Article de recherche

Améliorer les résultats des étudiants grâce à une expérience de recherche de premier cycle basée sur un cours adaptable de clonage moléculaire

DOI :

10.3791/67067

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15 novembre 2024

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1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un module adaptable de clonage moléculaire Gibson Assembly a été utilisé dans le cadre d’un programme d’expérience de recherche de premier cycle (CURE) pour les étudiants du cours de biologie moléculaire. L’évaluation des résultats d’apprentissage des élèves a montré une meilleure compréhension et une meilleure confiance dans le clonage moléculaire après l’achèvement de l’étude CURE, et de nouveaux plasmides ont été clonés pour la recherche sur la biosynthèse des produits naturels.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’avancement continu des techniques de biologie moléculaire exige que les programmes de biologie moléculaire soient régulièrement affinés afin de préparer efficacement les étudiants à entrer sur le marché du travail avec des compétences modernes. En particulier, l’émergence de Gibson Assembly, une technique de clonage moléculaire hautement personnalisable et adaptative, a fait progresser le paysage du clonage moléculaire dans de nombreux environnements de recherche. Ainsi, nous avons créé un module de clonage d’assemblage Gibson pour le déploiement dans un cours de laboratoire de biologie moléculaire à l’Université d’État polytechnique de Californie, à San Luis Obispo, et évalué les résultats d’apprentissage des étudiants à partir du module. Au cours de trois itérations du cours, les étudiants ont participé à un projet indépendant basé sur l’expérimentation qui impliquait le clonage de trois banques de plasmides uniques pour soutenir des projets de recherche sur la biosynthèse des produits naturels. Les étudiants ont reçu des questionnaires avant et après leur compréhension du clonage moléculaire et leur confiance dans les termes et les techniques de biologie moléculaire. Les réponses des étudiants ont montré une augmentation significative à la fois de l’apprentissage des concepts de clonage moléculaire et de la confiance autodéclarée avec les termes et les techniques de clonage moléculaire. Ce cadre de module peut être généralisé pour enseigner l’assemblage Gibson pour diverses applications, fournissant aux instructeurs une boîte à outils pour enseigner une technologie de clonage adaptable et émergente tout en faisant avancer leurs projets de recherche.

Introduction

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La formation des étudiants de premier cycle aux concepts fondamentaux de la biologie moléculaire et aux techniques de laboratoire est cruciale pour leur développement scientifique et professionnel, car ces méthodologies sont courantes dans divers contextes de recherche, y compris le milieu universitaire et l’industrie. En tant que tels, les étudiants en biologie (concentration en biologie moléculaire et cellulaire) et en biochimie à l’Université d’État polytechnique de Californie, San Luis Obispo (Cal Poly) sont tenus de suivre un cours de laboratoire de biologie moléculaire de division supérieure pour apprendre et appliquer ces sujets (CHEM/BIO 475). Un programme de base pour ce cours a déjà été élaboré dans lequel les étudiants effectuent un clonage à base de topoisomérase (TOPO) pour assembler un plasmide contenant de l’actine préparé à partir d’un modèle d’ADN complémentaire de levure (ADNc)1. Les étudiants conçoivent des expériences basées sur des questions qui imitent des hypothèses de recherche authentiques, augmentant ainsi leur familiarité avec les pratiques de laboratoire et l’apprentissage basé sur l’enquête. L’avancement continu dans le domaine de la biologie moléculaire exige que les programmes d’études correspondants s’adaptent pour préparer les étudiants dotés de compétences modernes à la main-d’œuvre. En particulier, l’utilisation de l’assemblage Gibson est devenue plus prédominante dans la communauté scientifique ; Bien que la méthode ait été établie à l’origine pour synthétiser des chromosomes artificiels2, plus de 5 000 publications au moment de la rédaction de ce rapport ont fait référence aux travaux originaux de Gibson et al. Gibson Assembly est unique par rapport aux méthodologies de clonage traditionnelles : il est hautement personnalisable et peut facilement ligaturer plusieurs fragments d’ADN linéaires sans avoir besoin de sites de restriction pour produire les jonctions. Ainsi, nous avons vu l’opportunité de réorganiser le programme CHEM/BIO 475 pour intégrer des techniques modernes de clonage moléculaire et améliorer le modèle de cours basé sur l’enquête.

Il a été établi que les expériences de recherche des étudiants contribuent à une meilleure compréhension conceptuelle, au développement des compétences et à la persévérance en sciences3, mais tous les étudiants de premier cycle n’ont pas la possibilité de participer directement à un laboratoire de recherche. Pour relever le défi de la capacité limitée des étudiants dans les laboratoires de recherche, des expériences de recherche de premier cycle basées sur des cours (CURE) ont été développées et utilisées pour accroître l’accessibilité des sciences grâce à des recherches authentiques en classe. Bien que la mise en œuvre des CURE varie, des pratiques communes qui abordent les cinq principes de la recherche scientifique ont été établies. Dans le cadre d’un CURE bien conçu, les élèves devront 1) utiliser des pratiques scientifiques, 2) collaborer à un projet de recherche, 3) tenter de faire de nouvelles découvertes, 4) contribuer à des travaux pertinents en dehors de la salle de classe et 5) réévaluer et réviser des hypothèses et des méthodes en cas d’échec expérimental4. À l’instar des expériences de recherche traditionnelles des étudiants en laboratoire, il a été démontré que les CURE renforcent la confiance des étudiants dans les sciences, les compétences scientifiques, l’appropriation du projet et la persévérance dans les sciences, la technologie, l’ingénierie et les mathématiques (STIM)5. Bien que des CURE impliquant le clonage moléculaire aient été signalés précédemment 6,7,8,9,10,11,12,13, nous n’en connaissons aucun qui souligne l’adaptabilité de Gibson Assembly pour créer une bibliothèque de plasmides de recherche authentiques.

Ici, nous rapportons une expansion du programme actuel basé sur l’enquête CHEM/BIO 475 à l’Université d’État polytechnique de Californie, San Luis Obispo, avec deux améliorations majeures : l’expérience pratique de l’utilisation de Gibson Assembly et la participation d’étudiants à un CURE, qui a fourni des constructions plasmidiques originales pour des projets de recherche financés par la National Science Foundation (NSF-1708919 et NSF-2300890). Au cours des trois mises en œuvre de ce programme, les étudiants ont contribué à deux projets de recherche distincts axés sur la biosynthèse de produits naturels de molécules bioactives produites par Actinomycetota. Les produits naturels contiennent souvent des pharmacophores ayant des activités antibiotiques, antifongiques et/ou anticancéreuses, ce qui confère à ces petites molécules une importance dans les efforts de découverte de médicaments et un potentiel de pertinence clinique14. Cette recherche nécessite la création de banques de plasmides pour permettre d’étudier à la fois la fonction et le potentiel d’ingénierie des enzymes biosynthétiques bactériennes. Dans le cadre de ce CURE, les étudiants ont conçu et réalisé des expériences d’assemblage de Gibson pour cloner les bibliothèques de plasmides uniques pertinentes à ces projets de recherche (Figure 1). De plus, le format et la conception du module se distinguent par le fait qu’il est facilement adaptable pour générer des plasmides d’intérêt pour d’autres projets de recherche.

