Ensemble hybride et dosage d’une seule molécule pour imager le mouvement d’une CMG entièrement reconstituée

Résumé

Nous rapportons un ensemble hybride et un test à molécule unique pour imager et quantifier directement le mouvement de l’hélicase Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) entièrement reconstituée et marquée par fluorescence sur des molécules d’ADN linéaires maintenues en place dans un piège optique.

Résumé

Les eucaryotes ont une hélicase réplicative connue sous le nom de CMG, qui organise et pilote de manière centralisée le réplisome, et ouvre la voie à l’avant des fourches de réplication. L’obtention d’une compréhension mécaniste approfondie de la dynamique de la CMG est essentielle pour élucider comment les cellules accomplissent l’énorme tâche de répliquer efficacement et avec précision l’ensemble de leur génome une fois par cycle cellulaire. Les techniques à molécule unique sont particulièrement adaptées pour quantifier la dynamique de la CMG en raison de leur résolution temporelle et spatiale inégalée. Néanmoins, les études sur des molécules uniques du mouvement de la CMG se sont jusqu’à présent appuyées sur des CMG préformés purifiés à partir de cellules en tant que complexe, ce qui exclut l’étude des étapes menant à son activation. Ici, nous décrivons un ensemble hybride et un test à molécule unique qui a permis d’imager au niveau de la molécule unique le mouvement de la CMG marquée par fluorescence après avoir entièrement reconstitué son assemblage et son activation à partir de 36 polypeptides différents purifiés de S. cerevisiae . Ce test repose sur la double fonctionnalisation des extrémités d’un substrat d’ADN linéaire avec deux fractions de fixation orthogonales, et peut être adapté pour étudier des mécanismes de traitement de l’ADN tout aussi complexes au niveau de la molécule unique.

Introduction

La réplication de l’ADN chez les eucaryotes est effectuée par un complexe protéique dynamique connu sous le nom de réplisome¹. Un composant clé de ce complexe est l’hélicase réplicative eucaryote Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), qui pilote et organise de manière centralisée le réplisome, ouvrant la voie à l’avant des fourches^{de réplication 1,2}. L’obtention d’une compréhension quantitative approfondie de la dynamique de la CMG est donc essentielle pour comprendre la dynamique du réplisome. Une telle compréhension pourrait être acquise avec des techniques à molécule unique, qui sont particulièrement adaptées à l’étude des moteurs moléculaires, tels que la CMG, en raison de leur résolution spatiale et temporelle inégalée, et peuvent nous fournir une compréhension quantitative inégalée de leur fonction, de leur stochasticité et de leur dynamique 2,3,4,5,6,7,8,9.

In vivo, la CMG est chargée et activée de manière séparée dans le temps pour s’assurer que la réplication ne se produit qu’une seule fois par cycle cellulaire ^1,10,11. Tout d’abord, dans la phase G1 du cycle cellulaire, un ensemble de protéines connues sous le nom de facteurs de charge charge le premier composant de CMG, le complexe hexamère Mcm2-7, sur l’ADNdb 12,13,14,15,16 sous la forme d’hexamères doubles avec une configuration en tête-à-tête 15,17,18. Dans le cas spécifique de la levure, ce processus initial se produit au niveau de séquences d’ADN spécifiques appelées origines de la réplication¹. Bien que Mcm2-7 soit le noyau moteur de l’hélicase réplicative, il est par lui-même incapable de dérouler l’ADN¹⁹ sans les deux facteurs d’activation de l’hélicase Cdc45 et GINS, qui doivent être recrutés dans le Mcm2-7 chargé pour donner naissance à la CMG 11,19,20,21 pleinement active. Le processus d’activation hélicase a lieu dans la phase S du cycle cellulaire et commence par la phosphorylation sélective des doubles hexamères Mcm2-7 par la kinase DDK 22,23,24 régulée par le cycle cellulaire. Ces événements de phosphorylation facilitent le recrutement de Cdc45 et GINS vers les doubles hexamères Mcm2-7 10,22,23,24,25,26 par un deuxième ensemble de protéines appelées facteurs de décharge 10,11,26 . La liaison de Cdc45 et de GINS donne naissance à deux hélicases CMG sœurs, qui renferment initialement les deux brins de l’ADN parental et sont toujours situées dans une configuration tête à tête^11,27. Dans l’étape finale d’activation, le facteur de décharge Mcm10 catalyse l’extrusion dépendante de l’ATP d’un brin d’ADN de chaque CMG¹¹ sœur. Après l’extrusion du brin, les hélicases sœurs CMG contournent et se séparent les unes des autres en se déplaçant le long de l’ADNss de manière dépendante de l’hydrolyse de l’ATP 11,20,21,28, déroulant l’ADN en excluant stériquement le brin de non-translocation 29. L’ensemble de ce processus a été entièrement reconstitué in vitro à partir d’un ensemble minimal de 36 polypeptides purifiés de S. cerevisiae ^10,11.

