance lente, peuvent ne pas coloniser le milieu d’appât de manière à leur permettre de se développer à travers le bouchon de gélose et dans la structure du treillis. S’il y a suffisamment d’humidité dans l’environnement, des bouchons de gélose plus minces peuvent être utilisés pour encourager la croissance dans le réseau après la colonisation du bouchon de gélose d’appât. Les milieux peuvent être choisis selon qu’un chercheur souhaite sélectionner la croissance fongique ou bactérienne, mais cela peut également limiter la sous-culture aux organismes qui préfèrent ce typede milieu 20. Si aucune croissance n’est observée dans le milieu cible, il peut être nécessaire d’inoculer le milieu d’appât ou le substrat avec un champignon connu pour créer des autoroutes fongiques.
Le séquençage métagénomique ou d’amplicon peut être effectué dans le cadre de ces expériences, et ces deux stratégies confèrent leurs propres limites et forces21. Le séquençage métagénomique est idéal pour obtenir des informations génomiques supplémentaires sur les microbes. Cependant, la quantité récupérable d’acides nucléiques directement à partir du milieu cible peut être très faible, ce qui peut nécessiter l’utilisation du séquençage d’amplicon ou d’autres méthodes d’amplification avant le séquençage. Les banques de séquençage d’amplicons doivent être préparées séparément (16S et ITS), et cette méthode manque de résolution taxonomique et limite toute évaluation des caractéristiques du génome ou du potentiel fonctionnel qui peut être obtenue à l’aide du séquençage métagénomique. Les méthodes de séquençage direct à partir des mottes peuvent être préférées dans les cas où les microbes ne peuvent pas être sous-cultivés. Il est recommandé de diviser les bouchons en plusieurs sections pour permettre les approches de culture et de séquençage.
L’un des avantages de ces appareils est qu’ils peuvent être utilisés à la fois en laboratoire et sur le terrain. Des précautions particulières doivent être prises pour s’assurer que les colonnes dans le champ peuvent rester verticales et sont protégées des animaux et des perturbations environnementales qui pourraient perturber leur position. Les colonnes n’ont pas encore été testées en position horizontale, dans une position où elles sont entièrement recouvertes d’un substrat, et elles n’ont pas été testées dans des environnements exposés à des précipitations ou à de la neige importantes. Comme indiqué ci-dessus, la structure en treillis a été conçue pour minimiser la probabilité que les bactéries puissent se déplacer vers le milieu cible dans des environnements très humides. Cependant, il est possible que si la colonne était exposée à de plus grands volumes d’eau et que cette eau saturait complètement la colonne, le mouvement bactérien serait facilité dans toute la colonne, indépendamment de toute autoroute fongique présente. Pour les expériences en laboratoire, les colonnes peuvent être utilisées dans des tubes coniques de 50 ml, de petits microcosmes de substrats, dans le sol entourant des plantes en pot, dans des boîtes ou dans d’autres systèmes expérimentaux contrôlés. Les colonnes ont été utilisées avec succès dans le sol, les rhizosphères et le fumier, et leur utilité peut être étendue à d’autres substrats, y compris la litière de feuilles, la boue, le sable, la neige, le compost, etc.
Les colonnes d’autoroutes fongiques permettent un certain nombre de comparaisons pour comprendre ce phénotype BFI au sein de divers types d’échantillons. La comparaison de la composition de la communauté entre l’appât et le milieu cible peut indiquer quelles bactéries peuvent utiliser les autoroutes fongiques et quels champignons peuvent servir de routespotentielles 9. Si le séquençage du métagénome est utilisé, les caractéristiques génomiques qui distinguent les organismes de l’appât par rapport aux milieux cibles peuvent également être examinées. Il est également possible de comparer des milieux cibles à partir de colonnes placées dans différents substrats (par exemple, sol ou fumier) ou placées dans le même substrat dans différentes conditions (par exemple, température ou humidité). Dans l’ensemble, les colonnes d’autoroutes fongiques étendent les capacités des méthodes précédentes pour interroger cette forme de BFI et permettent des examens approfondis de ces interactions qui façonnent la dynamique spatiale des microbiomes environnementaux complexes.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par une subvention du département américain de l’énergie (DOE), de la recherche biologique et environnementale (BER), de la division des sciences des systèmes biologiques (BSSD) sous le numéro de subvention LANLF59T.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes de 50 mL | Greiner BIO-ONE | 5622-7261 | Tubes de 50 mL pour la réalisation d’expériences en colonne en laboratoire |