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Figure 1 : Vue d’ensemble du rôle de Gibson Assembly dans notre laboratoire de recherche. Actinomycetota produit des produits naturels à petites molécules avec des bioactivités cliniquement pertinentes en utilisant des groupes de gènes qui codent pour des enzymes biosynthétiques. Dans nos recherches, des plasmides contenant un gène biosynthétique sont assemblés via l’assemblage de Gibson pour des études en aval de la fonction de l’enzyme codée. Icônes scientifiques de Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vue d’ensemble du laboratoire

Le laboratoire de biologie moléculaire est un cours de division supérieure requis pour les majors en biochimie et les majors en biologie avec une concentration en biologie moléculaire et cellulaire. Les autres étudiants qui remplissent les conditions préalables sont invités à suivre le cours en tant que cours facultatif de division supérieure. Le cours est co-répertorié entre le département de chimie et de biochimie et le département de biologie de Cal Poly. Les professeurs des deux départements se relaient pour dispenser le cours chaque trimestre (deux trimestres en biologie, un trimestre en chimie et en biochimie).

La classe se réunit dans le laboratoire deux fois par semaine pendant des périodes de 170 minutes et une fois par semaine pour un cours de 50 minutes. Les sections de laboratoire contiennent un maximum de 16 étudiants et 2 à 3 sections de laboratoire sont proposées chaque trimestre. Le cours dure 10 semaines et l’examen final est administré lors de la dernière réunion de la semaine 10. Le temps de cours est consacré à la discussion de la théorie derrière de nombreuses techniques expérimentales menées en laboratoire, ainsi que des sujets d’actualité en biologie moléculaire qui ne sont pas couverts en laboratoire. Le programme de base du laboratoire englobe le processus de clonage du gène de l’actine à partir de la levure1, qui prend environ 7 semaines (13 à 14 réunions de laboratoire). Les techniques comprennent le micropipetage, l’isolement de l’ARN de levure, l’amplification d’un gène de levure à l’aide de la transcription inverse et de la réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR), le clonage TOPO, le criblage bleu-blanc, l’isolement des plasmides et la vérification de l’insert par digestion de restriction et PCR, l’analyse in silico des clones et l’analyse de séquences d’ADN. Le programme pour les 3 dernières semaines du cours est à la discrétion de l’instructeur, mais implique que les étudiants réalisent un « projet indépendant » avec des résultats indéfinis.

Présentation de l’expérience

L’un des objectifs de notre groupe de recherche est les voies de biosynthèse chez Actinomycetota. Lors de la conception du projet indépendant, nous avons envisagé de demander aux étudiants de créer des plasmides à l’aide de Gibson Assembly pour les utiliser dans nos projets de recherche sur la biosynthèse des produits naturels. Alors que les itérations du module de cours qui sont évaluées ici étaient spécifiques aux plasmides qui permettent la manipulation des voies de biosynthèse, le flux de travail de l’assemblage Gibson est énormément adaptable à d’autres projets de clonage moléculaire (Figure 2). Le flux de travail a été divisé en trois expériences différentes (A, B et C) qui ont été réalisées sur deux périodes de cours et six périodes de laboratoire (3 semaines au total) (voir le fichier supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 2). Les expériences ont été précédées de feuilles de travail pour aider les élèves à se préparer et à évaluer leur compréhension (Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4 et Fichier supplémentaire 5). Le flux de travail est présenté dans un format qui s’adapte aux besoins et aux intérêts de l’instructeur.

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Figure 2 : flux de travail du module d’assemblage Gibson. Le jour 1 et le jour 4 sont des périodes de cours où les étudiants effectuent une analyse séquentielle in silico et une conception expérimentale. Les jours 2 et 3 et 5 à 8 sont des réunions de laboratoire au cours desquelles les étapes de clonage de nouveaux plasmides via Gibson Assembly sont effectuées, suivies d’un isolement et d’un dépistage. L’organigramme illustré est regroupé en fonction des trois expériences réalisées par les élèves (A, B et C). Des directives et des protocoles plus détaillés se trouvent dans les manuels de l’instructeur et de l’étudiant fournis dans le dossier supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 2, respectivement. Icônes scientifiques de Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le module de projet indépendant Gibson Assembly a été testé pour la première fois au printemps 2019 dans CHEM/BIO 475. En 2020 et 2021, le cours a été dispensé en ligne en raison de la pandémie de SARS-CoV-2. Lorsque l’enseignement en personne a repris au printemps 2022 et 2023, les étudiants du cours ont été invités à participer à une étude évaluant les résultats d’apprentissage d’un projet indépendant de Gibson Assembly où des plasmides originaux et pertinents pour la recherche seraient clonés. En 2019, les étudiants ont créé une bibliothèque de plasmides composée de cassettes de gènes du génome de Micromonospora echinospora ATCC 15837 qui ont été clonées dans pKC1132 (Figure 3). Cette bibliothèque de plasmides est utilisée dans notre laboratoire de recherche pour inactiver les gènes d’intérêt dans un groupe de gènes biosynthétiques présumés pour le produit naturel TLN-0522015. Pour compléter nos études d’inactivation génique, les étudiants ont cloné en 2022 une petite bibliothèque de gènes du groupe de gènes présumé TLN-05220 dans pUC19 (Figure3) ; Notre groupe de recherche a utilisé ces plasmides pour subcloner des gènes dans des vecteurs d’expression, y compris pET28b, pour la surexpression et la purification des protéines. Les étudiants de la cohorte 2023 ont contribué aux travaux en cours sur un projet d’ingénierie biosynthétique sur l’époxomicine synthétase16. En équipes de 3 à 4, les étudiants ont cloné des domaines modifiés de modules de peptide synthétase17 non ribosomique dans divers vecteurs d’expression protéique afin d’optimiser la surexpression et la purification de ces enzymes dans notre laboratoire de recherche (Figure 3). La redondance a été intégrée dans le plan de clonage pour chaque cohorte. Par exemple, la cohorte de 2019 contenait 44 étudiants, et 15 plasmides ont été attribués à la classe, pour le clonage. Ainsi, le clonage de chaque plasmide a été tenté deux ou trois fois.

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Figure 3 : Résumé des plasmides clonés et des participants étudiants au cours des itérations indépendantes du projet en 2019, 2022 et 2023. Le projet Gibson Assembly a été déployé trois fois. Dans chaque offrande, les étudiants participants ont cloné une bibliothèque différente de plasmides à utiliser dans des projets de recherche explorant les voies de biosynthèse. Les projets de 2019 et 2022 ont soutenu nos travaux en cours sur le produit naturel TLN-0522015 avec deux réactions d’assemblage Gibson fragment (une cassette de gènes ou un gène et un vecteur). Le projet de 2023 a impliqué l’échange de domaines au sein des modules 1 et 2 d’une enzyme peptide synthétase non ribosomique (NRPS) impliquée dans la biosynthèse de l’époxomicine16. Les fragments hachurés représentent deux mutants différents du domaine échangé, et les couleurs unies représentent des domaines qui n’ont pas été échangés. Au total, huit fragments de gènes différents (quatre pour le module 1 et quatre pour le module 2) ont été générés avec des porte-à-faux compatibles avec l’assemblage Gibson. Pour chaque module, deux combinaisons différentes de trois fragments de gènes ont été assemblées avec l’un des deux vecteurs différents (pBAD33 et pET28, quatre fragments au total par assemblage), afin de générer huit plasmides NRPS modifiés. Icônes scientifiques de Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Aperçu de l’évaluation