Malgré la régulation in vivo exquise de l’assemblage et de l’activation de la CMG décrite ci-dessus, les études in vitro du mouvement de la CMG 2,30,31,32,33,34 se sont jusqu’à présent appuyées sur la CMG pré-activée purifiée en tant que complexe à partir de cellules^20,21, manquant toutes les étapes précédant son activation et la nature bidirectionnelle de son mouvement. Cette approche CMG pré-activée a été la référence dans le domaine des molécules uniques, en partie en raison de la complexité biochimique de la réaction d’assemblage de CMG entièrement reconstituée^10,11. Cette réaction biochimique a été difficile à transposer du niveau biochimique en vrac au niveau de la molécule unique pour plusieurs raisons. Tout d’abord, pour maximiser l’efficacité de la réaction, les facteurs de charge et d’allumage nécessaires à l’assemblage et à l’activation de la CMG sont nécessaires à des concentrations comprises entre 10 et 200 nM 10,11,27. Ces plages de concentration correspondent à l’extrémité supérieure de ce que la plupart des techniques à molécule unique peuvent tolérer, en particulier lors de l’utilisation de composants marqués par fluorescence³⁵. Enfin, CMG a évolué pour parcourir des milliers de paires de bases dans une cellule 36,37,38,39. Par conséquent, pour étudier son mouvement à une échelle spatiale biologiquement pertinente, il faut de longs substrats d’ADN (généralement de longueurs de l’ordre de dizaines de kilobases)30,31,34,40,41,42. L’utilisation de substrats d’ADN aussi longs pose le défi supplémentaire que plus le substrat d’ADN est long, plus il a de sites de liaison non spécifiques potentiels pour les protéines et les agrégats de protéines. Dans le cas de la CMG, ce dernier point est particulièrement important, car plusieurs des facteurs de charge et de tir impliqués dans l’assemblage et l’activation de la CMG contiennent des régions intrinsèquement désordonnées⁴³ et sont sujets à l’agrégation.

Ici, nous rapportons un ensemble hybride et un test monomoléculaire qui a permis l’observation et la quantification du mouvement de la CMG après avoir entièrement reconstitué son assemblage et son activation à partir de 36 polypeptides purifiés de S. cerevisiae ²⁸. Ce test repose sur la double fonctionnalisation des deux extrémités d’un substrat d’ADN avec deux fractions de fixation orthogonales : la desthiobiotine et la digoxigénine² (Figure 1A). La première fraction, la desthiobiotine, est utilisée pour lier de manière réversible le substrat de l’ADN à des billes magnétiques enrobées de streptavidine⁴⁴ (figure 1B). Ensuite, la CMG marquée par fluorescence est assemblée et activée sur l’ADN lié aux billes, et un support magnétique est utilisé pour purifier et laver les complexes ADN :CMG liés aux billes magnétiques qui en résultent (Figure 1C). Ce faisant, l’excès de protéine qui s’agrègerait autrement sur le substrat de l’ADN est éliminé ; cela fournit des complexes DNA :CMG pratiquement sans agrégation. Des complexes intacts sont ensuite élués des billes magnétiques par l’ajout d’un excès molaire de biotine libre, qui peut supplanter l’interaction desthiobiotine-streptavidine (Figure 1D). Des complexes individuels d’ADN :CMG sont ensuite liés entre deux billes de polystyrène piégées optiquement enrobées d’un anticorps anti-digoxigénine (anti-Dig) ; pour cette étape, la deuxième fraction de l’ADN, la digoxigénine, est utilisée car elle peut se lier à l’anti-Dig même dans une solution tampon contenant un excès de biotine libre (Figure 1E). Une fois que le complexe DNA :CMG est maintenu en place dans le piège optique, le mouvement de la CMG marquée par fluorescence est imagé à l’aide d’un laser à balayage confocal (Figure 1F). Nous prévoyons que ce test pourra être facilement adapté à l’étude au niveau d’une seule molécule d’interactions ADN-protéines tout aussi complexes.

