Article de méthode

Immunocoloration intégrale et comptage automatique des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris

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DOI :

10.3791/66991

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4 octobre 2024

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1Sichuan Provincial Key Laboratory for Human Disease Gene Study, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 3Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la procédure d’isolement de la rétine de souris et d’immunomarquage pour marquer toutes les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). Le processus est suivi d’une imagerie et d’un comptage automatique des CGR à l’aide d’un logiciel basé sur l’IA, offrant une méthode simple, rapide et précise pour quantifier les CGR dans l’ensemble de la rétine de la souris.

Résumé

Le glaucome est l’une des principales causes de cécité dans le monde, caractérisé par un mécanisme pathogène complexe qui rend difficile la restauration de la vision. Les souris servent de modèles animaux précieux pour l’étude de la pathogenèse et du traitement du glaucome en raison de leur patrimoine génétique relativement homogène et de leurs cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), qui ressemblent structurellement à celles de l’homme. L’évaluation précise des lésions du CGR et des résultats du traitement dans les modèles de glaucome de souris nécessite de déterminer le nombre de CGR sur l’ensemble de la rétine. Ce protocole décrit une méthode complète impliquant l’isolement de l’ensemble de la rétine, le marquage des CGR avec des anticorps spécifiques et le comptage automatique rapide et précis des CGR à l’aide d’un programme basé sur l’IA. L’approche rationalisée permet une quantification efficace et précise du nombre de CGR dans les rétines de souris, facilitant ainsi l’évaluation de la dégénérescence du CGR et les interventions thérapeutiques potentielles. En permettant aux chercheurs d’évaluer l’étendue des dommages causés par le CGR, ce protocole contribue à une meilleure compréhension de la pathogenèse du glaucome et aide à développer des stratégies de traitement efficaces pour gérer et prévenir la perte de vision.

Introduction

Le glaucome se caractérise par la mort progressive des cellules ganglionnaires, ce qui pose un défi important pour la restauration de la vue 1,2. Cette maladie est un axe majeur de la recherche ophtalmique en raison de sa prévalence et de son impact sur la vision3. Les modèles de souris sont indispensables dans le glaucome
recherche en raison de leur patrimoine génétique homogène, de leur capacité de reproduction élevée et de la similitude de leurs propriétés de cellules ganglionnaires avec celles de l’homme4. L’objectif principal de cette méthode est de quantifier avec précision les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans des modèles murins, ce qui est essentiel pour comprendre la pathogenèse du glaucome et développer des traitements pertinents.

La raison d’être du développement de cette technique découle de la nécessité d’une méthode fiable et efficace pour évaluer la dégénérescence des CGR dans des modèles murins. Les méthodes traditionnelles, telles que le marquage des CGR dans les coupes rétiniennes, fournissent souvent des résultats peu fiables en raison de la distribution non uniforme des CGR dans la rétine5. La quantification des CGR dans l’ensemble de la rétine reflète mieux l’évolution de leur nombre et est cruciale pour évaluer la progression de la maladie et les interventions thérapeutiques.

Cette méthode offre plusieurs avantages par rapport aux techniques alternatives. Par exemple, le comptage manuel des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans la rétine d’une souris adulte normale, qui contient 40 000 à 60 000 CGR, peut prendre du temps et être sujet aux erreurs 6,7,8. Le logiciel de comptage automatique RGC que nous avons développé permet un comptage précis en moins de 3 minutes, ce qui permet aux chercheurs de gagner beaucoup de temps. De plus, le logiciel basé sur l’IA utilisé pour le comptage automatique minimise les biais et améliore la reproductibilité.

De plus, cette technique fournit une approche standardisée pour évaluer la dégénérescence du RGC à travers différents modèles de souris et conditions expérimentales, fournissant des données précieuses au domaine de la recherche sur le glaucome. La méthode s’aligne sur d’autres études qui soulignent l’importance de l’analyse de la rétine dans son ensemble pour comprendre les changements rétiniens dans les maladies9.