Au moins 1 semaine avant le début du projet indépendant Gibson Assembly, les étudiants des cohortes 2022 et 2023 ont été invités à participer à une enquête sur les résultats d’apprentissage, conçue de la même manière qu’une étude réalisée dans le cadre d’un cours d’enquête sur le laboratoire de biochimie à Cal Poly18. Les étudiants participants ont rempli un pré-questionnaire à choix multiples lors de la réunion de laboratoire avant le début du projet indépendant et un post-questionnaire à choix multiples lors de la réunion finale du laboratoire (c’est-à-dire après avoir terminé le module d’assemblage Gibson). Le pré-questionnaire et le post-questionnaire comprenaient 28 questions identiques, avec deux questions supplémentaires dans le post-questionnaire (30 au total). Dix questions de contenu ont été rédigées pour évaluer les connaissances des élèves sur les enzymes et les mécanismes impliqués dans le clonage moléculaire (p. ex., réaction en chaîne par polymérase [PCR], assemblage de Gibson, transformation, criblage bleu-blanc). Les sept questions suivantes demandaient aux élèves d’auto-évaluer leur familiarité avec les termes du clonage moléculaire (p. ex., ADN polymérase, exonucléase, ligase). Les 10 questions suivantes ont permis aux étudiants d’auto-évaluer leur capacité à effectuer des techniques de clonage moléculaire (par exemple, analyse de séquences d’ADN, réactions de digestion par restriction, électrophorèse sur gel d’agarose). Les étudiants ont également indiqué s’ils seraient à l’aise de poursuivre une carrière en biologie moléculaire en fonction de leurs connaissances des techniques de clonage moléculaire. Deux questions supplémentaires ont été incluses dans le post-questionnaire pour permettre aux étudiants d’auto-évaluer leur engagement à apprendre dans le cours et de déterminer si le cours a été une expérience d’apprentissage précieuse (Fichier supplémentaire 6 et Fichier supplémentaire 7). Toutes les données des réponses des élèves avant et après le questionnaire de 2022 et de 2023 ont été combinées aux fins d’analyse et sont disponibles dans le tableau supplémentaire S1.

Protocole

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Les études impliquant des participants humains ont été examinées et approuvées par des sujets humains dans le Research Institutional Review Board de Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). Les participants ont donné leur consentement éclairé écrit à participer à cette étude.

Le protocole suivant décrit la préparation de l’instructeur (étapes 1.1 à 1.3), les actions des étudiants pour un module d’enseignement de trois expériences qui comprend la PCR pour obtenir des fragments linéaires (étapes 2.1 à 2.7), l’assemblage, la transformation et la sélection de clones de Gibson (étapes 3.1 à 3.5), l’isolement et le criblage des plasmides (étapes 4.1 à 4.4) et l’évaluation des résultats d’apprentissage (5.1 à 2,7).5.2). La préparation de l’instructeur décrit un exemple représentatif de conception d’amorces et de préparation d’une carte plasmidique souhaitée in silico. Toutes les sections du protocole sont adaptables à d’autres plasmides souhaités. Chaque expérience d’étudiant est divisée en deux réunions de laboratoire de 3 heures.

1. Préparation de l’instructeur

  1. Conception d’apprêt Gibson Assembly à l’aide de l’assistant d’assemblage Benchling
    1. Déterminez la source de matrice d’ADN pour les inserts de gènes, tels que l’ADN génomique, le plasmide et l’ADN synthétique.
      NOTE: Pour les gènes qui seront amplifiés à partir de matrices d’ADN génomique complexes, il est conseillé de déterminer d’abord des sites de liaison uniques pour les amorces dans la matrice d’ADN génomique qui sont spécifiques pour le ou les gènes d’intérêt, à l’aide de l’outil de recherche d’alignement local de base (BLAST) du National Center for Biotechnology Information (NCBI)21, comme détaillé dans le fichier supplémentaire 1. Pour les matrices simples telles que les plasmides ou l’ADN synthétique, passez à l’étape suivante.
    2. Récupérez les séquences d’ADN de l’insert ou des inserts de gène et du vecteur (par exemple, voir la séquence du gène de la polycétide hydroxylase et la séquence pUC19 fournies sous forme de fichiers GenBank dans le fichier supplémentaire 8). Importez la ou les séquences d’insertion souhaitées et la séquence vectorielle souhaitée dans Benchling, chacune sous la forme d’un nouveau fichier de séquence d’ADN. Ouvrez chaque séquence importée à inclure dans la réaction de l’assemblage Gibson.
      NOTE: On peut importer des fichiers de séquences d’ADN dans plusieurs formats, y compris GenBank et FASTA. On peut également importer une séquence directement à partir d’une base de données avec un numéro d’accès ou coller une séquence de nucléotides copiée à partir d’un autre fichier ou d’un autre visualiseur.
    3. En bas de l’écran, recherchez l’outil Assistant d’assemblage . Cliquez sur Assistant Assemblage, puis sélectionnez Créer un assemblage. Parmi les options proposées, sélectionnez Gibson et cliquez sur Démarrer pour commencer l’assemblage.
    4. Dans la fenêtre de séquence vectorielle , sélectionnez toutes les bases à inclure dans l’assemblage à partir du squelette vectoriel. Commencez la sélection à la position du nucléotide à l’extrémité 3' de l’insert du gène (par exemple, position 657 de pUC19), et sélectionnez tous les nucléotides restants à inclure (par exemple, jusqu’à la position 656 pour inclure la séquence entière de pUC19). Une fois sélectionné, cliquez sur l’onglet Backbone en bas de l’écran | Définir le fragment.
      NOTE: Basculez entre les vues Carte de séquence et Plasmide du vecteur pour sélectionner toutes les bases souhaitées d’un modèle circulaire. Par ailleurs, si vous prévoyez de préparer le fragment de vecteur par digestion de restriction (au lieu de PCR) pour l’assemblage de Gibson, linéarisez la séquence du squelette avec un site de coupe de l’enzyme de restriction (par exemple, XbaI). Pour ce faire, cliquez sur le site de coupe, maintenez la touche Maj enfoncée, puis cliquez à nouveau sur le site de coupe . Cliquez ensuite sur Définir le fragment pour définir le backbone. N’oubliez pas que les amorces spécifiques au vecteur ne seront pas générées par Benchling si le squelette est linéarisé avec une enzyme de restriction dans l’assistant d’assemblage.
    5. Dans la fenêtre de séquence d’insertion , sélectionnez toutes les bases de l’insert à inclure dans l’assemblage. Une fois sélectionné, cliquez sur l’onglet Insertion en bas de l’écran | Définir le fragment.
    6. Dans le cas d’insertions de plusieurs gènes, cliquez sur le bouton + sur le côté droit de l’assistant d’assemblage. Dans la fenêtre de séquence d’insertion , sélectionnez toutes les bases d’insertion à inclure dans l’assemblage. Une fois sélectionné, cliquez sur l’onglet Insertion en bas de l’écran | Définir le fragment.
    7. Une fois tous les fragments définis, renommez l’assemblage avec le nom de plasmide souhaité et cliquez sur Assembler à droite de l’assistant d’assemblage. Sélectionnez l’emplacement de dossier souhaité pour le dossier de séquence et le dossier d’amorce. Cliquez sur Créer pour assembler la séquence plasmidique recombinante.
    8. Ouvrez le plasmide assemblé et cliquez sur Historique de l’assemblage pour afficher une carte de plasmide de base et une vue d’ensemble des séquences dont il est dérivé. Assurez-vous que les positions des nucléotides de chaque fragment correspondent à la conception souhaitée.
    9. Dans l’onglet Paramètres d’assemblage , affichez les noms des amorces conçues pour l’assemblage. Notez qu’il y aura deux amorces conçues pour chaque insert (une avant et une arrière), et que les noms des amorces seront dérivés des titres des fichiers de séquence d’ADN. Assurez-vous également que les températures de fusion de l’amorce et les températures de recuit suggérées sont compatibles dans cette fenêtre (voir le fichier supplémentaire 8, Amorces représentatives).
      1. Si les températures de fusion ou de recuit de l’amorce ne sont pas idéales, ajustez manuellement les séquences d’amorces (par exemple, en supprimant les nucléotides pour réduire la température de fusion) dans les fichiers de séquences d’amorces. Vous pouvez également cliquer sur Rouvrir et ajuster les paramètres de l’amorce en cliquant sur le bouton Paramètres de l’enzyme/de l’amorce à côté du bouton Assembler dans l’assistant d’assemblage. Ensuite, répétez l’étape d’assemblage et réexaminez les séquences d’amorces.
      2. Si une bibliothèque de plasmides doit être clonée avec de nombreux gènes différents clonés dans le même squelette vecteur,
      3. Utilisez la même paire d’amorces pour le vecteur dans chaque cas. Pour ce faire, retirez manuellement tous les nucléotides des amorces vectorielles qui installeraient les surplombs spécifiques à l’insert. Ces nucléotides se trouveraient à l’extrémité 5' de l’amorce . Après le retrait, assurez-vous que les températures de fusion de l’apprêt et les températures de recuit sont compatibles (voir le fichier supplémentaire 8, Amorces représentatives).
      4. Assurez-vous que toutes les paires d’amorces d’insertion ont des températures de fusion et de recuit très similaires.
        NOTE: Cela réduira le besoin d’optimiser la température de recuit de chaque paire et permettra à toutes les réactions PCR des étudiants d’être cyclées en même temps à l’aide du même programme de thermocycleur.
    10. Une fois la conception de l’amorce terminée pour les plasmides souhaités, cliquez sur Finaliser dans l’assistant d’assemblage. Commandez les amorces auprès d’une entreprise de synthèse d’ADN et récupérez des échantillons des matrices d’ADN pour les inserts et les vecteurs.
    11. Testez des paires d’amorces spécifiques à l’insert et au vecteur pour des températures de recuit optimales à l’aide d’une expérience de PCR à gradient avec les matrices d’ADN. Testez initialement les températures de recuit recommandées par Benchling ± 3 °C.
    12. Une fois que les températures de recuit ont été déterminées, créez des aliquotes de solutions d’amorces, des matrices d’ADN et les réactifs nécessaires aux réactions PCR pour les étudiants.
  2. Avant les expériences, fournissez des feuilles de travail aux élèves pour les aider à se préparer et à évaluer la compréhension (Dossier supplémentaire 4, Dossier supplémentaire 5 et Dossier supplémentaire 6).
  3. Collecte de données sur les résultats d’apprentissage
    NOTE: Si vous souhaitez collecter des données sur les résultats d’apprentissage à partir du module Gibson Assembly et publier les résultats, obtenir l’approbation de la recherche avec des sujets humains conformément aux politiques de l’établissement.
    1. Invitez les élèves à participer à une enquête sur les résultats d’apprentissage au moins 1 semaine avant le début du projet indépendant Gibson Assembly.
    2. Demandez aux étudiants participants de remplir le pré-questionnaire à choix multiples (fichier supplémentaire 6) lors de la réunion de laboratoire avant le début du projet indépendant.