Protocole

1. Synthèse d’un substrat d’ADN linéaire doublement fonctionnalisé et liaison à des billes magnétiques

1. Double fonctionnalisation d’un substrat d’ADN avec des fractions de desthiobiotine et de digoxigénine
   1. Linéariser 20 μg du plasmide pGL50-ARS1 de 23,6 kb (contenant une origine naturelle de réplication ARS1, cloné en interne et disponible sur demande) avec 200 unités d’enzyme de restriction AflII pendant 16 h à 37 °C dans un volume final de 200 μL de 1x tampon (50 mM d’acétate de potassium, 20 mM d’acétate de tris, 10 mM d’acétate de magnésium, 100 μg/ml BSA, pH 7,9).
      REMARQUE : Cette étape peut être réduite à 4 h sans réduire le rendement, si cela est plus pratique.
   2. Inactiver AflII en incubant la réaction à 65 °C pendant 20 min. Atténuer les surplombs de TTAA à 4 nucléotides qui en résultent en complétant la réaction de linéarisation de 200 μL avec 60 unités de fragment de Klenow (3' à 5' exo-) polymérase, 17 μL de tampon 10x (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT, pH 7,9), 33 μM D-Desthiobiotine-7-dATP, 33 μM Digoxigénine-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, et de l’eau ultrapure jusqu’à un volume final de 370 μM. Incuber la réaction à 37 °C pendant 30 min.
      REMARQUE : Dans cette étape, le fragment de Klenow émousse les surplombs aux deux extrémités de l’ADN linéarisé en incorporant deux nucléotides de D-Desthiobiotine-7-dATP et deux nucléotides de digoxigénine-11-dUTP à chaque extrémité.
   3. Complétez la réaction avec 10 mM d’EDTA et inactivez le fragment de Klenow en incubant la réaction à 75 °C pendant 20 min. Portez le volume de réaction à 400 μL avec de l’eau ultrapure.
   4. Prenez quatre colonnes de centrifugation S-400, faites-les tourbillonner pendant au moins 30 s pour remettre la résine en suspension, puis centrifugez-les pendant 1 min à 735 x g pour retirer la mémoire tampon de stockage. Transférez les colonnes pour nettoyer les tubes de 1,5 ml.
   5. Ajouter immédiatement 100 μL de la solution d’ADN dans chaque colonne et les centrifuger pendant 2 min à 735 x g. L’ADN est maintenant dans le flux et les colonnes peuvent être jetées.
   6. Regroupez le flux des quatre colonnes, mesurez le volume à l’aide d’une pipette et mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Cela sera utilisé pour calculer la quantité d’ADN liée aux billes.
2. Liaison d’ADN linéaire doublement fonctionnalisé à des billes magnétiques enrobées de streptavidine
   1. Perles magnétiques Vortex M-280 recouvertes de streptavidine pendant 30 s pour les remettre en suspension.
   2. Transférez 4 mg de billes magnétiques enrobées de streptavidine M-280 remises en suspension dans un tube propre de 1,5 mL. Placez le tube dans un support magnétique, attendez 1 min que les billes soient collectées et retirez la mémoire tampon de stockage.
   3. Ajouter 1 mL de 1x tampon A (5 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM d’EDTA et 1 M de NaCl) aux billes et remettre en suspension par tourbillon pendant 5 s. Incuber les billes à température ambiante pendant 5 min.
      REMARQUE : Tous les tampons doivent être filtrés de manière stérile. Préparez au préalable un grand volume de 2x tampon A, 1x tampon B (voir ci-dessous) et 1x tampon C (voir ci-dessous) pour gagner du temps (recommandé). Ces tampons sont ceux recommandés par le fabricant des billes magnétiques et peuvent être stockés à - 20°C.
   4. Placez le tube dans un support magnétique, attendez 1 min que les billes soient collectées et retirez le tampon A.
   5. Remettre les billes en suspension dans 400 μL de tampon 2x A par pipetage, puis ajouter 400 μL de solution d’ADN fonctionnalisée (notez que cela dilue le tampon 2x A à une concentration finale de 1x, ce qui est optimal pour la liaison de l’ADN aux billes). Mélanger délicatement par pipetage.
   6. Incuber le mélange bille / ADN pendant la nuit à 4 °C avec rotation de bout en bout pour permettre à l’ADN fonctionnalisé de se lier aux billes.
   7. Utilisez le support magnétique pour retirer le surnageant (ne pas jeter avant d’avoir mesuré son volume avec une pipette et la concentration d’ADN non lié avec un spectrophotomètre) et lavez les billes 2x avec 500 μL de tampon B (10 mM HEPES-KOH pH 7,6, 1 mM EDTA et 1 M KOAc) pour éliminer l’ADN non spécifiquement lié. Lavez les billes 2 fois avec 500 μL de tampon C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 et 1 mM EDTA), qui est le tampon de stockage recommandé par le fabricant.
      1. Calculez la quantité totale d’ADN liée aux billes magnétiques en comparant la quantité totale d’ADN ajoutée aux billes avec la quantité d’ADN laissée dans le surnageant. Le rendement devrait être de l’ordre de 2,3 à 2,9 mg d’ADN (~150 à 190 fmol) par mg de billes magnétiques. Si des rendements plus faibles sont obtenus, vérifiez que les colonnes S400 ne sont pas sèches avant de les utiliser. Surveiller constamment l’intégrité de l’ADN par électrophorèse sur gel pour s’assurer que le substrat initial de l’ADN plasmidique n’est pas dégradé.
   8. Remettre les billes en suspension dans 300 μL de tampon C et les stocker à 4 °C. Pour éviter les entailles, faites 4 aliquotes à usage unique de 1 mg de billes magnétiques, et ne stockez pas l’ADN plus de 2 semaines.

