Optimisation des techniques urodynamiques de souris pour une meilleure précision

Summary

Ce protocole fournit un guide pour imperméabiliser la peau avec du cyanoacrylate afin d’éviter l’absorption d’urine par la fourrure et la peau. Il comprend des instructions pour l’application de la colle sur la peau, l’implantation d’un cathéter vésical et des électrodes pour la cystométrie et les enregistrements d’électromyographie du sphincter urétral externe chez les souris éveillées.

Abstract

Une mesure précise des paramètres urinaires chez les souris éveillées est cruciale pour comprendre le dysfonctionnement des voies urinaires inférieures (LUT), en particulier dans des conditions telles que les lésions post-traumatiques de la moelle épinière (LME) neurogènes de la vessie. Cependant, la réalisation d’enregistrements de cystométrie chez la souris présente des défis notables. Lorsque les souris sont en position couchée et restreinte pendant les sessions d’enregistrement, l’urine a tendance à être absorbée par la fourrure et la peau, ce qui entraîne une sous-estimation du volume évasé (VV). L’objectif de cette étude était d’améliorer la précision des enregistrements de cystométrie et d’électromyographie du sphincter urétral externe (EUS-EMG) chez les souris éveillées. Nous avons développé une méthode unique utilisant un adhésif cyanoacrylate pour créer une barrière cutanée imperméable autour du méat urétral et de l’abdomen, empêchant l’absorption d’urine et assurant des mesures précises. Les résultats montrent qu’après l’application du cyanoacrylate, la somme de VV et de RV est restée cohérente avec le volume salin infusé, et qu’aucune zone humide n’a été observée après l’expérience, ce qui indique une prévention réussie de l’absorption d’urine. De plus, la méthode a simultanément stabilisé les électrodes connectées au sphincter urétral externe (EUS), assuré des signaux d’électromyographie (EMG) stables et minimisé les artefacts causés par le mouvement de la souris réveillée et la manipulation de l’expérimentateur. Les détails méthodologiques, les résultats et les implications sont discutés, soulignant l’importance d’améliorer les techniques urodynamiques dans la recherche préclinique.

Introduction

Le stockage et la libération de l’urine dépendent de l’activité coordonnée de la vessie et du sphincter urétral externe (EUS). Dans certaines pathologies telles que la vessie neurogène, les muscles détrusors de la vessie et le sphincter peuvent devenir dysfonctionnels, entraînant d’importants problèmes de vessie, en particulier après une lésion traumatique de la moelle épinière (LME)¹.

Les petits rongeurs sont couramment utilisés comme modèle expérimental pour étudier la fonction préclinique des voies urinaires inférieures (LUT)². Les techniques d’enregistrement de la cystométrie de remplissage (FC) et de l’électromyographie EUS (EUS-EMG) peuvent fournir des informations objectives précises en fonction du choix des méthodes, de la mesure précise et de l’interprétation des résultats³. Les tests urodynamiques sont couramment utilisés pour évaluer le volume mictionnel (VV), l’efficacité mictionnelle (VE) et la capacité de la vessie⁴. L’EV mesure l’efficacité avec laquelle la vessie peut se vider. Il est calculé en divisant le volume évacué par la somme des volumes vides et résiduels (VV+RV). D’autre part, la capacité de la vessie est calculée en ajoutant la VV (la quantité d’urine expulsée pendant la miction) à la RV (la quantité d’urine restante dans la vessie après la miction)⁵. Par conséquent, la mesure de VV et de RV sont les clés pour déduire d’autres paramètres.