Pour aider les lecteurs à déterminer si cette méthode est adaptée à leur application, il est important de noter que cette technique est particulièrement avantageuse pour les chercheurs qui étudient la dégénérescence des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans des modèles murins de glaucome ou d’autres maladies rétiniennes. La méthode est adaptable à divers montages expérimentaux et offre un haut degré de précision et d’efficacité dans le comptage RGC, ce qui la rend idéale pour les études à petite et à grande échelle. De plus, la conception simple du protocole et la disponibilité d’un logiciel convivial le rendent accessible aux chercheurs ayant différents niveaux d’expertise en analyse rétinienne.

Protocole

La procédure était conforme aux directives de l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie pour l’utilisation d’animaux dans la recherche et a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’hôpital populaire de la province du Sichuan. Des souris mâles C57Bl/6J (âgées de 2 mois) ont été utilisées dans cette étude. La figure 1 illustre la procédure générale décrite ici. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement des rétines entières

  1. Sacrifice d’animaux
    1. Sacrifiez les souris en utilisant une luxation cervicale (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement) (Figure 2A). Avant la luxation cervicale,
      Anesthésier les souris en inhalant de l’isoflurane (3 à 5 % dans l’oxygène) ou par injection intrapéritonéale du mélange kétamine/xylazine.
  2. Énucléation et traitement du globe oculaire
    1. Marquez le bord de la cornée sur la face dorsale du globe oculaire avec un marqueur bleu pour vous souvenir de l’orientation lors de la dissection ultérieure.
    2. Retirez les tissus musculaires résiduels attachés au globe oculaire avec des ciseaux. Transférez le globe oculaire énucléé dans un tube de microcentrifugation à fond rond de 2 ml rempli de 1 x PBS pour un bref rinçage (figure 2C).
  3. Fixation
    1. Transférez le globe oculaire dans un autre tube de microcentrifugation à fond rond de 2 mL contenant du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % fraîchement préparé pour le fixer à 4 °C pendant 10 min (figure 2D).
    2. Faites une petite incision (environ 1 à 2 mm) sur la cornée à l’aide de ciseaux fins sous un microscope à dissection.
    3. Replacez le globe oculaire dans le fixateur pour une fixation ultérieure à 4 °C pendant 3 h afin de préserver la morphologie des tissus (Figure 2D).
  4. Ablation de la cornée et du cristallin 1,9
    1. Faites une petite incision d’environ 1 mm autour du limbe cornéen, la frontière entre la cornée et la sclère, à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins.
    2. Coupez soigneusement autour de la circonférence de la cornée, en l’excisant entièrement pour exposer les structures sous-jacentes.
    3. À l’aide d’une pince fine, saisissez doucement et soulevez délicatement le cristallin des tissus environnants afin d’éviter d’endommager la rétine. Maintenir l’intégrité structurelle de la rétine avec une opération délicate.
    4. Transférez l’œilleton dans un tube de microcentrifugation pour un traitement ultérieur.
      REMARQUE : Exciser la cornée et extraire le cristallin plus efficacement à l’aide de la technique de la « fente croisée »10. Faites deux fentes perpendiculaires sur la cornée et utilisez une pince pour extraire le cristallin.
  5. Incision sclérale
    1. Découpez une fente précise dans la sclérotique à l’aide de ciseaux ophtalmiques fins pour faciliter les étapes de dissection ultérieures (Figure 2J).
  6. Séparation de la rétine
    1. Insérez une pince avec les dents dans l’incision entre la sclérotique et la rétine. Saisissez doucement le bord de la sclère, en évitant une force excessive pour éviter de déchirer les tissus.
    2. Élargissez progressivement l’incision en déplaçant la pince le long de la limite entre la sclérotique et la rétine avec des mouvements lents et réguliers de la main. À l’aide de la partie dentée de la pince, séparez soigneusement la sclérotique de la rétine, en vous assurant que la rétine n’est pas endommagée (Figure 2J).
  7. Coupe de la rétine
    1. Divisez la rétine en quatre rabats de taille à peu près égale à l’aide de ciseaux tranchants. Assurez-vous que les coupes sont à peu près à mi-chemin vers le nerf optique et orientées à 90° l’une de l’autre.
  8. Nettoyage de la rétine
    1. Dépliez délicatement la rétine disséquée à l’aide d’une brosse à poils doux et retirez méticuleusement les débris de sa surface (Figure 2K).
  9. Fixation finale
    1. Transférez la rétine isolée dans un tube de microcentrifugation contenant 4 % de PFA frais à l’aide d’une pipette Pasteur jetable. Laisser la fixation sur la glace pendant 5 h supplémentaires à toute la nuit pour la préservation des tissus.

