Article de méthode

Zebra II en tant que nouveau système d’enregistrement des signaux électrophysiologiques chez le poisson-zèbre

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DOI :

10.3791/67066

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16 août 2024

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1Department of Biomedical Engineering, UC Irvine, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, UC Irvine, 3Sensoriis Inc., 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

Dans cet article

Résumé

L’étude présente Zebra II, un système avancé pour l’acquisition et l’analyse prolongées de l’ECG chez le poisson zèbre. Ce système est doté d’un système de perfusion indépendant et d’électrodes à points multiples pour la manipulation de plusieurs poissons dans des environnements contrôlés. Les effets aigus de l’amiodarone ont été évalués et analysés chez le poisson zèbre de type sauvage.

Résumé

Le poisson zèbre et ses lignées mutantes ont été largement utilisés dans les investigations biomédicales, les études cardiovasculaires et le dépistage de drogues. Dans la présente étude, la version commerciale du nouveau système, Zebra II, est présentée. Le protocole démontre l’acquisition et l’analyse d’électrocardiogrammes (ECG) de plusieurs poissons-zèbres dans des environnements de travail contrôlables. Le dispositif est composé d’un système de perfusion externe et indépendant, d’une électrode à 4 points, de capteurs de température et d’un système électronique embarqué. Dans des études précédentes, le prototype du dispositif a été validé par rapport au système iWORX établi par le biais de plusieurs tests, démontrant une qualité de données et une réponse ECG similaires aux interventions médicamenteuses. Par la suite, l’étude s’est penchée sur l’examen de l’impact des anesthésiques et des fluctuations de température sur l’ECG du poisson-zèbre, ce qui a nécessité une évaluation instantanée des données. Grâce à la capacité de l'appareil à administrer régulièrement des anesthésiques et des médicaments, il a été possible d'étendre la collecte de données ECG jusqu'à 1 h, ce qui est nettement plus long que la durée de 5 minutes prise en charge par les systèmes actuels. Cet article présente une analyse automatisée pionnière, basée sur le cloud, utilisant les données de quatre poissons-zèbres, offrant une méthode efficace pour mener des expériences combinées et réduisant considérablement le temps et les efforts. Le système s’est avéré efficace pour capturer et analyser l’ECG, en particulier pour détecter les arythmies induites par les médicaments chez les poissons-zèbres de type sauvage. De plus, la capacité de recueillir des données sur plusieurs canaux a facilité l’exécution d’essais contrôlés randomisés avec des modèles de poissons-zèbres. Le système ECG développé surmonte les limites existantes, montrant le potentiel d’accélérer considérablement la découverte de médicaments et la recherche cardiovasculaire impliquant le poisson zèbre.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde. Selon le rapport de mise à jour 2024 de l’AHA, environ 2552 personnes meurent chaque jour de MCV aux États-Unis, et le coût direct et indirect moyen des MCV a été estimé à 378,0 milliards de dollars en 2017-20181. La fibrillation auriculaire (FA) est l’une des arythmies cardiaques les plus courantes aux États-Unis2 et est associée à un pronostic défavorable, augmentant le risque d’accident vasculaire cérébral et de décès dans les scénarios de maladies cardiovasculaires et de maladies non cardiovasculaires, entraînant un risque accru d’issues indésirables3. Ce type d’arythmie se distingue par son activité électrique rapide et irrégulière dans les oreillettes, ce qui se traduit généralement par un rythme ventriculaire rapide et irrégulier4. De plus, compte tenu des événements récents de la COVID-19, il y a eu un nombre croissant d’études et de preuves montrant une augmentation de l’apparition de l’arythmie par rapport à la COVID-19, principalement à la bradycardie sinusale5. Du côté opposé de la FA, la bradycardie sinusale présente un rythme cardiaque diminué et plus lent, avec une fréquence cardiaque inférieure à 60 battements par minute (bpm). Ce diagnostic nécessite un électrocardiogramme (ECG) montrant un rythme sinusal normal à une fréquence inférieure à 60 bpm.