La mesure précise de la VV chez la souris lors d’essais urodynamiques présente divers défis. L’urine des rongeurs, lorsqu’ils sont physiquement retenus en position couchée, a tendance à être aspirée vers le bas à travers la paroi abdominale ventrale en raison de l’influence de la gravité⁶. Ce phénomène peut entraîner l’absorption de l’urine par la fourrure abdominale et la peau, ce qui, à son tour, sous-estime le volume d’urine excrété. Compte tenu de la faible quantité d’urine produite par la souris, l’impact de cette absorbance sur la précision des résultats est encore plus prononcé⁷. De plus, dans les modèles de LME, la VV est souvent plus faible que chez les souris normales en raison de l’impact de la dyssynergie du sphincter détrusor (DSD), qui augmente le risque de pressions de point de fuite et d’absorption d’urine par la fourrure⁸. Ces facteurs ont un impact significatif sur les résultats. Par conséquent, une mesure précise de la VV et du VD lors des études urodynamiques terminales chez la souris est cruciale⁹. À l’heure actuelle, il y a un manque de détails dans les méthodologies fournies dans la littérature publiée sur la façon de mesurer avec précision le volume d’urine dans des modèles murins.

L’adhésif cyanoacrylate est un type de colle couramment utilisé dans les procédures chirurgicales sur des modèles humains et animaux en raison de ses propriétés de liaison rapides et efficaces 10,11,12. Cet adhésif est particulièrement utile pour fermer les plaies et les lacérations, car il forme une liaison solide et flexible lorsqu’il est appliqué sur la peau¹³. De plus, il peut être une excellente barrière contre l’urine et l’humidité qui peuvent entrer en contact avec la fourrure et les plaies¹¹.

Dans cet article, nous avons développé une technique nouvelle et rentable qui utilise un adhésif cyanoacrylate pour obtenir des résultats précis en cystométrie et en enregistrements EUS-EMG chez les souris éveillées. Cette méthode sera bénéfique pour comprendre les causes sous-jacentes du dysfonctionnement de la vessie et concevoir des traitements plus efficaces pour les troubles LUT.

Protocol

Le protocole d’étude sur les animaux a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université de l’Indiana. Code d’approbation : 21098MD/R/MSS/HZ Date d’approbation : 29 septembre 2021.

1. Préparation du cathéter

1. Coupez un tube en polyéthylène PE-30 de 30 cm (0,017 pouce x 0,030 pouce). Utilisez un briquet pour évaser une extrémité du tube, en vous assurant qu’il ne touche pas la flamme, et retirez le briquet une fois que le tube a formé une pointe ronde en forme de cloche.
2. Insérez avec précaution environ 3/4 de l’aiguille 25G dans l’autre extrémité du tube. Préparez une seringue de 1 mL et remplissez-la de NaCl stérile à 0,9 %. Connectez la seringue à l’aiguille de 25 G.
3. Infusez doucement une solution saline pour vérifier qu’il n’y a pas de pointe ronde et qu’il n’y a pas de fuite aux extrémités de l’aiguille. Assurez-vous qu’aucune pression n’est ressentie et que la solution saline s’écoule doucement à travers le cathéter.

2. Préparation des électrodes

1. Préparez 2 fils d’acier de 20 cm de long. Prenez les fils d’acier et appliquez du vernis à sable aux deux extrémités de la zone de revêtement pour dénuder 5 mm du fil.
2. Prenez une aiguille 25G et insérez-la d’un côté du fil. Assurez-vous d’insérer l’aiguille avec précaution pour éviter d’endommager le fil. Pliez la partie dénudée du fil comme un crochet. Le crochet aidera à connecter le fil au muscle EUS.
3. Utilisez de la soudure pour fixer la broche à l’autre extrémité du fil dénudé. La soudure aidera à fixer la broche au fil et à assurer une connexion solide. Assurez-vous de chauffer la soudure étain-plomb jusqu’à ce qu’elle fonde et recouvre le fil et la broche.

3. Préparation de l’animal

1. Hébergez la souris femelle C57BL/6 (âgée de 8 semaines, poids corporel de 18 à 20 g) dans l’animalerie selon Institutional Animal Care avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès illimité à l’eau et aux granulés de nourriture standard.