2. Expérience d’étudiant A : PCR pour obtenir des fragments linéaires

  1. Obtenez des amorces et des solutions d’ADN pour la PCR auprès de l’instructeur.
  2. Pipette pour des réactions de 25 μL, y compris l’ADN polymérase MasterMix, la matrice d’ADN, les amorces avant et inverse et l’eau sans nucléases conformément aux instructions du manuel de l’étudiant (voir le fichier supplémentaire 2).
  3. Effectuez le cycle de la réaction dans un thermocycleur conformément au manuel de l’étudiant dans le fichier supplémentaire 2. Assurez-vous que la température de recuit de la réaction est appropriée pour les amorces et que le temps d’extension est approprié pour la longueur de l’amplicon souhaité. Reportez-vous aux fichiers supplémentaires 2 et 3 pour des instructions détaillées.
  4. Conservez les réactions de PCR à 4 °C ou à -20 °C jusqu’à la période de laboratoire suivante.
  5. Analyser 5 μL de chaque réaction par électrophorèse sur gel d’agarose. Pendant que le gel fonctionne, ajoutez 1 μL d’enzyme de restriction DpnI à chaque réaction qui a utilisé l’ADN plasmidique comme modèle. Incuber ce mélange pendant 1 h à 37 °C.
    NOTE: DpnI dégradera toute matrice d’ADN plasmidique circulaire restante, ce qui la rendra moins susceptible d’obtenir des faux positifs lors de l’étape de transformation.
  6. Imagez le gel pour confirmer que la PCR a réussi et que l’amplification correcte a été obtenue. Purifiez toutes les réactions PCR réussies avec un kit de purification PCR disponible dans le commerce. Mesurez la concentration (ng/μL) du produit PCR purifié à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume pour l’utiliser dans les calculs d’assemblage ultérieurs de Gibson.
  7. Avant la prochaine réunion de classe, concevez la recette de réaction pour l’assemblage Gibson (voir le fichier supplémentaire 2 et le fichier supplémentaire 4).

3. Expérience B de l’étudiant : Assemblage de Gibson, transformation et sélection de clones

  1. Pipeter la réaction de l’assemblage Gibson selon la recette conçue. Incuber la réaction à 50 °C pendant 15 min. Pendant que les réactions incubent, préparez-vous à la transformation en décongelant des cellules d’Escherichia coli chimiquement compétentes sur de la glace.
  2. Transformez 2 μL de l’assemblage Gibson en cellules chimiquement compétentes par choc thermique. Pipeter 100 μL des cellules transformées sur deux plaques de sélection et étaler avec des billes stérilisées. Préparez 10-4, 10-5 et 10-6 dilutions des cellules restantes sur de la gélose Luria-Bertani (LB). Plaque de 100 μL de chaque dilution en série sur LB (pas de sélection) et étalage avec des billes stérilisées.
    NOTE: Cette étape permet de calculer l’efficacité de la transformation.
  3. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C. Conserver les plaques à 4 °C jusqu’à la prochaine période de cours.
  4. Comptez les colonies sur toutes les plaques et calculez l’efficacité de la transformation comme indiqué dans le fichier supplémentaire 2. Striez de nouveau une plaque sélective avec quatre colonies de l’une ou l’autre plaque sélective et incubez cette plaque à 37 °C pendant la nuit.
    NOTE: Cela sert de culture de sauvegarde de vos clones positifs.
  5. À l’aide d’un marqueur, sélectionnez, encerclez et étiquetez quatre colonies distinctes sur la plaque de sélection avec les initiales de l’élève et un chiffre (p. ex., ABC1). Récupérez une nouvelle plaque de gélose LB contenant l’antibiotique pour la sélection, utilisez un marqueur pour diviser la plaque en quadrants (c’est-à-dire des quartes), puis utilisez ~1/2 de chaque colonie pour retracer sur le quadrant respectivement marqué et l’autre 1/2 pour inoculer une culture liquide de LB de 5 mL pour chacune des quatre colonies sélectionnées. Assurez-vous d’étiqueter les tubes avec l’identité de la colonie respective (par exemple, ABC1) et d’ajouter la concentration correcte d’antibiotique pour la sélection. Incuber les cultures liquides dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant la nuit et la plaque de gélose dans un incubateur statique à 37 °C ; Conserver les cultures liquides et les plaques à 4 °C jusqu’à la période de classe suivante.