2. Immunomarquage

  1. Lavage
    1. Lavez la rétine entière isolée dans 1x PBS avec une agitation douce pendant 5 min. Ignorez la solution PBS. Répétez ce processus deux fois pour éliminer les résidus de fixateur et les débris.
  2. Bloquant
    1. Immergez la rétine lavée dans une solution tampon bloquante (1x PBS avec 4% de sérum d’âne normal (NDS) et 0,2% de Triton X-100) pendant 30 min pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques et améliorer la perméabilisation (Figure 3A).
  3. Incubation primaire de l’anticorps
    1. Remplacez le tampon de blocage par l’anticorps primaire BRN3A (dilué 1:200 dans le tampon de blocage). Incuber la rétine pendant la nuit à 4 °C pour permettre la liaison antigène-anticorps spécifique (Figure 3B).
  4. Lavage
    1. Lavez la rétine trois fois avec 1x PBS pendant 5 minutes chacune pour éliminer les anticorps primaires non liés et réduire la coloration de fond (Figure 3C).
  5. Incubation secondaire d’anticorps
    1. Incuber la rétine avec l’anticorps secondaire anti-lapin conjugué à Alexa594 ou Alexa488 (dilué 1:300) pendant 2 h à température ambiante pour visualiser les antigènes cibles (Figure 3D).
  6. Lavage
    1. Effectuez trois lavages consécutifs avec 1x PBS pendant 5 minutes chacun pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires et minimiser la liaison non spécifique.
  7. Montage
    1. Transférez doucement la rétine immunomarquée sur une lame de microscope en verre, en l’aplatissant soigneusement pour minimiser le pliage ou la distorsion.
    2. Appliquez une petite goutte de produit de montage anti-décoloration au centre de la rétine, en assurant une répartition uniforme sur tout le tissu.
    3. Placez soigneusement une lamelle sur la rétine montée, en évitant les bulles d’air (Figure 3E,F).

3. Traitement d’image

REMARQUE : Importez l’image dans le logiciel de comptage automatique RGC et commencez à compter. Le nombre de cellules BRN3A-positives pour l’ensemble de la rétine peut être obtenu en quelques minutes. Téléchargez le logiciel AutoCount à partir de GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Suivez les étapes d’installation détaillées du logiciel ci-dessous :

  1. Téléchargez le code à partir du lien GitHub . On recevra un fichier nommé « Intelligent-quantifying-RGCs.zip ». Décompressez ce fichier.
  2. Téléchargez les fichiers nécessaires à partir du disque cloud (voir la table des matériaux) et décompressez-les. Le fichier téléchargé est nommé « yolov5_cpu ». Décompressez ce paquet dans le dossier actuel pour éviter tout problème inattendu.
  3. Localisez le fichier de configuration à l’étape 1 et modifiez son contenu pour qu’il pointe vers le chemin d’accès « yolov5_cpu ».
    REMARQUE : Par exemple, si le « yolov5_cpu » téléchargé est placé dans « D :\1me\yolov5_cpu_ », remplacez le fichier « config.ini » à l’étape 1 par « D :/1me/yolov5_cpu » (utilisez / au lieu de \). (Figure 4A).
  4. Ouvrez l’interface graphique en cliquant sur userinterface.exe. Le chargement initial peut être lent (exécuté en tant qu’administrateur) (Figure 4B).
  5. Après avoir ouvert le logiciel, vérifiez si le fichier de modèle « pmse_plus.pt » est présent dans le répertoire racine du lecteur C. S’il n’est pas présent, copiez-le dans ce répertoire.
    REMARQUE : Le fichier du modèle « pmse_plus.pt » se trouve dans le dossier weights du dossier « yolov5 », qui se trouve dans le dossier RGCs de quantification intelligente extrait (Figure 4C).
  6. Préparez les images à détecter.
    REMARQUE : Le logiciel ne permet de lire qu’une ou cinq images à la fois. Si vous lisez davantage, vous obtiendrez une erreur.