4. Anesthésie pendant la chirurgie

1. Placez les animaux dans une chambre à 2 % d’isoflurane et d’oxygène pur (1 L/min). Confirmez l’anesthésie complète de l’animal à l’aide d’un examen négatif par pincement des orteils avant de le transférer sur le masque. Une fois confirmé, changez l’état du gaz pour un masque.
2. Assurez-vous que le masque d’anesthésie est fixé dans la position appropriée sur le champ opératoire stérile. Placez l’animal en décubitus dorsal sur le champ stérile avec son nez dans un petit masque d’inhalation (0,8-1 L/min avec 2% d’isoflurane) pour continuer à administrer l’anesthésie.

5. Préparation chirurgicale

1. Fixez les membres de l’animal avec du ruban adhésif. Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure du bas-ventre et autour du méat urétral (région génitale).
2. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir toute sécheresse potentielle des yeux. Préparez la zone rasée à l’aide de la solution de povidone iodée et essuyez la solution avec de l’éthanol à 70 %. Mettez un champ stérile sur la région chirurgicale.

6. Intervention chirurgicale

1. Implantation d’un cathéter vésical
   1. Sous le microscope chirurgical, à l’aide de ciseaux droits et émoussés de Metzenbaum, créez une incision de 1 à 2 cm dans la ligne médiane de la peau abdomino-pelvienne. Procédez à l’incision du fascia et des muscles de la ligne médiane pour exposer la vessie à travers la plaie incisionnelle.
   2. Une fois que la vessie est visible à travers la plaie incisionnelle, procédez à la rétraction de tous les organes ou tissus environnants au besoin pour obtenir une vue claire du champ opératoire. Veillez à éviter toute manipulation ou tension inutile sur la vessie, car cela peut entraîner des complications telles que des fuites urinaires ou des blessures aux structures environnantes.
   3. Saisissez le dôme de la vessie et placez un cordon de bourse à l’aide d’une suture monofilament non résorbable 5-0 avec une aiguille à pointe conique.
   4. À l’aide de micro-ciseaux, créez une petite cystostomie dans le cordon de la bourse et faites un trou jusqu’à ce que l’urine s’écoule.
   5. Saisissez l’extrémité ronde du cathéter et insérez-la dans le trou. Une fois que l’extrémité du tube est passée dans le trou, suturez le cordon de la bourse autour du tube. Ensuite, tirez doucement le tube vers l’extérieur jusqu’à ce que la pointe soit ressentie sous la suture.
   6. Infusez lentement 1 mL de solution saline à partir de l’autre extrémité du tube pour distendre la vessie. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite autour du cathéter. En cas de fuite, placez une suture supplémentaire.
   7. Une fois que la solution saline sort de l’urètre, retirez-la pour décompresser la vessie.
2. Implantation des électrodes EUS (Figure 1)
   1. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour étendre l’incision abdominale jusqu’au plancher pelvien.
   2. Dans l’alignement de la vessie, déplacez les muscles et les membranes vers les canaux pudendaux et localisez l’urètre et le muscle du sphincter externe. Veillez à ne pas blesser les vaisseaux iliaques et caudaux moyens et les nerfs pudendaux.
   3. Percer la peau bilatéralement, à 1 cm du méat urétral, à l’aide de l’aiguille contenant l’électrode.
   4. Saisissez délicatement la pointe du crochet à l’aide d’une pince et retirez doucement l’aiguille de la peau.
   5. À l’aide de la pointe de l’électrode, accrochez soigneusement le muscle EUS bilatéralement. Évitez de frapper trop profondément, car cela pourrait endommager le muscle, ce qui pourrait entraîner des fuites d’urine.
   6. Utilisez le monofilament non résorbable 3-0 pour suturer les muscles et la peau du bassin et de l’abdomen.
3. Imperméabiliser la peau
   1. Appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la peau à l’endroit où les électrodes sortent pour fixer les électrodes en place.
   2. Appliquez la colle cyanoacrylate à 1 cm de distance autour du méat urétral et à 3 cm en étendant davantage vers l’abdomen et la région suturée. Pour éviter tout contact avec la colle, tenez soigneusement le méat avec une pince.
   3. À l’aide d’une micropipette de 0,5 à 10 μL, prélever le liquide de l’accélérateur pour sécher la colle.
      ATTENTION : Le liquide d’accélérateur est un liquide combustible.
   4. Ajoutez le liquide accélérateur pour assurer une bonne réaction adhésive. Cela aidera à sécher la colle plus rapidement et à s’assurer qu’elle durcit en toute sécurité.
4. Préparation urodynamique
   1. Préparez un bateau de pesée en polystyrène inversé de 4,5 cm de longueur, de largeur et de profondeur. Coupez-le en forme de triangle avec une base de 4 cm pour mettre le méat de l’urètre de la souris dans cet espace. Placez le moule de base jetable, 37 mm x 24 mm x 5 mm, sous l’espace de collecte de l’urine.
   2. Repositionnez la souris en position couchée et déplacez-la avec précaution sur une plaque sur mesure équipée d’un masque à gaz.
   3. Assurez-vous que le méat urétral est correctement positionné dans le sillon. Maintenez doucement la tête et le membre de la souris à l’aide de ruban adhésif et placez la plaque sur un coussin chauffant jusqu’à ce que la souris reprenne pleinement conscience (Figure 2).
   4. N’effectuez la cystométrie que lorsque la souris est complètement réveillée, c’est-à-dire au moins 40 minutes après la récupération de l’anesthésie.