Le poisson-zèbre, Danio rerio, s’est avéré être un modèle idéal pour les études cardiovasculaires et le développement de médicaments en raison de son homologie avec l’homme à la fois en termes de morphologie, de physiologie et de génétique6,7. Bien qu’il n’ait que deux chambres discernables par rapport au cœur à quatre chambres chez l’homme, le poisson-zèbre possède une structure contractile similaire avec un système de conduction analogue 8,9. Par conséquent, le modèle du poisson zèbre convient à la recherche sur les arythmies cardiaques et à l’exploration de l’association entre les voies génétiques connexes et les caractéristiques électrophysiologiques par le biais de l’analyse ECG. En ce qui concerne la conception du capteur pour l’enregistrement de l’ECG chez le poisson zèbre, des électrodes à aiguille conventionnelles sont couramment utilisées 10. D’autres études ont présenté des alternatives aux aiguilles conventionnelles en concevant un type d’aiguille différent fait de différents matériaux 11, ceux-ci incorporant des matériaux tels que le filament de tungstène, l’acier inoxydable et le fil d’argent pour évaluer la qualité des données enregistrées. Avec le kit ECG portable, ils ont cherché à établir une plate-forme universelle pour les laboratoires de recherche et d’éducation.

Le système d’aiguille a également été utilisé dans d’autres études11,12,13,14 pour mener des recherches sur les effets biologiques et/ou induits par les médicaments, dans lesquelles il a montré des résultats encourageants. Cependant, pour obtenir des signaux optimaux, il était nécessaire d'insérer soigneusement les aiguilles dans le derme du poisson-zèbre. Cette procédure invasive peut causer des lésions au cœur du poisson en raison de la netteté des aiguilles, ce qui peut modifier la morphologie du signal13. De plus, placer avec précision l’électrode sur le petit cœur sans causer de dommages pour assurer une capture ECG claire présente une courbe d’apprentissage importante. Par conséquent, divers systèmes de sondes de substitution ont été introduits, tels que les réseaux de microélectrodes (MEA) et les capteurs imprimés en 3D. Notre équipe et d’autres chercheurs ont utilisé avec succès la MEA pour l’acquisition de données, obtenant des données qui offrent un bon rapport signal/bruit (SNR) ainsi qu’une résolution spatiale et temporelle élevée15,16,17. Par exemple, nous avons introduit un MEA qui enveloppe le cœur du poisson, permettant de capturer des signaux ECG spécifiques au site 15,16. En revanche, une autre équipe a mis au point un autre type de MEA basé sur une carte de circuit imprimé flexible (FPCB) fabriquée à partir d’un film de polyimide visant à enregistrer plusieurs électroencéphalogrammes (EEG) pour la recherche sur l’épilepsie18. Bien que les AEM permettent d’enregistrer de nombreux signaux, elles sont limitées par la capacité d’évaluer un seul poisson à la fois en raison du nombre limité de canaux d’électrodes. En réponse à cette limitation, nous avons récemment présenté un système avancé capable d’enregistrer simultanément des ECG à partir de plusieurs fish19. Ce système utilise deux électrodes de 125 m d’épaisseur chacune en polyimide, avec des électrodes pulvérisées d’or positionnées au fond de leur boîtier pour faciliter l’acquisition de données. Cependant, l’inclusion d’une pompe de circulation d’eau a introduit du bruit, affectant la qualité du rapport signal/bruit (SNR) des signaux ECG. De plus, l’utilisation d’outils de collecte de données encombrants et coûteux, qui nécessitaient une connexion filaire à un ordinateur, était nécessaire. Sur le marché, des systèmes comme iWORX offrent une portabilité améliorée grâce à un amplificateur compact, mais ils sont confrontés à des problèmes non résolus : (i) leur temps d’enregistrement est trop court (3 à 5 min) pour les expériences nécessitant des durées plus longues, telles que celles impliquant des effets médicamenteux aigus ; (ii) la nécessité d’anesthésier les animaux, ce qui peut les stresser