2. Ensemble hybride et test monomoléculaire pour imager et quantifier le mouvement d’une CMG entièrement reconstituée avec une pince optique corrélative à double faisceau et une microscopie confocale

1. Assemblage d’ensemble et activation de CMG marqués par fluorescence sur de l’ADN lié à des billes magnétiques (Graphique 1C).
   REMARQUE : Les réactions d’assemblage et d’activation de la CMG ont été réalisées en deux étapes : la charge et la phosphorylation de Mcm2-7, et l’assemblage et l’activation de la CMG. Sauf indication contraire, toutes les étapes d’échange de tampon ont été effectuées à l’aide d’un support magnétique en permettant aux billes d’être collectées par l’aimant pendant 1 min, puis en retirant le surnageant. Toutes les incubations ont été menées dans un bloc thermique à température contrôlée avec un couvercle pour empêcher le photoblanchiment des protéines fluorescentes. S’il n’y a pas de couvercle, les tubes doivent être recouverts de papier d’aluminium. La purification et le marquage fluorescent de toutes les protéines employées dans ce protocole ont été effectués comme décrit précédemment^10,11,28.
   1. Chargement et phosphorylation de Mcm2-7
      1. Prélever 1 mg de billes magnétiques enrobées de streptavidine liées à l’ADN et retirer le tampon de stockage (tampon C).
      2. Lavez les billes avec 200 μL de tampon de charge (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM de glutamate K, 10 mM de MgOAc, 0,02 % de substitut NP40, 10 % de glycérol, 2 mM de DTT, 100 μg/mL de BSA et 5 mM d’ATP).
      3. Retirez le tampon de chargement et remettez les billes en suspension dans 75 μL de tampon de chargement. Mélanger délicatement par pipetage.
      4. Ajouter de l’ORC à une concentration finale de 37,5 nM à l’ADN lié aux billes et incuber la réaction pendant 5 min à 30 °C avec une agitation de 800 tr/min.
      5. Ajouter Cdc6 à une concentration finale de 50 nM et incuber la réaction pendant 5 min à 30 °C avec une agitation de 800 tr/min.
      6. Ajouter Mcm2-7/Cdt1 (ou Mcm2-7^{JF646-Halo-Mcm3}/Cdt1 marqué par fluorescence) à une concentration finale de 100 nM et incuber la réaction pendant 20 min à 30 °C avec une agitation de 800 tr/min.
      7. Ajouter du DDK à une concentration finale de 100 nM et incuber la réaction pendant 30 min à 30 °C avec une agitation de 800 tr/min.
      8. Retirer le surnageant et laver l’ADN lié aux billes (qui contient maintenant des hexamères Mcm2-7 phosphorylés) avec 200 μL de tampon à haute teneur en sel (HSW) (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02 % de substitut NP40, 10 % de glycérol, 1 mM de DTT et 400 μg/mL de BSA). Mélanger par pipetage, en veillant à ce que les billes soient complètement remises en suspension dans le tampon et qu’aucun grumeau ne soit visible.
      9. Retirez le tampon HSW et lavez les billes une fois avec 200 μL de tampon CMG (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM de glutamate K, 10 mM de MgOAc, 0,02 % de substitut NP40, 10 % de glycérol, 1 mM de DTT et 400 μg/mL de BSA).
   2. Assemblage et activation de CMG marqués par fluorescence
      1. Retirez le tampon CMG et remettez en suspension les billes liées à l’ADN dans 50 μL de tampon CMG complété par 5 mM d’ATP.
      2. Ajoutez 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45^LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 et 10 nM Mcm10 à l’ADN lié aux billes. Pour cette étape, mélangez toutes les protéines dans un tube immédiatement avant de les ajouter à l’ADN et placez-le sur de la glace. Ajoutez l’ADN lié aux billes en suspension au mélange de protéines. Incuber la réaction pendant 15 min à 30 °C avec une agitation de 800 tr/min.
      3. Lavez les billes 3 fois avec 200 μL de tampon HSW. Lavez les billes une fois avec 200 μL de tampon CMG.
   3. Élution de complexes d’ADN intact : CMG à partir de billes magnétiques (Figure 1D)
      1. Éliminer le tampon CMG et éluer les complexes ADN :CMG des billes magnétiques en remettant en suspension les billes magnétiques liées à l’ADN contenant du CMG dans 200 μL de tampon d’élution (tampon CMG complété par 10 mM de biotine). Incuber à température ambiante pendant 1 h avec une agitation de 800 tr/min.