| Boîtes de Pétri de 90 mm | Thermo Scientific Nunc | 08-757-099 | Boîtes de Pétri pour la préparation de la gélose et pour la croissance microbienne |
| Imprimante 3D Asiga Freeform Pico Plus 39 pour traitement numérique de la lumière (DLP) | Asiga, Allemagne | Pico Plus 39 de forme libre | Imprimante 3D utilisée pour générer des lots de colonnes ; d’autres imprimantes 3D peuvent être utilisées |
| Autoclave | Fisher Scientific | LS40F20 | Autoclave de paillasse pour stériliser les composants de la colonne |
| Gobelet | Fisher Scientific | FB100600 | Bécher de 600 mL pour diverses utilisations tout au long du protocole |
| Résine Dentaire Claire LT V2 | Formlabs | RS-F2-DLCL-02 | Résine alternative pour l’impression 3D testée |
| Guide chirurgical dentaire résine | Formlabs | RS-F2-SGAM-01 | A été utilisé pour générer les colonnes discutées dans le manuscrit ; D’autres résines photosensibles peuvent être utilisées à la place de ce matériau |
| Tubes de 1,5 mL à faible liaison d’ADN | Eppendorf | 13-698-791 | Tubes utilisés pour diverses préparations, y compris les extractions d’acides nucléiques |
| Conservateur de bouclier ADN/ARN | Recherche Zymo | Réf. R1100-50 | Conservateur utilisé avant les extractions d’acides nucléiques |
| Bioinformatique EDGE | Libre; Développé par le Los Alamos National Laboratory (LANL) | n/a | Plate-forme bioinformatique pour le traitement des données d’amplicons |
| Kit de spin FastDNA pour le sol | MP Biomedicals LLC | Référence 116560200-CF | Option de kit d’extraction d’ADN pour le sol |
| Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | Pinces stérilisables |
| Résine transparente Formlabs BioMed | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Résine alternative pour l’impression 3D testée |
| Imprimante 3D stéréolithographique (SLA) Form 3B+ de Formlabs | Formlabs | Formulaire 3B+ | Imprimante 3D alternative |
| Résine IBT de Formlabs | Formlabs | RS-F2-IBCL-01 | Résine alternative pour l’impression 3D testée |
| Boucles d’inoculation | Fisher Scientific | 22-363-598 | Utilisé pour isoler/transférer des microbes |
| Gélose à l’extrait de malt (MEA) | Critère | 89405-654 | Type de média utilisé dans les colonnes |
| Séquenceur MiSeq + kit de séquençage MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Peut utiliser d’autres séquenceurs |
| Mortier & Pilon | Fisher Scientific | FB961K ; FB961A | Peut utiliser n’importe quel mortier et pilon qui peut être stérilisé entre les utilisations |
| Kit de préparation de bibliothèque d’ADN NEBNext Ultra II pour Illumina | Biolabs de la Nouvelle-Angleterre | E7805S | Kit de préparation de banque pour le séquençage métagénomique |
| Kit de préparation de la banque d’ADN Nextera XT (24 échantillons) | Illumina | Référence FC-131-1024 | Kit de préparation de bibliothèque pour le séquençage d’amplicon |
| BORD NMDC | Open source : Développé par le National Microbiome Data Collaborative (NMDC) | n/a | Plateforme bioinformatique pour le traitement des données métagénomiques |
| Maille en nylon | Séfar | 03-25/19 | Le treillis utilisé dans le cadre de la construction de la colonne |
| Pointes de pipette | Rainin | 30807966 | Peut utiliser de nombreux embouts de pipette stérilisés différents pour les étapes du protocole |
| Gélose à la pomme de terre au dextrose | Cole Parmer | EW-14200-28 | Type de média utilisé dans les colonnes |
| QIIME2 | Libre | n/a | Logiciel de traitement des données d’amplicon |
| Kit de dosage HS Qubit dsDNA | Thermo Fisher Scientific | Question n°32851 | Utilisé pour quantifier l’ADN après extractions |
| Fluorimètre Qubit | Thermo Fisher Scientific | Question n°33238 | Utilisé pour quantifier l’ADN après extractions |
| Kit de mini-préparation fongique / bactérien à ADN rapide | Recherche Zymo | D6005 | Option de kit d’extraction d’ADN qui fonctionne à la fois avec les bactéries et les champignons |
| Gélose R2A | BD Difco | 218263 | Un type de média utilisé dans les colonnes (milieux bactériens) |
| Rack pour tubes de 50 mL | Fisher Scientific | 03-448-11 | Support pour maintenir des tubes de 50 ml à la verticale |
| Ciseaux | Fisher Scientific | 12-000-155 | Ciseaux fins de précision qui peuvent être stérilisés |
| Milieu de carboxyméthylcellulose sodique | Aldrich | Réf. 419273-100G | Type de média utilisé dans les colonnes |
| Logiciel de CAO SolidWorks | SolidWorks (en anglais) | n/a | Logiciel utilisé pour concevoir les colonnes |
| Pelle à truelle | Fisher Scientific | Réf. S41701 | Pour faire une dépression dans le substrat avant d’ajouter la colonne |
| Eau distillée sans DNase/RNase ultra-pure | Invitrogen : ThermoFisher Scientific | 10977015 | Eau pour le bain-marie à ultrasons |
| Ultrasoniseur | Fisher Scientific | Réf. FB-11201 | Ultrasoniseur pour le nettoyage des colonnes |
Références
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Réimpressions et autorisations