et fausser les données électrophysiologiques cardiaques innées ; iii) les mesures manuelles et séquentielles entravent la recherche sur un grand nombre de poissons ; et (iv) la nécessité d’un traitement hors ligne des données ECG à forte intensité de main-d’œuvre. Il est important de noter qu’aucun système à haut débit intégrant la microélectronique pour l’analyse des phénotypes mutants n’a encore émergé. Par conséquent, la création de systèmes à haut débit qui permettent un enregistrement ECG étendu est cruciale pour découvrir les liens entre les phénotypes arythmiques et les génotypes mutants, identifier plusieurs phénotypes arythmiques associés à des génotypes mutants uniques et tester l’efficacité des médicaments cardiaques à l’aide du modèle du poisson zèbre. C’est pourquoi nous avons présenté, en 2022, le prototype révolutionnaire du système Zebra II. Ce nouveau système est équipé pour effectuer des enregistrements ECG prolongés de plusieurs poissons à la fois. Pour y parvenir, un système électronique interne a été conçu, utilisant la technologie de l’Internet des objets (IoT) pour la transmission de données sans fil et permettant l’analyse des données via une application mobile. L'inclusion de la technologie IoT a non seulement renforcé la flexibilité et la portabilité du système, mais a également facilité les collaborations à distance pour la recherche sur les modèles de poisson-zèbre. Dans une étude antérieure, nous avons validé l'efficacité du système par des tests approfondis, démontrant sa capacité à 1) acquérir simultanément des données ECG de quatre poissons ; 2) effectuer des enregistrements ECG continus jusqu’à 1 h, ce qui dépasse considérablement la capacité des systèmes existants qui ne capturent que quelques minutes ; 3) minimiser les effets confondants de l’anesthésie en utilisant une concentration réduite de 50 % de tricaïne. De plus, le système a démontré une forte capacité pour de longs enregistrements ECG dans diverses expériences, telles que celles impliquant un bloc sino-auriculaire (SA) induit par le sodium, des changements de fréquence cardiaque induits par la température et des arythmies induites par des médicaments chez les poissons mutants Tg (SCN5A-D1275N) et de type sauvage dans des conditions expérimentales contrôlées. L'adoption par le système de plusieurs canaux d'électrodes pour l'enregistrement ECG étendu permet en outre l'exécution d'essais contrôlés randomisés, permettant d'étudier deux poissons par groupe expérimental dans des conditions identiques20. Dans cet article, nous présentons la version améliorée du système, dotée d’une électrode à 4 points. Cette amélioration permet aux utilisateurs de capturer des lectures ECG à partir de différents endroits sur le poisson, réduisant considérablement le risque d’obtenir des signaux ECG de mauvaise qualité. De plus, cette itération s’appuie sur et affine la majorité des fonctionnalités décrites dans les recherches précédentes 19. Ce système ECG évolué est très prometteur pour remédier aux limites existantes, facilitant ainsi considérablement l’analyse des phénotypes arythmiques et le criblage de médicaments chez le poisson-zèbre. L’ajout innovant de l’électrode à 4 points a été rigoureusement testé dans le cadre d’une brève étude sur l’arythmie induite par les médicaments chez le poisson-zèbre de type sauvage, validant davantage son efficacité.

Protocole

Le strict respect des directives éthiques garantit le bien-être et la manipulation appropriée du poisson-zèbre impliqué dans nos expériences. Toutes les activités expérimentales ont été menées conformément aux normes établies par les comités institutionnels de protection et d’utilisation des animaux (IACUC). Les expériences et les résultats détaillés ici ont été exécutés avec l’approbation de l’IACUC en vertu du protocole autorisé AUP-21-066.

1. Préparation et stockage des solutions mères

ATTENTION : Préparez la solution mère de tricaïne dans une hotte, en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.