      2. Placez le tube dans une grille magnétique et laissez les billes être collectées pendant 5 min. Collectez soigneusement le surnageant (qui contient maintenant les complexes ADN :CMG élués) sans perturber les billes déposées et transférez-le dans un nouveau tube.
      3. Pour s’assurer qu’il ne reste pas de billes dans la solution (car les billes magnétiques laissées en solution peuvent interférer avec la partie piégeage optique du dosage), placez à nouveau le surnageant collecté dans une grille magnétique et laissez les billes restantes être collectées pendant encore 5 min. Prélevez soigneusement le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube.
      4. Ajoutez 1400 μL de tampon CMG aux 200 μL de surnageant. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie d’une molécule unique.
2. L’imagerie monomoléculaire d’une CMG entièrement reconstituée à l’aide d’une pince optique corrélative à double faisceau et d’une microscopie confocale (Graphique 1E-G).
   REMARQUE : La partie monomoléculaire de l’essai est réalisée dans une configuration commerciale qui combine une pince optique à double faisceau avec la microscopie confocale et la microfluidique^45,46 (Graphique 1E-G), mais peut également être réalisée dans une configuration artisanale. La configuration commerciale utilisée ici est équipée d’une cellule d’écoulement microfluidique à cinq entrées (appelées canaux 1 à 5, respectivement) et une sortie (Graphique 1E). Dans les étapes ci-dessous, tous les noms de boutons et/ou de panneaux sont spécifiques au logiciel fourni avec cette configuration commerciale.
   1. Utilisez les cinq entrées dans la configuration commerciale comme suit : injectez les canaux 1 à 3 par la gauche et utilisez-les pour le piégeage des billes (canal 1), la liaison du complexe ADN-protéine (canal 2) et la vérification de la présence de CMG (canal 3). Utilisez les canaux 4 et 5 comme réservoirs de protéines et lieux d’échange de tampons. Avant chaque expérience, passivez la cellule d’écoulement microfluidique pendant au moins 30 minutes avec 1 mg/mL d’albumine sérique bovine, suivie de 0,5 % de Pluronic F-127 dissous dans de l’eau ultrapure.
      1. S’assurer que le contenu de chaque canal de chaque expérience est conforme à la description (Figure 1E) :
         Canal 1 : billes de polystyrène enrobées d’anti-digoxigénine (2,06 μm de diamètre) diluées 1:50 dans du PBS ;
         Canal 2 : Complexes ADN :CMG élués par des billes magnétiques ;
         Canal 3 : Tampon d’imagerie (tampon CMG complété par 2 mM de 1,3,5,7 cyclooctatétraène, 2 mM de 4-nitrobenzylalchohol et 2 mM de Trolox) ;
         Canaux 4 et 5 : tampon d’imagerie complété par 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 et 5 mM ATP, 5 mM ATPγS ou aucun nucléotide.
   2. Avant l’expérience, ajustez la puissance du laser de piégeage pour obtenir une rigidité de 0,3 pN/nm dans les deux pièges^33,46 en cliquant sur le bouton Re-calibrer dans le panneau Commandes d’alimentation du logiciel. Réglez la taille des pixels confocaux sur 50 x 50 nm, la taille de l’image sur 160 x 18 pixels, le temps d’éclairage par pixel sur 0,2 ms et la fréquence d’images sur 5 s dans le panneau Balayage d’image du logiciel. Réglez la commande de température sur 30 °C dans le panneau Température.
      REMARQUE : De plus, nous vous recommandons de régler la vitesse maximale de la platine (utilisée pour se déplacer entre les canaux) à 0,2 mm/s afin de minimiser la dissociation de la CMG de l’ADN par la force de traînée.
   3. Versez toutes les solutions dans la cellule d’écoulement à une pression constante de 0,5 bar dans l’orifice d’injection (qui peut être configurée dans le panneau Pressure Bar du logiciel). Ensuite, coupez le débit dans les canaux 4 et 5. Après avoir initialement écoulé toutes les solutions, réduisez la pression à 0,2 bar.