4. Expérience d’étudiant C : Isolement et criblage de plasmides

  1. Isolez l’ADN plasmidique des cultures liquides de l’expérience B à l’aide d’un kit miniprep. Mesurer la concentration du plasmide isolé (en ng/μL).
  2. Concevoir un test de synthèse de restriction ou un dépistage par PCR pour analyser les plasmides isolés (voir les instructions détaillées dans le fichier supplémentaire 2 et les attentes en matière de rapports dans le fichier supplémentaire 5).
  3. Pipeter la restriction, digérer les réactions ou les réactions selon les recettes conçues et incuber à des températures et des durées conçues précédemment.
  4. Analysez les résultats par électrophorèse sur gel d’agarose.

5. Appréciation

  1. Demandez aux étudiants participants de remplir le post-questionnaire à choix multiples (fichier supplémentaire 7) lors de la réunion de laboratoire après la fin du module d’assemblage Gibson.
  2. Combinez toutes les données des réponses avant et après le questionnaire pour l’analyse.
    1. Examinez la signification statistique de l’augmentation du score moyen de chaque question de contenu individuelle entre les questionnaires à l’aide de tests t appariés bilatéraux et de l’ampleur de l’effet d de Cohen.
    2. Évaluez l’augmentation de la confiance des élèves pour chaque terme et chaque technique afin de déterminer l’ampleur du changement et sa signification statistique.
    3. Déterminez l’impact des antécédents et des facteurs scolaires de l’élève sur l’apprentissage des élèves à l’aide du gain d’apprentissage normalisé (NLG) et des tests t non appariés.
    4. Évaluez les attitudes des étudiants à l’égard de l’expérience du projet et des carrières en biologie moléculaire en évaluant les notes moyennes.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Réussite des élèves dans le clonage
Dans chaque itération du module Gibson Assembly (2019, 2022 et 2023), les étudiants ont été invités à préparer un rapport résumant leurs conclusions. En 2019, 36 des 44 étudiants (81,8 %) ont déclaré avoir réussi à cloner leurs plasmides en se basant sur les résultats du criblage qu’ils ont conçu pour l’expérience C. Au total, 14 étudiants sur 20 (70,0 %) ont déclaré avoir réussi à cloner les concepts qui leur avaient été assignés en 2022, tandis que le projet en équipe de 2023 a vu 12 étudiants sur 27 (44,4 % ou 4 groupes sur 8) déclarer avoir réussi sur la base de leurs analyses de dépistage. Les conclusions des rapports des étudiants ont été examinées par l’enseignant ou les étudiants chercheurs ; Les interprétations des élèves ont été corrigées s’il s’avérait que les résultats du dépistage n’appuyaient pas leurs affirmations. Un échantillon de chaque plasmide distinct a été analysé par séquençage de Sanger, confirmant les séquences des inserts plasmidiques pour les 15 plasmides souhaités en 2019 et les 12 plasmides en 2022. En 2023, le séquençage par nanopores d’Oxford du plasmide entier a été utilisé pour analyser les 8 plasmides ; Cependant, seulement 1 des 8 plasmides correspondait à la séquence souhaitée.

Évaluation des concepts de biologie moléculaire basée sur le contenu
La section du contenu du questionnaire comprenait 10 questions à choix multiples qui testaient la compréhension des élèves de la biologie moléculaire et des concepts de clonage moléculaire. La comparaison des scores moyens de contenu avant et après le questionnaire pour les 10 questions de contenu a révélé une augmentation significative de 63,7 % à 80,4 % (p < 0,05, test t apparié bilatéral ; Figure 4), suggérant que le projet indépendant de l’Assemblée Gibson a amélioré la compréhension des étudiants de la biologie moléculaire et des concepts de clonage. Un test d de Cohen a déterminé que cette augmentation significative correspond à une grande taille d’effet (d = 0,891), ce qui soutient une forte différence entre les réponses pré et post-réponses des étudiants pour les questions de contenu.

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Figure 4 : Amélioration de la compréhension de la biologie moléculaire et du clonage moléculaire par les étudiants suite au projet indépendant. Boîte à moustaches des réponses des élèves à des questions testant le contenu en biologie moléculaire et en clonage moléculaire avant et après la réalisation du projet indépendant (taille de l’échantillon, n, de 46 ; Pré-questionnaires et post-questionnaires de l’assemblage Gibson dans le fichier supplémentaire 6 et le fichier supplémentaire 7, respectivement). Les scores moyens avant et après ont été analysés à l’aide d’un test t bilatéral apparié, qui indique une augmentation significative des réponses correctes des élèves (p < 0,5). Les cases représentent les 50 % du milieu des scores (c.-à-d. du 25e au 75e centile), et les moustaches représentent les scores minimum et maximum ( %). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ensuite, nous avons examiné si l’augmentation du score moyen de chaque question de contenu individuelle était statistiquement significative entre le pré et le post-questionnaire. Des analyses à l’aide de tests t appariés bilatéraux ont montré que les réponses des étudiants aux questions sur les réactions PCR, les digestions de restriction DpnI, les enzymes de l’assemblage de Gibson et les séquences d’insertion et de vecteur de l’assemblage de Gibson présentaient des augmentations significatives (p < 0,05) après la fin du projet indépendant. Ces questions basées sur le contenu ont obtenu des scores relativement faibles avant le questionnaire par rapport à la moyenne globale du contenu de 63,7 %, les scores les plus bas étant attribués aux questions sur les digestions DpnI et les enzymes d’assemblage Gibson (34,8 % et 47,8 %, respectivement). La moyenne post-projet pour les questions susmentionnées est passée à 71,7 % et 89,1 %, respectivement, ce qui est plus proche de la moyenne globale du contenu de 80,4 %. Ces données montrent qu’à la fin du projet, la compréhension des digestes DpnI et des enzymes d’assemblage Gibson s’est améliorée avec une taille d’effet plus grande que la section du contenu global du questionnaire (d = 0,982).

Évaluation comportementale des termes de biologie moléculaire et des techniques de laboratoire
Les questions sur les attitudes ont été divisées en deux sections dans le questionnaire de l’élève. Dans la première section, les élèves ont auto-évalué leurs connaissances de sept termes de biologie moléculaire sur une échelle de 1 à 4 (1 = « Je n’ai aucune idée de ce que signifie ce terme » à 4 = « Je sais ce que signifie ce terme et je pourrais facilement l’expliquer à quelqu’un d’autre »). La confiance moyenne à terme a augmenté de manière significative, passant de 3,52 à 3,87 avec une grande taille d’effet (p = 5,32 × 10-15 et d = 1,40, respectivement ; Figure 5A). La deuxième section sur l’attitude demandait aux élèves s’ils étaient d’accord avec l’énoncé « Je suis à l’aise de jouer... Onze techniques de laboratoire de biologie moléculaire différentes sur une échelle de 1 à 5 (1 = « Fortement en désaccord » à 5 = « Tout à fait d’accord »). La confiance moyenne des étudiants dans ces onze techniques a augmenté de manière significative, passant de 3,82 à 4,33 avec une grande taille d’effet (p = 2,08 × 10-11 et d = 1,09 ; Figure 5B).