  1. Mesurer 400 mg de poudre de tricaïne et la dissoudre dans 97,9 mL d’eau déminéralisée (DI). Placez un agitateur magnétique dans le récipient et mélangez progressivement la solution.
  2. Ajustez le pH en ajoutant progressivement moins de 17 ml de solution de NaOH. Continuez à ajouter des gouttes de NaOH jusqu’à ce que le pH atteigne une plage de 6,8 à 7,2.
  3. Déterminez la concentration finale de la solution de tricaïne, en tenant compte du NaOH ajouté nécessaire pour ajuster le pH et stocker.
    REMARQUE : La solution de tricaïne est sensible à la lumière et doit être conservée dans un récipient de couleur ambrée à 4 °C lorsqu’elle n’est pas utilisée.
  4. Mesurez 258,13 mg d’amiodarone et dissolvez-le dans 1 L d’eau DI. Insérez un agitateur magnétique dans le récipient et remuez pendant quelques minutes jusqu’à ce que la solution soit complètement dissoute et débarrassée de toute poudre. Conservez la solution à l’intérieur d’un réfrigérateur à 4 °C lorsqu’elle n’est pas utilisée.
    REMARQUE : L’amiodarone doit être préparé à l’intérieur d’une hotte et stocké dans un réfrigérateur à 4 °C. Portez toujours l’EPI approprié.

2. Élevage de poissons

  1. Maintenez les poissons dans des bassins individuels reliés à un système d’eau circulante, en maintenant la température entre 28-29°C.
  2. Assurer une surveillance continue de la qualité de l’eau et respecter un cycle jour-nuit de 14 h/10 h.
  3. Divisez les 40 poissons en quatre groupes, chacun composé de 10 poissons, et rangez-les dans des bassins séparés.

3. Configuration de l’appareil

REMARQUE : La procédure décrite à l’étape 3.2 doit être effectuée pour chaque chambre de l’appareil (Figure 1). Bien que chaque chambre puisse être configurée différemment, pour assurer la cohérence de l’expérience, il est conseillé de maintenir des réglages uniformes dans toutes les chambres.

  1. Connectez l’appareil à une source d’alimentation et lancez l’opération en appuyant sur le bouton rouge situé sur le panneau avant.
  2. Naviguez sur l'écran tactile de l'appareil pour choisir la chambre à configurer.
    1. Réglez le réglage du filtre passe-bas sur 0,1 Hz et le réglage du filtre passe-haut sur 500 Hz. Réglez le réglage du gain sur 10 000.
  3. Soulevez le couvercle avant pour accéder aux quatre chambres. Avant de commencer l'expérience, plongez l'éponge de chaque chambre (éponge de cellulose standard) dans une solution de tricaïne, puis essorez tout excès de liquide.
  4. Faites pivoter le réseau de quatre électrodes pour vous assurer que l’éponge est accessible avant d’introduire le poisson.

4. Traitement à l’amiodarone

REMARQUE : Utilisez l’eau des aquariums (eau de poisson) pour préparer des solutions diluées d’amiodarone et de tricaïne. Les étapes 4.3 et 4.4 doivent être répétées pour chaque groupe séparé à l’étape 2.3 pour chaque solution préparée à l’étape 4.1.

  1. Suivez les étapes décrites ci-dessous pour diluer la solution mère d’amiodarone.
    1. Diluer 8,75 mL de solution mère dans 41,25 mL d’eau de poisson pour obtenir une concentration de 70 μM.
    2. Diluer 12,5 mL de solution mère dans 37,5 mL d’eau de poisson pour obtenir une concentration de 100 μM.
    3. Diluer 25 mL de solution mère dans 25 mL d’eau de poisson pour obtenir une concentration de 200 μM.
  2. Préparez la solution d’anesthésie en diluant 4 mL de solution mère de tricaïne dans 100 mL d’eau de poisson, ce qui permet d’obtenir une concentration de tricaïne de 0,16 mg/mL
  3. Immergez chaque poisson individuellement dans la solution préparée d’amiodarone pendant 5 min. Utilisez des minuteries pour surveiller avec précision la durée de l’immersion.
  4. Transférez le poisson dans une solution de tricaïne pendant 2-3 minutes pour l’anesthésie. Assurez-vous que le traitement ne provoque pas la mort du poisson. Si un poisson présente un comportement anormal, comme une perte de couleur ou une réduction significative du mouvement des branchies, retirez-le immédiatement de la solution et remettez-le dans de l’eau de poisson propre.