   4. Déplacez les lasers de piégeage vers le canal 1 jusqu’à ce qu’une perle soit prise dans chaque piège optique. Déplacez les billes piégées vers le canal 2 en déplaçant le joystick tout en appuyant sur la gâchette. Ensuite, pêchez un complexe ADN :CMG en déplaçant la perle droite vers et loin de la perle gauche à l’aide du joystick sans appuyer sur la gâchette, jusqu’à ce qu’une attache d’ADN soit piégée (ce qui est connu en surveillant la courbe force-extension de l’ADN⁴⁷ piégé dans le panneau FD Viewer du logiciel).
      1. Pour le partage de l’ADN, assurez-vous d’entrer la longueur de l’ADN et la valeur de température correcte dans le panneau Modèle de référence, ce qui tracera automatiquement un modèle théorique de chaîne de vers extensible de type ver de la construction de l’ADN dans le panneau FD Viewer. Si une seule molécule d’ADN est coincée entre les deux billes, le comportement d’extension de la force de l’ADN doit correspondre étroitement au modèle de chaîne extensible en forme de ver. Assurez-vous que c’est le cas en surveillant la courbe expérimentale force-extension, que le logiciel tracera automatiquement au-dessus de la courbe théorique.
         REMARQUE : Les écarts par rapport au modèle théorique peuvent indiquer la présence de plusieurs molécules d’ADN liées entre les billes et/ou la présence d’agrégats de protéines liés à l’ADN et le compactant. Pour éviter la dissociation des protéines de l’ADN par la force, ne dépassez pas une tension de 10 pN lors de ce test initial.
   5. Déplacez les billes vers le canal 3 et arrêtez immédiatement le flux dans tous les canaux. Effectuez un balayage d’essai d’une image dans le canal 3 pour confirmer la présence de CMG, éclairant avec un laser de 561 nm à une puissance de 4 μW mesurée à l’objectif. Réglez les puissances du laser d’imagerie dans le panneau Lasers d’excitation. S’il est présent, CMG apparaîtra sous forme de taches bidimensionnelles limitées par la diffraction, comme le montrent la figure 1G et la figure 2A.
      1. Si aucun ADN ne peut être attrapé, vérifiez que le canal 2 ne contient pas de bulles, ce qui peut ralentir l’écoulement dans le canal 2 (par rapport aux canaux 1 et 3). S’il y a des bulles, augmentez la pression dans le canal 2 à 1 bar pour essayer de rincer les bulles.
   6. Si CMG est présent, déplacez le câble d’ADN sur le canal 4 ou 5 pour l’imagerie ; Sinon, réactivez le flux, jetez les perles et revenez à l’étape 2.2.4.
   7. Dans les canaux 4 ou 5, ajustez la distance entre les billes pour obtenir une tension initiale de 2 pN dans la longe d’ADN. Pour cela, entrez 2 pN dans le panneau Spectroscopie de force et cliquez sur le bouton Activer pour démarrer une pince de force. Une fois que la tension initiale atteint 2 pN, désactivez la pince de force avant l’imagerie en cliquant sur le bouton Activer dans le panneau Spectroscopie de force.
   8. Image CMG^Cdc45-LD555 toutes les 5 s avec un laser de 561 nm à une puissance de 4 μW mesurée à l’objectif (Figure 1F). Pour cela, cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse dans le panneau de numérisation d’image. Dans de tels balayages, CMG montrera des points bidimensionnels limités par la diffraction, comme dans l’exemple de la figure 1G.
      1. Si la CMG est observée mais qu’elle ne semble pas bouger avant le blanchiment, testez toutes les protéines utilisées pour l’activité des nucléases, car les entailles sur l’ADN provoqueront la dissociation de la CMG de l’ADN⁴¹, réduisant considérablement sa processivité apparente.
         REMARQUE : Une puissance laser de 4 μW devrait donner des résultats cohérents si vous utilisez le microscope commercial utilisé ici. Si vous utilisez une configuration de construction domestique, nous vous recommandons d’estimer la puissance laser optimale de manière empirique. Une puissance laser optimale doit fournir suffisamment de signal du fluorophore pour le localiser avec la précision souhaitée, et une durée de vie du fluorophore proche de la plage de temps souhaitée de l’expérience.
         REMARQUE : Bien que cette publication se concentre sur l’ensemble hybride et le test à molécule unique, nous avons déjà publié une description complète de l’analyse des données générées avec ce test⁴⁸.