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Figure 5 : Confiance accrue des étudiants dans leur compréhension de la biologie moléculaire et des termes et techniques de clonage à la suite du projet indépendant. Diagrammes en boîte à moustaches de la confiance des étudiants dans les termes (A) et les techniques (B) de biologie moléculaire dans les pré et post-questionnaires (pré-questionnaires et post-questionnaires de l’assemblage de Gibson dans le fichier supplémentaire 6 et le fichier supplémentaire 7, respectivement). Pour la confiance en terme (panneau A), les élèves ont choisi la confiance sur une échelle en 4 parties (1-« Je n’ai aucune idée de ce que signifie ce terme » à 4-« Je sais ce que signifie ce terme et je pourrais facilement l’expliquer à quelqu’un d’autre » ; taille de l’échantillon n de 45). La confiance dans les techniques de laboratoire (panel B) a été évaluée sur une échelle de 5 parties (1-Fortement en désaccord à 5-Tout à fait d’accord ; taille de l’échantillon n de 42). Les scores moyens avant et après ont été analysés à l’aide de tests t appariés bilatéraux, ce qui indique une augmentation significative de la confiance des étudiants pour les ensembles de données trimestrielles et techniques (p < 0,5). L’encadré montre les 50 % moyens (c’est-à-dire du 25au 75e centile) des réponses avec des moustaches montrant les classements de confiance subjective minimale et maximale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nous avons évalué l’augmentation de la confiance des étudiants pour chaque terme et chaque technique et avons déterminé que chaque terme, à l’exception de l’ADN polymérase et de la transformation, présentait une augmentation statistiquement significative (p < 0,05, test t apparié bilatéral ; Tableau 1). Tous les étudiants, sauf un, ont indiqué « Je sais ce que signifie ce terme et je pourrais facilement l’expliquer à quelqu’un d’autre » pour le terme ADN polymérase dans les questionnaires avant et après, de sorte qu’il n’y avait pas place à l’amélioration pour ce terme (tableau 1). Pour le trimestre de la Transformation, 73,91 % des étudiants ont choisi le niveau de confiance le plus élevé (numéro 4 sur l’échelle) dans le sondage préalable, comparativement à 80,4 % dans le sondage suivant. Neuf des onze techniques de laboratoire évaluées ont montré une augmentation significative de la confiance des étudiants ; cela excluait les calculs de molarité et l’électrophorèse sur gel (tableau 1). En moyenne, les étudiants ont signalé des scores élevés avant le questionnaire pour ces deux techniques (4,71 et 4,57, respectivement, contre une moyenne de 3,81), indiquant que les étudiants étaient déjà confiants avec ces termes avant le projet Gibson Assembly. Les questions qui évaluaient la confiance des élèves à l’égard des questions générales de biologie (p. ex., ADN polymérase, électrophorèse sur gel, calculs de molarité) n’ont généralement pas montré de changements statistiquement significatifs (tableau 1). Cependant, toutes les questions spécialisées sur l’assemblage de Gibson ont montré des augmentations significatives avec les plus grandes tailles d’effet (d > 1,6), la technique « Gibson Assembly » montrant le plus grand changement de confiance des élèves (tableau 1 et figure 6).

Type de contenuTerme/TechniqueRéponse Moy QuestionnareSignification statistiqueAmpleur de l’effet (d)
PréPublierValeur p Oui/Non
Biochimie généraleTerme ADN polymérase3.983.98indéfiniNon0
Technique de calcul de la molarité4.714.774.45E-01Non0.130
Technique d’électrophorèse sur gel4.574.681.68E-01Non0.254
Clonage moléculaireTechnique de conception d’amorces3.053.577.23E-04Oui0.536
Technique de clonage in silico3.614.075.75E-04Oui0.533
Dépistage bleu-blanc Terme3.594.344.10E-06Oui0.655
Terme de dépistage PCR3.784.311.02E-06Oui0.936
Mandat de l’Assemblée Gibson2.873.787.41E-13Oui1.69
Technique d’assemblage Gibson2.594.201.14E-15Oui1.61

Tableau 1 : Augmentations significatives en ce qui concerne les questions sur les attitudes axées sur le clonage moléculaire, mais pas sur la biochimie générale. La moyenne du pré et du post-questionnaire (pré-questionnaires et post-questionnaires de Gibson Assembly dans le fichier supplémentaire 6 et le fichier supplémentaire 7, respectivement) pour certaines questions de terme et de technique. Des tests t bilatéraux ont été utilisés pour évaluer la signification (si p < 0,05, oui ; si p ≥ 0,05, non). Pour le terme ADN polymérase, les réponses des étudiants étaient identiques entre le pré et le post-questionnaire, donc p n’est pas défini. L’ampleur de l’effet de la comparaison des réponses des élèves pour chaque question avant et après a été déterminée à l’aide des valeurs d de Cohen (d ≥ 0,8 est considéré comme un effet important). Plus l’ampleur de l’effet est grande, plus la probabilité que les pré- et post-réponses soient distinctes au sein de l’échantillon est élevée. La taille de l’échantillon n est de 45 et 42 pour les questions trimestrielles et techniques, respectivement. Abréviation : AVG = moyenne.

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Figure 6 : Augmentation du nombre de questions d’attitude sur l’assemblage Gibson. Nombre de réponses pour les étudiants qui ont déclaré avoir confiance dans le terme d’assemblage de Gibson (A) et dans la technique (B) dans les questionnaires avant et après. Les réponses sur la confiance en termes étaient sur une échelle en 4 parties (1-« Je n’ai aucune idée de ce que signifie ce terme » à 4-« Je sais ce que signifie ce terme et je pourrais facilement l’expliquer à quelqu’un d’autre »). Les réponses de confiance en la technique de laboratoire variaient de 1-Fortement en désaccord à 5-Fortement d’accord. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nous avons ensuite évalué si les facteurs liés aux antécédents de l’étudiant ont un impact sur la quantité d’apprentissage qu’il a apprise du projet indépendant. Il a été démontré que les écarts de perception de la réussite19 et de performance20 persistent dans les cours de STIM de premier cycle en raison du sexe ; ainsi, nous avons utilisé le gain d’apprentissage normalisé (NLG) et des tests t non appariés pour déterminer si un écart similaire entre les sexes a été observé dans ces projets indépendants. D’après ces tests statistiques, nous n’avons pas constaté que le sexe des élèves avait une incidence sur les résultats d’apprentissage des élèves. Nous avons également vérifié si des facteurs académiques tels que la majeure, la moyenne générale, les notes dans les cours précédents et la note finale dans BIO/CHEM 475 avaient un lien significatif avec les résultats d’apprentissage des étudiants du projet indépendant. Alors que les étudiants qui se sont spécialisés en biochimie (tableau supplémentaire S1 et tableau supplémentaire S2) avaient des moyennes moyennes et des notes finales de cours plus élevées et chacun d’entre eux affichait individuellement un NLG moyen plus élevé, les tests t non appariés n’ont montré aucune signification statistique entre ces facteurs de base individuels et les résultats d’apprentissage. Des tests t non appariés ont également été utilisés pour évaluer les différences de NLG entre les cohortes de 2022 et de 2023. On a constaté que le gain d’apprentissage de la cohorte de 2023 était significativement plus élevé que celui de la cohorte de 2022 pour les questions de contenu (tableau supplémentaire S3). Cela indique que, malgré le taux de réussite du clonage plus faible de la cohorte de 2023, ils ont acquis une meilleure compréhension de la biologie moléculaire et des concepts de clonage moléculaire que la cohorte de 2022. Bien que les raisons de cette différence ne soient pas claires, ces données montrent que le succès du clonage n’est pas nécessaire pour une éducation efficace avec ce module.

En plus d’évaluer la maîtrise des techniques de laboratoire par les étudiants, nous avons évalué leurs attitudes à l’égard de l’expérience du projet et des carrières en biologie moléculaire. Une question, présentée dans les évaluations avant et après le projet, évaluait leur niveau d’aisance à poursuivre des carrières impliquant des techniques de biologie moléculaire. Les résultats révèlent que le projet a considérablement amélioré l’aisance des étudiants dans les carrières en biologie moléculaire (p = 8,46 × 10-5), le score moyen passant de 3,60 à 4,09 sur notre échelle de 1 à 5. De plus, le questionnaire post-projet comprenait des questions sur le dévouement des étudiants à maximiser leur expérience d’apprentissage et leur évaluation de la valeur du projet. Les répondants ont évalué leur engagement à une moyenne de 4,48 et ont considéré le projet comme une opportunité d’apprentissage très précieuse, avec un score d’évaluation moyen de 4,73. Pris ensemble, ces résultats soulignent la valeur du projet indépendant dans la croissance académique des étudiants ainsi que l’enthousiasme et la confiance dans les efforts de biologie moléculaire.