5. Collecte des données ECG

REMARQUE : Suivez immédiatement ces instructions après avoir terminé l’étape 4.4. Répétez le processus pour chaque chambre avant de sceller l’appareil. Les chambres sont conçues pour accueillir des poissons d’une largeur de 4 à 10 mm et d’une longueur de 25 à 50 mm.

  1. Sortez le poisson de la solution de tricaïne et placez-le sur l’éponge, en vous assurant que sa face ventrale est tournée vers le haut.
  2. Positionnez le réseau d'électrodes en forme de losange sur la poitrine du poisson pour capturer simultanément les signaux ECG de quatre points différents (Figure 2A,B). Assurez-vous d'ajuster soigneusement chaque électrode afin que chaque broche entre en contact avec la peau du poisson.
    1. Faites pivoter chaque électrode en abaissant la goupille jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec le dessous du poisson. Si la goupille est trop haute, tournez la vis moletée correspondante dans le sens des aiguilles d’une montre pour l’abaisser jusqu’à ce qu’elle touche le poisson.
    2. Effectuez le réglage décrit ci-dessus pour les électrodes dans toutes les chambres.
  3. Fermez le couvercle des chambres une fois que tous les réseaux d'électrodes sont correctement positionnés sur le poisson dans les chambres opérationnelles.
  4. Marquez chaque chambre pour l’enregistrement en la sélectionnant sur l’écran tactile, puis lancez l’enregistrement en cliquant sur le bouton Enregistrer à l’écran.
  5. Cliquez sur le bouton Arrêter après 2 minutes, puis cliquez sur le bouton Enregistrer dans les fenêtres d’invite qui s’affichent à l’écran après l’arrêt. Enregistrez les informations sur un disque ou dans le cloud, en fonction des besoins de recherche spécifiques.

6. Dépannage du système de positionnement du réseau à quatre électrodes

REMARQUE : Parfois, une ou plusieurs électrodes peuvent ne pas capturer un signal ECG clair, nécessitant un repositionnement. Utilisez les étapes suivantes pour dépanner le porte-électrodes si nécessaire.

  1. Appuyez sur le bouton Stop de l’interface de l’appareil pour arrêter le processus d’enregistrement et identifier le ou les canaux avec des signaux incohérents.
  2. Soulevez le couvercle avant pour accéder aux chambres d’électrodes. Identifiez la ou les chambres et les électrodes spécifiques qui causent des problèmes.
  3. Tournez la vis à oreilles supérieure dans le sens des aiguilles d'une montre pour régler la proximité de l'électrode par rapport au poisson. Cette action abaissera l’électrode plus près du poisson.
  4. Répétez l’étape 6.3 si nécessaire. Si le simple fait de se rapprocher ne résout pas le problème, tournez l’électrode à un autre endroit sur le poisson jusqu’à ce qu’un signal satisfaisant soit obtenu.

7. Extraction et analyse des données

REMARQUE : Toute l’analyse de données de base présentée dans cet article utilise la technique Wavelet21 pour réduire divers types de bruit et l’écart-type des battements sinusaux normaux (SDNN) pour calculer la variance battement à battement de HR en segments d’une minute.

  1. Une fois que les données ont été enregistrées sur le disque ou dans le cloud, récupérez-les pour analyse ou envoyez-les directement à un serveur cloud pour un traitement ultérieur.
  2. Accédez aux données enregistrées en cliquant sur le bouton Parcourir à l’écran et sélectionnez les ensembles de données à utiliser.
  3. Sélectionnez le bouton Extraire dans les options à l’écran et connectez une clé USB à la partie arrière de l’appareil pour extraire les données.
  4. Suivez les instructions de l’appareil pour enregistrer les ensembles de données sélectionnés sur le disque externe en vue d’une récupération et d’une analyse ultérieures.