Résultats

Lorsqu’il est exécuté correctement, le protocole décrit ici devrait produire des complexes DNA :CMG pratiquement sans agrégats. Une réaction sans agrégation ne doit obstruer aucun des canaux de la cellule d’écoulement microfluidique, et il doit être possible d’étirer les molécules d’ADN piégées jusqu’à une extension de bout en bout dans un rayon de 10 % de sa longueur de contour sans casser l’ADN. À l’inverse, s’il y a agrégation dans la réaction, les molécules d’ADN peuvent parfois être compactées par les agrégats, provoquant souvent une rupture de l’ADN si elles sont étirées. Une bonne façon de reconnaître les agrégats de protéines est de regarder les scans 2D de l’ADN. Dans une réaction sans agrégation, la CMG se présente sous la forme de taches discrètes, symétriques limitées par la diffraction qui encombrent peu l’ADN, comme celles des balayages illustrés à la figure 2A. Au contraire, les agrégats sont moins discrets, parfois des taches asymétriques entassant une plus grande longueur d’ADN, comme celles des balayages montrés sur la figure 2B. De plus, si le test est exécuté avec succès et que la haute pureté des protéines purifiées est atteinte, un mouvement à longue portée de la CMG en présence d’ATP sera observé, comme observé dans le kymographe illustré à la figure 2C.

Figure 1 : Description illustrée d’un ensemble hybride et d’un test à molécule unique pour imager et quantifier le mouvement de CMG entièrement reconstitués. (A) Un ADN linéaire de 23,6 kb contenant une origine ARS1 naturelle de réplication est doublement fonctionnalisé aux deux extrémités avec les fractions desthiobiotine et digoxigénine. (B) L’ADN doublement fonctionnalisé est lié à des billes magnétiques enrobées de streptavidine par ses fractions desthiobiotine. (C) CMG est assemblé par étapes et activé sur l’ADN lié aux billes magnétiques avec différentes étapes de lavage incluses pour éliminer l’excès de protéines non liées et d’agrégats de protéines. (D) Des complexes ADN intacts :CMG sont ensuite élués des billes magnétiques par l’ajout d’un excès de biotine libre, qui surpasse l’interaction desthiobiotine-streptavidine. (E) Des complexes individuels d’ADN :CMG sont liés entre deux billes de polystyrène recouvertes d’anti-digoxigénine et piégées optiquement à l’aide d’une cellule d’écoulement microfluidique. Notez que l’interaction Dig-anti-Dig est orthogonale aux interactions biotine-avidine, elle n’est donc pas affectée par la présence de biotine libre. (F) Une fois maintenus en place par la pince optique, les complexes ADN :CMG sont transférés dans différentes conditions tampons, où le plan de l’ADN est ensuite balayé avec un laser à balayage confocal pour imager le mouvement de la CMG le long de l’ADN au fil du temps. (G) Le panneau supérieur montre un schéma d’un complexe ADN :CMG maintenu en place entre deux billes de polystyrène anti-Dig piégées optiquement et balayées par un laser à balayage confocal. Le panneau inférieur montre un exemple de balayage 2D d’une passerelle CMG liée à un ADN maintenu en place par un piège optique. L’ADN n’est pas étiqueté dans ces expériences, mais il peut être considéré comme une ligne horizontale passant par le milieu de l’image. Ce chiffre a été modifié au lieu de²⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemples de données d’une expérience réussie et d’une expérience infructueuse. (A) Exemple de scans 2D d’un ADN contenant une CMG dans un échantillon sans agrégation. Dans les deux balayages, CMG montre des taches symétriques et discrètes limitées par la diffraction, dispersées le long de l’ADN. (B) Exemple de balayage 2D d’un ADN contenant une CMG dans un échantillon contenant des agrégats. Dans les deux scans, CMG forme des taches moins symétriques qui encombrent l’ADN. (C) Kymographe montrant la position sur l’ADN des taches limitées par la diffraction de CMG au fil du temps en présence d’ATP, montrant le mouvement à longue portée des complexes de CMG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Étapes critiques et contrôles importants de la qualité des réactifs
Les étapes critiques et les contrôles de qualité des réactifs biologiques dans le test sont mis en évidence ici. Tout d’abord, la pureté des protéines utilisées est importante, car la dégradation de l’ADN causée par des contaminants nucléases, même de petite taille, dans les échantillons de protéines affectera négativement les données. En effet, seules les molécules d’ADN intactes (ou partiellement entaillées) peuvent être piégées dans la pince optique à double faisceau. Plus important encore, des entailles sur l’ADN amèneront CMG à dissocier⁴¹, ce qui compliquera l’observation du mouvement à longue portée de CMG. Nous recommandons fortement de tester l’activité des nucléases de chaque protéine purifiée, ainsi que de surveiller constamment l’intégrité du substrat plasmidique de départ pour s’assurer que l’entaille est réduite au minimum. La deuxième étape importante est l’élimination soigneuse des billes magnétiques suite à l’élution des complexes ADN :CMG. L’élimination des surnageants dans cette étape doit être effectuée lentement afin de ne pas perturber les billes collectées. Si des billes magnétiques sont laissées dans l’échantillon envoyé dans la pince optique, elles heurtent souvent les billes de polystyrène piégées optiquement, ce qui les empêche d’échapper au piège optique et complique l’acquisition de données. Enfin, les complexes ADN :CMG doivent être manipulés avec précaution dans la pince optique. À cette fin, nous recommandons de ne pas augmenter la tension de l’ADN au-dessus de 10 pN, car l’application d’une force peut dissocier la CMG de l’ADN. De plus, le déplacement entre les canaux de la cellule d’écoulement microfluidique doit se faire aussi lentement que possible (~ 0,2 mm/s) pour éviter que les forces de traînée résultantes ne dissocient la CMG de l’ADN.