Tableau supplémentaire S1 : Données brutes anonymisées. Toutes les réponses et les majeures des étudiants des pré et post-questionnaires qui ont été collectés lors des itérations 2022 et 2023 du module Gibson Assembly CURE. Reportez-vous au fichier supplémentaire 6 et au fichier supplémentaire 7 pour voir les questions préalables et postérieures correspondantes, respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S2 : Différences dans le gain d’apprentissage normalisé par majeure pour chaque section du questionnaire. Des tests t non appariés ont déterminé qu’aucun type de question ne présentait de différences significatives dans le gain d’apprentissage normalisé (NLG ) par majeur (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau supplémentaire S3 : Différence dans le gain d’apprentissage normalisé par cohorte pour chaque section du questionnaire. Des tests t non appariés ont montré que la cohorte de 2023 avait un gain d’apprentissage normalisé (NLG) significativement plus élevé pour les questions de contenu par rapport à la cohorte de 2022 (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Manuel de l’instructeur pour le module d’assemblage Gibson CURE. Un guide pour les instructeurs sur la mise en œuvre du module Gibson Assembly CURE. Des instructions étape par étape sont fournies aux instructeurs pour se préparer au cours en concevant et en sélectionnant des amorces d’assemblage Gibson en fonction du modèle qui les intéresse. Les sujets et les activités que les instructeurs doivent couvrir pendant chaque cours et la période de laboratoire pour les expériences A à C sont décrits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Manuel de l’étudiant pour le module Gibson Assembly CURE. Un manuel à fournir aux étudiants, comprenant des informations de base pertinentes sur l’assemblage Gibson et les protocoles étape par étape pour chaque expérience (A-C). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Feuilles de travail de planification de l’expérience A (individuelles et en équipe). Feuilles de travail individuelles et en équipe pour que les élèves comprennent et se préparent à l’amplification PCR pour le(s) fragment(s) d’assemblage Gibson. Une seule de ces feuilles de travail doit être attribuée par l’instructeur en fonction de la structure du projet indépendant (individuel ou en équipe). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Feuille de planification de l’expérience B. Feuille de travail de l’élève pour aider dans les calculs nécessaires à la configuration de la réaction de l’assemblage Gibson. Le nombre de fragments dans la feuille de travail peut être ajusté en fonction du plan de clonage des plasmides d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 5 : Feuille de planification de l’expérience C. Feuille de travail de l’élève pour aider à la conception d’une expérience de digestion de restriction ou de PCR pour dépister le plasmide d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 6 : Pré-questionnaire sur l’assemblage Gibson. Questionnaire de vingt-huit questions remis aux étudiants avant le début du module CURE de l’assemblage Gibson. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 7 : Post-questionnaire sur l’assemblage de Gibson. Questionnaire de trente questions remis aux étudiants après avoir terminé le module Gibson Assembly CURE. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 8 : Dossier zip contenant les fichiers de séquence GenBank (.gb) d’un gène de polycétide hydroxylase, d’un vecteur pUC19 et d’un plasmide assemblé par Gibson, et tableau des amorces représentatives. Reportez-vous à ces fichiers pour obtenir un exemple de conception d’amorce dans l’assistant d’assemblage de banc et pour compléter les feuilles de planification expérimentales. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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Ici, nous proposons un projet de laboratoire de premier cycle ajustable qui enseigne aux étudiants le clonage moléculaire par Gibson Assembly dans un cadre de recherche basé sur un cours. Au total, 28 nouveaux plasmides ont été clonés par des étudiants de premier cycle dans une salle de classe. Le succès individuel rapporté par les élèves variait de 44,4 % à 81,8 % sur trois cohortes, et le succès global du clonage était de 80 % (28 des 35 plasmides attribués ont été clonés avec succès). La baisse du succès du clonage en 2023 est probablement due à deux facteurs aggravants. Tout d’abord, des tubes d’échantillons d’ADN ont été étiquetés avec des noms très étroitement apparentés ; il est possible qu’il y ait eu des confusions dans les matrices d’ADN préparées par les étudiants chercheurs, ce qui a conduit à la combinaison de fragments linéaires non compatibles lors de la réaction d’assemblage de Gibson effectuée par les étudiants du laboratoire d’enseignement. Dans les futures itérations de ce projet, l’ADN modèle devrait d’abord être séquencé ou analysé avec un condensé de restriction pour confirmer l’identité correcte avant d’être fourni aux étudiants. Deuxièmement, l’itération 2023 de ce projet consistait en des assemblages de quatre fragments (un vecteur et trois inserts), contre des assemblages de deux fragments les années précédentes (un vecteur et un insert). Cela a peut-être également réduit le succès du clonage pour ce projet, car plus de fragments dans l’assemblage Gibson peuvent réduire l’efficacité de la réaction22. Dans les futures itérations de ce projet, une plus grande redondance peut être intégrée en faisant cloner le même plasmide par plus de groupes ou en demandant à des groupes de configurer plusieurs réactions d’assemblage Gibson à différents rapports insert/vecteur pour augmenter la probabilité de ligature et de transformation réussies du plasmide. De plus, l’inclusion de chevauchements plus longs entre les fragments et l’augmentation du temps d’incubation de la réaction de l’assemblage Gibson peuvent augmenter le succès des assemblages de 4 à 6 fragments23.

En plus du clonage de nouveaux plasmides, les résultats de l’enquête avant et après le projet indiquent que les étudiants ont amélioré leur compréhension de la biologie moléculaire et des concepts de clonage moléculaire, avec la taille d’effet la plus élevée pour les questions relatives au clonage de l’assemblage Gibson. De plus, la confiance des étudiants dans les termes de biologie moléculaire et les techniques de laboratoire s’est considérablement améliorée après la fin du projet pour la majorité des personnes évaluées. L’assemblage Gibson est une technique de clonage moléculaire importante et polyvalente utilisée dans la recherche universitaire et dans l’industrie de la biotechnologie2. En enseignant ces concepts et ces compétences pratiques dans un cours de laboratoire, tous les étudiants de premier cycle ont des chances égales d’obtenir leur diplôme avec des compétences en recherche et des compétences embauchables lorsqu’ils entrent sur le marché du travail ou poursuivent leur formation.

Le programme d’assemblage Gibson décrit comprend les cinq composantes d’un CURE4 réussi. Les étudiants ont utilisé des pratiques scientifiques en concevant leurs propres protocoles, y compris des objectifs et des attentes basés sur la taille des amplicons PCR et les coupes de digestion de restriction (Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4 et Fichier supplémentaire 5). Le projet indépendant favorise la collaboration des étudiants en répartissant la préparation de chaque fragment requis entre les membres d’un groupe et, en fin de compte, en utilisant les fragments de chaque membre du groupe dans une réaction de ligature (Expérience : une feuille de planification (basée sur l’équipe) dans le fichier supplémentaire 3). Les plasmides que ces projets indépendants visaient à cloner sont de nouveaux plasmides d’expression pertinents pour les projets de recherche en dehors de la salle de classe, fournissant potentiellement des données pour des recherches publiables. À l’instar d’une expérience de recherche plus traditionnelle, les taux de réussite du clonage dans le cours CURE n’étaient pas de 100 %. Les étudiants ont été invités à évaluer des variables qui auraient pu donner des résultats négatifs et à proposer des hypothèses expliquant pourquoi le plasmide n’a pas été cloné avec succès, ce qui constitue une expérience d’apprentissage authentique pour les étudiants concernant les résultats de la recherche.