4. Comptage automatisé des cellules

  1. Ouvrez le logiciel de comptage (Figure 5A).
  2. Cliquez sur OUVRIR L’IMAGE pour importer l’image (Figure 5B).
  3. Cliquez sur EXÉCUTER pour permettre au logiciel de compter automatiquement les cellules (Figure 5C).
    REMARQUE : Le logiciel marquera les cellules comptées à l’aide d’une case carrée rouge et affichera le nombre de cellules dans le coin supérieur droit (Figure 5D).

Résultats

Ce protocole détaille la méthodologie d’immunomarquage complet des rétines de souris, garantissant une préparation méticuleuse des tissus, une incubation précise des anticorps et un comptage cellulaire automatisé fiable. La procédure facilite le marquage et la quantification robustes des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), permettant une évaluation précise des populations cellulaires dans divers contextes expérimentaux. La méthode a été utilisée pour compter les CGR chez des souris de type sauvage et modélisées par le glaucome, ce qui a donné des résultats cohérents. Un résultat représentatif montre que le nombre de CGR chez une souris adulte normale à l’âge de 2 mois est d’environ 45 000 (Figure 6).

Pour évaluer si le logiciel d’IA peut quantifier avec précision les CGR marqués à BRN3a dans des modèles normaux et pathologiques, nous avons généré un modèle murin de glaucome7 induit par N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La rétine entière de ce modèle a été immunomarquée avec de l’anti-BRN3A, et les RGC ont été quantifiés à l’aide du logiciel de comptage automatique. Le résultat a indiqué une coloration de fond relativement élevée (figure 7). Néanmoins, le logiciel a été en mesure d’identifier avec précision presque tous les RGC. Au total, 15 231 CGR ont été identifiés dans cette rétine, contre environ 45 000 à 50 000 CGR dans une rétine de souris normale, indiquant une dégénérescence sévère. Ainsi, le logiciel d’IA peut également être utilisé efficacement pour compter les CGR dans les rétines dont la qualité de coloration est moins optimale.

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Figure 1 : Schéma de principe pour la préparation du RGC. (A) Le globe oculaire est retiré et placé dans 1x PBS. (B) Le globe oculaire est fixé dans 4% de PFA sur de la glace pendant 3 h. (C) Enlèvement de la cornée. (D) Extraction de la lentille. (E) L’œilleton est divisé en 4 rabats à l’aide de ciseaux. (F) La sclérotique est décollée et les débris sont délicatement retirés de la surface de la rétine à l’aide d’une brosse douce. (G) La rétine est immunomarquée avec des anti-BRN3A. (H) Les signaux fluorescents sont imagés à l’aide d’un microscope confocal. (I) Comptage automatique des RGC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.