7. Cystométrie et préparation de l’enregistrement EUS-EMG

1. Installez et calibrez la pompe à perfusion selon les instructions du fabricant.
2. Prenez une seringue de 20 ml d’un diamètre de 19,05 mm et remplissez-la de NaCl stérile à 0,9 % à température ambiante. Fixez la seringue à la pompe à perfusion. Réglez la vitesse d’infusion à 0,01 mL/min.
3. Connectez la seringue par le tube PE-30 à un côté du connecteur à trois voies. Connectez le cathéter vésical de l’autre côté à un transducteur de pression. Avant de connecter le cathéter vésical, assurez-vous d’éliminer toutes les bulles d’air.
4. Fixez le transducteur de pression au même niveau que la vessie de la souris. Le transducteur de pression est relié au système d’acquisition de données par l’intermédiaire d’un amplificateur.
5. Fixez un crochet de ligne de terre à la peau et l’autre aux sites de connexion de l’électrode. Enregistrez la pression dans le logiciel.
6. Après avoir démarré le logiciel, vérifiez les signaux de pression intravésicale (IVP) et EUS-EMG. Enregistrez le nom de l’échantillon et réglez l’heure.
7. Démarrez l’infusion par pompe. Enregistrez les signaux.

Results

La cystométrie et les tracés d’activité EUS-EMG ont été utilisés pour analyser les données. La méthode de cystométrie continue consiste à injecter une solution saline dans la vessie et à mesurer simultanément les changements de pression et de volume dans la vessie. Pour mesurer la VV, 0,4 mL de solution saline a été perfusé à une vitesse de 0,01 mL/min, et l’urine a été recueillie pendant 40 minutes dans un capuchon. Le résidu post-mictionnel (PVR) peut être obtenu en aspirant la solution saline à travers le cathéter. Chez les souris normales sans colle, la somme de VV et de RV était souvent inférieure à 0,4 mL. Après l’expérience, la fourrure de l’abdomen et entourant le méat était mouillée en raison de l’absorption d’urine (Figure 3A). Après l’application d’une fine couche de colle pour couvrir les petites fourrures, la somme de VV et de RV s’est avérée être de 0,4 mL, et il n’y avait pas de zone humide (figures 3B et C).