Résultats

La capacité d'enregistrer simultanément des signaux ECG chez plusieurs poissons distingue nettement cet appareil, offrant un avantage considérable en réduisant le temps nécessaire aux recherches pharmacologiques ou cardiaques sur le poisson zèbre ou d'autres espèces similaires (Figure 1). L'enregistrement de signaux ECG précis peut s'avérer difficile en raison des variations anatomiques entre les poissons, notamment en ce qui concerne le positionnement des électrodes. Traditionnellement, l'obtention d'un signal ECG clair implique de placer l'électrode active au-dessus du cœur afin d'éviter la capture des battements mécaniques ou des artefacts de mouvement, tandis que l'électrode de référence est positionnée vers le bas de l'abdomen. Toutefois, la localisation précise du cœur peut être difficile en raison de sa profondeur dans les tissus ou de la surface irrégulière du poisson. Parfois, les électrodes doivent être manipulées à l'aide de micromanipulateurs pour un positionnement exact, ce qui peut nécessiter plusieurs tentatives avant d'obtenir un signal de qualité.

Pour surmonter ces défis, le système introduit une approche innovante en utilisant une configuration de quatre électrodes au lieu des électrodes de travail classiques simples. Chaque électrode fonctionne indépendamment, permettant des ajustements selon trois dimensions : vers le haut et vers le bas (mouvement de tangage vertical), en inclinant vers l'avant et vers l'arrière (mouvement de tangage longitudinal), et en tournant autour de l'axe vertical (mouvement de roulis). Cette flexibilité s'avère particulièrement utile lorsqu'on travaille avec des poissons de formes variées, car elle permet un positionnement précis des électrodes afin d'obtenir un signal ECG optimal ou d'étudier comment les mesures d'ECG varient selon les différents points de contact sur le poisson.

Cette fonctionnalité améliore non seulement l'efficacité des études cardiaques et pharmacologiques, mais élargit également les possibilités offertes par les techniques d'enregistrement d'ECG, voire d'ECG. Étant donné que ces méthodes n'ont pas encore été standardisées et sont souvent personnalisées pour s'adapter aux conditions spécifiques du sujet expérimental, cet appareil ouvre de nouvelles voies à la recherche en proposant des méthodes de collecte de données plus adaptables et fiables (Figure 2).

L'une des caractéristiques distinctives de ce système est sa capacité à évaluer jusqu'à quatre médicaments différents simultanément sur quatre poissons distincts, ou à étudier les effets de jusqu'à quatre doses différentes d'un seul médicament sur quatre poissons distincts. Le dispositif expérimental peut varier d'une exposition aiguë brève à des séances plus longues s'étendant sur 1 h, impliquant des doses variables de médicament ou des modifications des conditions environnementales telles que la température et l'anesthésie. Dans cette étude, nous avons mené une expérience brève afin de démontrer l'efficacité de la méthode, en mettant particulièrement en évidence le fonctionnement du réseau à quatre électrodes. Nous avons testé trois doses différentes d'amiodarone, un médicament antiarythmique de classe III connu pour induire une bradycardie et prolonger l'intervalle QT chez le poisson zèbre, au cours d'une période d'exposition de 5 min, similaire à une étude précédente20 utilisant le premier prototype de cet appareil.

Conformément aux recherches antérieures, les poissons ont présenté à la fois un allongement de l'intervalle QTc et une réduction de la fréquence cardiaque par rapport au groupe témoin non traité. Malgré la courte durée d'exposition, plus brève que dans de nombreuses études comparables qui s'étendent jusqu'à 1 h, nous avons pu observer des modifications significatives des signaux de l'ECG et des paramètres cardiaques (Figure 3).

La manière dont le traitement par l'amiodarone a provoqué des modifications observables sur l'ECG, qui s'intensifient avec l'augmentation de la dose, est illustrée dans la Figure 3A,B. Notamment, l'intervalle QTc s'est allongé à chaque augmentation successive de la dose par rapport au groupe témoin, qui présentait un intervalle QTc de 330 ms. Pour les groupes traités, les intervalles QTc ont été mesurés à 365 ms avec 70 µM d'amiodarone, 480 ms avec 100 µM et 546 ms avec 200 µM. Parallèlement, une diminution notable de la fréquence cardiaque a été observée en réponse aux différentes doses d'amiodarone et aux intervalles QTc prolongés. La fréquence cardiaque a chuté significativement, passant d'une moyenne de 120 ±5 BPM dans le groupe témoin à 105 ±10 BPM avec 70 µM d'amiodarone, 90 ±5 BPM avec 100 µM et 84 ±5 BPM avec 200 µM (Figure 3C,D).