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Figure 2 : Isolement de la rétine de la souris dans son intégralité. (A) La souris est euthanasiée par luxation cervicale. (B) La souris est placée sur une surface plane. (C) Le globe oculaire est soigneusement retiré avec des ciseaux. (D) Le globe oculaire est doucement placé dans 1x PBS. (E) Le globe oculaire est fixé à l’aide d’une pince au bord de la cornée. (F) Une petite incision est pratiquée sur le bord de la cornée à l’aide d’une aiguille. (G) La structure en forme de bol est retirée après avoir retiré la cornée. (H) La lentille est soigneusement retirée à l’aide d’une pince. (I) Une petite incision est pratiquée le long du bord de la cornée vers le nerf optique sur la sclérotique, évitant ainsi d’endommager la rétine. (J) La sclérotique est déchirée le long de l’incision à l’aide d’une pince. (K) La rétine est aplatie et nettoyée avec un pinceau. (L) La rétine est aplatie et rapidement fixée avec du méthanol glacé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Immunocoloration de la rétine de souris dans son ensemble. (A) Après le lavage avec 1x PBS, la rétine est bloquée par un tampon de blocage. (B) La rétine est incubée avec un anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit. (C) La rétine est lavée trois fois avec 1x PBS. (D) La rétine est incubée avec un anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. (E) La rétine est montée sur une lame de verre avec les CGR vers le haut. (F) Les images sont acquises à l’aide d’un microscope confocal laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Installation d’un logiciel de comptage automatique. (A) L’étape 1 consiste à mettre à jour le chemin d’accès au fichier dans le répertoire « yolov5_cpu ». (B) L’interface graphique est lancée. (C) Vérification de la présence du fichier modèle dans le répertoire racine du lecteur C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Fonctionnement du logiciel de comptage automatisé RGC. (A) Le logiciel de comptage est ouvert. (B) Vous cliquez sur le bouton OUVRIR L’IMAGE pour importer l’image. (C) Vous cliquez sur le bouton RUN pour lancer le comptage automatique. (D) Les cellules comptées sont marquées d’une case carrée rouge et le numéro de cellule est affiché dans le coin supérieur droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Comptage automatisé des RGC de souris. Le panneau supérieur (à gauche) montre des résultats représentatifs de l’immunocoloration de la rétine à montage plat avec l’anti-BRN3A ; le panneau supérieur (à droite) montre le comptage automatisé des CGR à l’aide d’un logiciel précédemment développé. Barre d’échelle : 100 μm. Les inserts des panneaux supérieurs sont agrandis et affichés dans le panneau inférieur, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Comptage des RGC dans un modèle murin de glaucome induit par NMDA. Panneau de gauche : Vue d’ensemble de la rétine de la monture entière, montrant les RGC reconnus par le logiciel d’IA. Panneau de droite : Vue agrandie d’une partie de la rétine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole fournit une méthode pour déterminer toutes les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans la rétine d’une souris, qui peut être utilisée pour surveiller la progression de la dégénérescence de la CGR dans des modèles murins pour les études sur le glaucome. La rétine de la souris est un tissu nerveux délicat5, et l’isolement des rétines entières des yeux de la souris nécessite une pratique répétée. Au cours de l’expérimentation, il a été constaté que le temps de fixation affecte significativement la morphologie de la rétine. Pour les souris d’environ 2 semaines, un temps de fixation de 20 min est suffisant pour obtenir de bons résultats en raison de la sclère fine et faible. Cependant, pour les souris adultes de plus de 2 mois, 20 min de fixation sont insuffisants. Un temps de fixation de 3 h est optimal pour obtenir des rétines entières intactes.

Dans le processus d’isolement de la rétine, l’étape la plus difficile consiste à séparer la sclérotique de la rétine10. La sclérotique peut être relativement facilement décollée de la rétine à l’aide de deux paires de pinces à pointes dentées. En utilisant les deux paires de pinces pour saisir la sclérotique et la séparer, la sclérotique est déchirée en petits morceaux et séparée de la rétine.

Une image de haute qualité des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) est essentielle pour un comptage précis. Comme la rétine est tridimensionnelle, tous les CGR ne sont pas au même niveau dans une rétine montée à plat8. Lorsque la rétine est montée sur une lame de verre, elle doit être étalée aussi plate que possible pour faciliter l’imagerie ultérieure. Pendant l’imagerie, les images sont acquises à plusieurs niveaux de mise au point pour capturer tous les CGR dans différentes zones de l’ensemble de la rétine.

En résumé, ce protocole fournit une procédure standardisée pour le comptage automatique de tous les RGC dans une rétine de souris montée à plat. Cette méthode permet aux scientifiques d’évaluer avec précision la dégénérescence du CGR dans des modèles murins, améliorant ainsi l’efficacité et la précision de la quantification du CGR. Une telle précision est cruciale pour comprendre et traiter le glaucome et les maladies associées.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce projet de recherche a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82371059 (H.Z.)), le Département des sciences et de la technologie de la province du Sichuan, Chine (2023JDZH0002 (H.Z.)), le Bureau des sciences et de la technologie de Chengdu (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)), et l’Hôpital populaire provincial du Sichuan (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1& fois ; PBSServicebioG4202
Alexa594-conjugué chèvre anti-lapin IgG  ; (H+L)ThermoFisherA-11012
Anticorps anti-BRN3A [EPR23257-285]Abcamab245230
Logicielhttps://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Disque CloudLienhttps://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6  ;
Disque cloudBaidu linkCode d’extraction : g44khttps://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg  ;
MarqueurSharpie
Normal Donkey SerumBiosharp, Labgic25030081
ParaformaldéhydeMacklinP804536
ProClean 300BeyotimeST853
SaccharoseBBI, SangonA610498
Triton X-100BioFroxx, neoFroxx1139ML100
AutoCount du lecteur Google

Références

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Mots-clés

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