Les tracés de cystométrie qui en ont résulté ont fourni une analyse détaillée de divers paramètres, notamment la pression maximale de contraction de la vessie mictionnelle (27,2 cmH₂O), la durée de la contraction (16,26 s) et l’intervalle entre les contractions (4,48 min). Dans le même temps, nous avons eu un bon enregistrement de la pression intravésicale et des signaux EUS-EMG chez la souris, comme le montre la figure 4.

De nombreuses mesures urodynamiques chez la souris sont effectuées sous anesthésie¹⁴. Bien que cela puisse sembler être une méthode pratique pour réduire le bruit des signaux électriques et la perte d’urine résultant du mouvement de l’animal, il est essentiel de considérer que les anesthésiques peuvent affecter le débit urinaire, ce qui peut conduire à des résultats inexacts ou peu fiables¹⁵. Par conséquent, l’enregistrement urodynamique chez les animaux éveillés est plus populaire pour obtenir des résultats plus proches de l’état physiologique. L’enregistrement urodynamique chez les animaux éveillés commence généralement après une période de récupération de 40 à 50 minutes après la récupération de l’isoflurane¹⁶. Ce processus consiste à surveiller de près les souris pour s’assurer qu’elles sont détendues et à l’aise sans avoir besoin d’anesthésie. Il a été observé à travers plusieurs expériences que le mouvement d’une souris consciente peut affecter les signaux urodynamiques ^5,14, conduisant à des mesures inexactes de paramètres spécifiques tels que la pression du point de fuite, VV et VE¹⁷. En conséquence, nous avons mis en place une méthode en immobilisant partiellement les souris conscientes pour assurer des résultats urodynamiques plus fiables. Cependant, même avec une retenue limitée, les souris conscientes ont toujours du mal lorsqu’elles se réveillent immédiatement de l’anesthésie, ce qui peut également provoquer un détachement ou un contact instable entre le crochet de l’électrode et l’EUS et créer un bruit important dans les signaux EUS-EMG. Comme le montre la figure 3B, pour minimiser ces artefacts, nous avons adopté l’approche de fixer les électrodes avec de la colle au point de sortie de la peau. Cette méthode s’est avérée efficace pour minimiser le mouvement des électrodes et les artefacts qu’elles peuvent produire.