Sur la base de ces résultats, nous pouvons conclure que la nouvelle technique proposée présente une qualité comparable à celle des études antérieures17,18, utilisant une approche à deux électrodes (une électrode de travail et une électrode de référence). Nous avons réussi à recueillir des données à partir de quatre électrodes de travail, en sélectionnant la plus optimale pour l'analyse afin de rapporter ensuite les paramètres cardiaques attendus. Les critères de sélection sont conformes à ceux des méthodes précédentes, en insistant sur la nécessité de visualiser distinctement le complexe PQRST et d'obtenir un bruit de fond minimal dans le signal ECG. Cela permet le calcul des intervalles QT et QTc et facilite l'identification de différences nettes. De plus, la méthodologie a fait l'objet d'une validation supplémentaire par des tests menés par trois autres chercheurs de notre équipe qui n'avaient pas participé au développement du dispositif actuel. Ils ont d'abord mis en œuvre la méthodologie préliminaire proposée par les concepteurs, puis ont suggéré des modifications fondées sur leurs retours, conduisant à l'amélioration de l'approche présentée ici. Ce processus itératif d'amélioration s'est révélé crucial pour perfectionner le dispositif, en exploitant les observations de chercheurs extérieurs afin de le rendre plus convivial et efficace pour des applications futures.

Cette brève étude sur la réponse aux médicaments souligne l'efficacité de l'appareil, non seulement à enregistrer simultanément des ECG chez quatre poissons distincts dans différentes conditions, mais aussi à capturer plusieurs signaux (quatre) par poisson. Cette capacité multifactorielle réduit considérablement le temps et les efforts nécessaires au positionnement des électrodes et diminue la probabilité d'erreurs humaines en offrant un choix de signaux. Ce choix permet soit de sélectionner le signal le plus précis, soit de regrouper les données provenant de plusieurs signaux selon l'objectif de l'étude. Toutefois, il est important de préciser que l'utilisation d'une configuration à quatre électrodes n'assure pas automatiquement que les quatre signaux seront propres et de haute qualité. L'objectif principal de cette fonctionnalité innovante est de réduire les erreurs humaines et de gagner du temps en permettant quatre enregistrements simultanés au lieu d'enregistrements séquentiels, ce qui est plus efficace et moins stressant pour les poissons, étant donné leur tolérance limitée au temps passé hors de l'eau et sous anesthésie.

Schéma du dispositif d'électrophysiologie avec le système Zebra II, un support à quatre électrodes et un réseau d'électrodes multiples.
Figure 1 : Système Zebra II. (A) Vue isométrique du dispositif Zebra II (modèle SolidWorks) avec les composants identifiés. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Schéma du montage ECG à électrodes multiples et résultats pour la surveillance du cœur de poisson ; données des canaux 1 à 4 présentées.
Figure 2 : Positionnement des électrodes sur le poisson-zèbre. (A) Degrés de liberté du support d'électrodes à quatre points (image conceptuelle). (B) Positionnement des électrodes sur la poitrine du poisson. (C) Signal ECG enregistré avec le support d'électrodes à quatre points (canaux 1 à 4). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Analyse de l'électrocardiogramme, intervalle QTc, analyse de l'ECG sous dosage d'amiodarone, graphiques de fréquence cardiaque.
Figure 3 : Effets d'une exposition aiguë à l'amiodarone (signaux d'ECG). (A) Données représentatives d'ECG obtenues à partir du système et leurs modifications des paramètres d'ECG dues à différentes concentrations d'amiodarone. (B) Modification de l'ECG suite à une exposition à l'amiodarone. (C) Histogramme décrivant l'écart de la FC. (D) Histogramme décrivant l'écart de l'intervalle QTc dans les données d'ECG avec différentes concentrations d'amiodarone. *p<0,05 (analyse de variance à un facteur avec test de Tukey). Les barres d'erreur indiquent l'écart type. Cette figure a été modifiée à partir de20. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les étapes actuelles ont été modifiées et améliorées en fonction de cette nouvelle version de l’appareil à partir d’une étude précédente réalisée par notre équipe20. Ici, une conception assistée par ordinateur (CAO) étiquetée de l’appareil est également incluse.