Dans cette itération de Gibson Assembly CURE, les étudiants ont cloné des plasmides pertinents pour la recherche sur les produits naturels Actinomycetota ; Cependant, le flux de travail a été conçu pour être hautement adaptable à d’autres projets également. Les protocoles présentés ici sont généralisés, permettant aux étudiants de cloner des plasmides qui pourraient être utilisés à des fins de recherche multiples au sein de six réunions de laboratoire et de deux conférences. Le cadre permet aux étudiants de cloner de nouveaux plasmides individuellement, ou aux étudiants de travailler ensemble pour cloner un seul plasmide à partir de >2 fragments linéaires dans une approche d’équipe. Dans l’ensemble, cette approche peut être adaptée pour s’adapter à un large éventail de projets de recherche qui peuvent nécessiter une utilisation variable de l’assemblage Gibson.

Cette étude a évalué les gains d’apprentissage des étudiants grâce à une approche basée sur CURE pour l’enseignement de l’assemblage Gibson, mais des informations supplémentaires pourraient être obtenues en élargissant l’étude. Bien que le format pré et post-questionnaire ait permis d’évaluer les résultats d’apprentissage grâce au projet indépendant, aucune comparaison avec l’enseignement magistral de Gibson Assembly n’a été effectuée. Une comparaison du CURE basé sur l’expérience à une activité de cours magistral ou à une activité de laboratoire plus traditionnelle, où les résultats expérimentaux sont déjà conçus pour les étudiants, fournirait plus de renseignements si les résultats d’apprentissage améliorés de l’assemblage de Gibson sont spécifiques au modèle de cours CURE. Enfin, si certaines questions de contenu relatives à Gibson Assembly ont montré des améliorations significatives dans la compréhension, d’autres ne l’ont pas fait. Les questions relatives aux chevauchements homologues utilisés dans l’assemblage Gibson, comment ils sont installés et comment ils se recombinent dans une réaction de clonage d’assemblage Gibson ne se sont pas améliorées. Cela suggère qu’une explication plus poussée ou une évaluation supplémentaire de l’apprentissage sur ces sujets pourrait améliorer la compréhension des élèves dans les futures mises en œuvre de ce programme.

La structure de projet indépendante de Gibson Assembly continue d’être mise en œuvre à Cal Poly. Dans les futures itérations du cours, ce projet sera modifié pour permettre une plus grande indépendance des étudiants, la génération d’hypothèses et la conception expérimentale. Un changement de programme à venir à Cal Poly offre l’occasion d’étendre le projet indépendant pour inclure la conception d’amorces dirigée par les étudiants, la sélection du squelette vectoriel, l’analyse de séquences et/ou les tests en aval des plasmides, par exemple pour l’expression des protéines. De plus, le projet indépendant pourrait être personnalisé pour enseigner d’autres techniques de biologie moléculaire pertinentes, telles que la mutagenèse dirigée ou l’édition de gènes, en fonction des besoins des projets de recherche en cours. Modifier les techniques utilisées par les étudiants dans le cadre du projet indépendant pourrait permettre de mieux faire preuve de discernement sur les sujets qui conviennent au format CURE et ceux qui s’avèrent difficiles à mettre en œuvre.

Dans l’ensemble, ce rapport détaille un module d’enseignement adaptable de l’assemblage Gibson qui met en œuvre un CURE pour améliorer la compréhension des étudiants d’une méthodologie de clonage émergente et pour accroître les compétences dans le processus scientifique. Le projet indépendant a amélioré les résultats d’apprentissage des étudiants et la confiance dans la majorité des termes et techniques de biologie moléculaire évalués. Nous encourageons l’utilisation et l’adaptation de ce module non seulement pour créer de nouveaux plasmides de recherche, mais aussi pour améliorer l’accessibilité et la confiance des étudiants dans les techniques de recherche, en préparant mieux les étudiants de premier cycle à de futures carrières dans les STIM. Idéalement, ces travaux inspireront des améliorations dans les programmes de biologie moléculaire et encourageront l’adaptabilité des cours STEM à mesure que les méthodologies de recherche scientifique continuent d’évoluer.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient chaleureusement Andrea Laubscher pour son soutien technique, ainsi que Michael Black, Sandi Clement et Javin Oza pour leurs discussions utiles sur la mise en œuvre du laboratoire d’enseignement et l’évaluation des résultats d’apprentissage. Les auteurs remercient tous les étudiants qui ont participé à l’étude sur les résultats d’apprentissage dans les cohortes de 2019, 2022 et 2023, ainsi que les étudiants Nathan Kuhn et Aayushi Adettiwar qui ont aidé à la préparation des réactifs pour la mise en œuvre du laboratoire d’enseignement. Les auteurs remercient également le soutien financier du Fonds William et Linda Frost, de la subvention de dotation Chevron Biotechnology Applied Research du Center for Applications in Biotechnology et de la National Science Foundation (NSF-1708919 et NSF-2300890).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Déoxyribonucléotide triphosphate (dNTPs, 10  ; mM)Fisher ScientificFERR0191Composant MasterMix fait maison
Dithiothreitol (DTT)Fisher ScientificFERR0861Composant MasterMix
fait maison DpnI  ;New England BiolabsR0176S1000 unités
Fisherbrand Isotemp Incubateur microbiologiqueFisher Scientific15-103-0513
FisherBrand Isotemp Bain d’eauFisher ScientificS28124
GelRed Nucleic Acid Gel StainBiotiumNC959471910,000X
GeneJET Gel Extraction et nettoyage de l’ADN Micro KitThermo ScientificFERK0831100
préparations GeneRuler 1 kb Échelle d’ADNFisher ScientificFERSM0314100 applications
LB Broth, MillerFisher BioReagentsBP9723-500500 g
Chlorure de magnésium hexahydratéFisher ScientificBP214-500Composant MasterMix fait maison Mastercycler
nexus X2 Thermocycler GradientEppendorf6337000027
Microfuge 16 CentrifugeuseBeckman CoulterA46474
Micromonospora echinospora bactérieAmerican Type Culture CollectionATCC 15837
Four à micro-ondesGeneral Electric  ;
Biologie moléculaire Qualité AgaroseFisher BioReagentsBP160-100100 g
Nanodrop Spectrophotomètre à un microvolumeThermo Scientific13-400-518
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2987H20 x 0,05 mL
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BiolabsE2621S10 réactions
New Brunswick Innova 40 Agitateur orbital de paillasseNouveau-BrunswickM1299-0090
Réactifs biologiques de pêcheà l’eau sans nucléasesBP24845050 mL
PEG-8000² ;Fisher ScientificBP233-100Composant MasterMix fait maison
Phusion ADN polyméraseNew England BiolabsM0530Composant MasterMix fait maison
Portable BalanceOhausSKX123
pUC19 vecteurNew England BiolabsN3041S
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix  ;New England BiolabsM0492S100 réactions
T5 ExonucléaseEpicentreT5E4111KFait maison' Composant MasterMix Taq
DNA LigaseNew England BiolabsM0208Fait maison' Composant MasterMix
Tris-HClFisher ScientificAAA1137918Fait maison' Composant MasterMix
TriTrack DNA Gel Colorant de chargement (6x)Thermo ScientificFERR11615 x 1 mL
Zyppy Plasmid Miniprep KitZymo ResearchD4019100 Preps
&beta ;-Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+)New England BiolabsB9007SHomemade' MasterMix component
2440640

Références

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