Figure 1 : Déplacement des électrodes d’électromyographie. Implantation d’électrodes (astérisque jaune) bilatéralement au muscle urétral externe (EUS ; flèches noires). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Contention de la souris éveillée. Après l’implantation du cathéter et des électrodes, la souris a été retenue sur la plaque pour plus de stabilité pendant l’enregistrement urodynamique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Régions abdominales et méats après enregistrement urodynamique. (A) Une grande zone humide (délimitée par une ligne pointillée rouge) a été observée dans l’abdomen et les régions génitales. (B) Des zones abdominales et génitales sèches et imperméables ont été créées avec de la colle cyanoacrylate (encadrée par un trait rouge) après l’enregistrement. (C) Une goutte d’urine (flèche jaune) s’est formée au niveau du méat pendant l’enregistrement urodynamique et est restée sous forme de goutte pendant une longue période sans être absorbée par la peau et la fourrure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Traces représentatives de cystométrie et d’électromyographie du sphincter urétral externe (EUS-EMG) chez une souris femelle éveillée et immobilisée. (A) Trace A : Enregistrements simultanés de cystométrogramme continu (CMG) et d’EUS-EMG (traces supérieures et inférieures, respectivement). (B) La trace B est la partie élargie de la piste A, indiquée par une boîte rectangulaire avec différentes échelles de temps. Au cours de la phase mictionnelle, la miction intermittente a coïncidé avec des réductions de la pression intravésicale dans l’enregistrement CMG (trace supérieure ; flèches), qui se sont produites pendant les périodes de faible tonique et de réduction de l’activité EUS-EMG (trace inférieure ; flèches). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cette technique urodynamique décrit une procédure améliorée pour mesurer le volume d’urine et le signal EUS-EMG chez des souris éveillées et immobilisées. La présence de fourrure autour de l’urètre, du méat et de la région abdominale peut interférer avec la précision de la mesure de la VV en absorbant l’urine. Bien que la fourrure entourant le méat urétral et l’abdomen ait été soigneusement rasée avant l’opération, les petites fourrures restantes dans ces zones et la peau absorbaient toujours l’urine, laissant généralement une zone humide dans l’abdomen après l’enregistrement. Ce problème est particulièrement visible chez les rongeurs femelles en raison de la distance extrêmement courte entre le méat urétral et la peau environnante¹⁸. Dans cette technique, de la colle cyanoacrylate a été appliquée sur la peau abdominale et urétrale environnante pour créer une surface cutanée imperméable et fournir une évaluation précise du volume urinaire pendant l’enregistrement urodynamique, permettant une meilleure compréhension de la fonction de la vessie. La colle a été appliquée avec précision, en veillant à ce qu’elle recouvre la peau entourant le méat et à proximité. Le but de l’application de la colle était de créer une barrière imperméable qui empêcherait les fourrures d’absorber l’urine. La colle a été étalée uniformément, en prenant soin d’éviter tout agglutination ou blocage du méat urétral. Les résultats enregistrés de la procédure ont confirmé que notre objectif avait été complètement atteint, car la somme de VV et de RV est restée constante au volume de perfusion, et aucune autre zone humide n’a été observée. Pour garantir l’exactitude des mesures, nous avons vérifié la vessie après l’expérience, et il s’est avéré qu’elle était vide. Cette étape supplémentaire de vérification de la vessie est cruciale car elle élimine toute possibilité de rétention d’urine, provoquant un écart entre la quantité que nous avons retirée à l’aide d’une seringue et la quantité réelle de RV.

Cette méthode a des limites : 1) elle ne convient pas aux études longitudinales et à plusieurs points temporels. 2) Il ne peut pas être appliqué à une souris se déplaçant librement. 3) si le détachement des électrodes de l’EUS se produit, il est difficile d’ouvrir l’abdomen et de les réinstaller. 4) Bien que les adhésifs cyanoacrylates soient un outil précieux dans de nombreux contextes chirurgicaux en raison de leur facilité d’utilisation et de leur efficacité, il est important de les utiliser avec prudence et de suivre les protocoles de sécurité appropriés pour minimiser les risques potentiels. Le cyanoacrylate est généralement sans danger pour la peau, mais tout contact fréquent avec celui-ci doit être évité et les chercheurs doivent prendre des mesures de protection individuelle appropriées. Les adhésifs cyanoacrylates peuvent libérer des vapeurs toxiques s’ils sont inhalés. Pour minimiser le risque d’inhalation de ces vapeurs, les chercheurs doivent maintenir des niveaux d’humidité plus élevés et optimiser la ventilation des pièces dans l’environnement de travail¹⁹. Des filtres spéciaux pour la climatisation peuvent également être utilisés pour réduire davantage la toxicité des vapeurs.

Dans l’ensemble, cette expérience a fourni des informations importantes sur la précision de la mesure de l’urine évacuée pendant l’enregistrement urodynamique et a aidé à identifier les sources potentielles d’erreur qui auraient pu conduire à des écarts dans la quantité totale de VV et de RV après la perfusion.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accélérateur	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
Cyanoacrylate  ;	TED PELLA, Inc	14478
Moule à base jetable	TED PELLA, Inc	27147-4
Pompe à perfusion	Harvard Apparatus PHD ULTRA	70-3006
Isoflurane	Henry Schein Inc	1182097
PIN	World Precision Instruments	5482
Tube en polyéthylène 30	Braintree Scientific Inc	PE30
Peseuse stérile	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite  ;	DATAQ INSTRUMENTS 249022