Comme le souligne le guide de dépannage du protocole, l’appareil nécessite que l’utilisateur exécute certaines étapes critiques avec diligence et précision, car ces étapes affectent de manière cruciale la qualité du signal ECG. Conformément aux résultats de notre étude précédente20, le positionnement des électrodes joue un rôle important dans l’obtention de lectures ECG claires et de haute qualité à partir d’échantillons de poisson-zèbre. En raison de cette méthode qui fait passer le nombre d’électrodes de travail de un à quatre et introduit des degrés de liberté supplémentaires, elle nécessite des étapes de dépannage supplémentaires et un placement affiné des électrodes sur la zone ventrale du poisson pour des résultats optimaux.

Les avantages et les nouvelles caractéristiques de l’appareil résident dans des mesures étendues pour des expériences en plusieurs étapes, limitées à des études d’une heure, un criblage à haut débit avec plusieurs poissons-zèbres (quatre études simultanées), une configuration d’expérience hautement contrôlable, des enregistrements électrophysiologiques supplémentaires par échantillon (jusqu’à quatre) et des analyses et un stockage de données automatisés basés sur le cloud. À partir de là, nous voudrions souligner que le principal problème abordé est le temps nécessaire pour effectuer le dépistage de médicaments et les études cardiaques chez le poisson-zèbre, car les méthodes traditionnelles nécessitent un dépistage un par un et de multiples essais pour recueillir suffisamment d’informations22. Cela offre également une nouvelle façon d’utiliser les réseaux multicanaux pour enregistrer l’ECG de manière plus simple par rapport à ceux qui utilisent des réseaux de microélectrodes (MEA) ou des cartes de circuits imprimés flexibles (FPCB)18 qui nécessitaient des étapes supplémentaires dans la fabrication des électrodes mentionnées ainsi que la procédure nécessaire pour les fixer au poisson par rapport à la méthode proposée qui repose également sur le contact de surface, mais d’une manière moins invasive.

Les limites du système ne sont pas différentes de celles présentées dans les méthodes traditionnelles19,20, mais elles sont moins intensives car un réseau multicanaux est utilisé pour réduire le nombre d’essais d’enregistrement nécessaires à l’étude. Ces limitations reposent sur le positionnement de l’électrode, car il est recommandé de suivre le positionnement proposé présenté à la figure 2B. Il doit également être clair que l’utilisateur ne peut pas s’attendre à avoir des enregistrements parfaits lors du premier essai sur les quatre canaux, car les différences anatomiques des poissons et le prétraitement de l’échantillon (détartrage, procédures à poitrine ouverte, etc.) affecteront directement la qualité et le succès des tests.

Déclarations de divulgation

Hung Cao et Michael Lau sont les fondateurs de Sensoriis, Inc. Le système Zebra II de Sensoriis a été développé avec le soutien des NIH, dans le cadre de la subvention SBIR Phase II #R44OD024874. L’Université de Californie à Irvine a examiné et approuvé la relation de Hung Cao avec Sensoriis, Inc., conformément à ses politiques en matière de conflits d’intérêts. Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants du soutien de la #R44OD024874 de phase II du SBIR des NIH à H.C. et M.P.H.L. Les auteurs tiennent également à souligner le soutien financier fourni par le Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT) au Mexique par le biais de la bourse intitulée Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorhydrate d’amiodaroneSigma-AldrichPHR1164-1GPoudre d’amiodarone
PH/mV Mètre de paillasseSper Scientific10500308
Ethyle3-Aminobenzoate, Sel d’acide méthanesulfonique, 98 %, ACROS OrganicsFisher ScientificAC118002500Poudre de tricaïne
Isotemp Agitateur à plaque chauffanteFisher ScientificSP88854200
Zebra II SystemSensoriisN/ASystème d’enregistrement ECG commercial pour poisson zèbre
Système d’enregistrement ECG pour poisson zèbreiWorxZS-200Système d’enregistrement ECG pour poisson zèbre
commercial

Références

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