Modifications de la méthode
Il y a plusieurs étapes du test qui pourraient être modifiées. Par exemple, nous avons montré que le temps d’élution peut être réduit de 60 min à 30 min sans affecter de manière significative le rendement d’élution. De plus, nous recommandons de compléter le tampon d’élution avec une faible concentration (inférieure à 1 mM) d’ATP ou d’ATPγS pour empêcher la CMG de se diffuser hors des extrémités de l’ADN ainsi que pour stabiliser généralement la CMG²⁸. De plus, bien que les compositions tampons et les concentrations en protéines que nous rapportons ici soient basées sur celles employées dans des travaux biochimiques d’ensemble et des travaux sur les molécules uniques^11,18, le test que nous décrivons est entièrement compatible avec d’autres protocoles d’assemblage de CMG^26,27. Par conséquent, toute avancée biochimique signalée pour augmenter l’efficacité de l’assemblage ou de l’activation de la CMG pourrait et devrait être mise en œuvre dans la partie en vrac de l’essai pour augmenter le rendement. Enfin, l’augmentation du temps entre les images augmente le temps total pendant lequel la CMG peut être imagée, facilitant ainsi l’observation du mouvement à longue portée de la CMG avant le blanchiment au fluorophore.

Limites de la méthode
La méthode hybride que nous décrivons est limitée dans la mesure où l’on ne peut imager CMG qu’après son activation en masse. D’autres travaux seront nécessaires pour observer l’activation de CMG en temps réel. Une autre limitation importante est que, alors que nous nous attendons à ce que CMG soit assemblé par paires^{17, 26, 27}, le nombre total de complexes CMG par ADN que nous observons est principalement un²⁸, ce qui suggère que CMG, ou au moins Cdc45, se dissocie de l’ADN lors de la manipulation des complexes sensibles ADN :CMG. La réduction du nombre d’étapes de manipulation avant l’imagerie de la molécule unique, ainsi que le développement de meilleures stratégies de passivation pour le tube en plastique et le verre de la cellule d’écoulement microfluidique sont sur le point d’augmenter ce rendement.

Importance de la méthode
Jusqu’à présent, les études de mouvement de CMG sur une seule molécule ont utilisé des CMG pré-activés purifiés sous forme de complexe à partir de cellules. Bien que relativement plus simple, cette approche CMG pré-activée est limitée dans la mesure où elle manque toutes les étapes menant à l’activation de CMG, ainsi que la nature bidirectionnelle de la CMG et du mouvement de réplisome. D’autre part, la reconstitution complète de l’assemblage et de l’activation de la CMG a le potentiel d’étudier toutes les étapes de pré-activation, ainsi que d’étudier le mouvement de la CMG de manière bidirectionnelle. Néanmoins, cette approche est plus difficile à transposer du niveau biochimique en vrac au niveau de la molécule unique, car elle implique beaucoup plus de facteurs et d’étapes protéiques purifiés. Le test que nous décrivons ici a aidé à surmonter ces défis en nous permettant d’imager le mouvement d’une CMG entièrement reconstituée au niveau de la molécule unique, ce qui nous a permis d’accéder à certaines dynamiques de pré-activation²⁸ précédemment manquées. De plus, bien que nous voyions principalement une CMG par ADN, nous avons pu observer plusieurs instances de deux complexes de CMG se déplaçant dans des directions opposées, et nous avons même pu capturer la séparation initiale des CMG sœurs l’une de l’autre²⁸, fournissant ainsi quelques informations sur l’établissement de la réplication bidirectionnelle.

Un autre avantage de ce test par rapport au mouvement CMG précédent réside dans la nature entièrement double brin du substrat d’ADN que nous utilisons (Figure 1A). Dans les travaux précédents sur les CMG pré-activés, la manière la plus courante de lier la CMG au substrat d’ADN est par le biais d’un lambeau d’ADNsb 3'. Il en résulte une construction d’ADN qui ne peut pas être facilement contrainte en torsion et interdit donc l’étude du rôle du superenroulement dans la progression du réplisome. À l’inverse, la nouvelle approche que nous décrivons ici pourrait avoir le potentiel d’être adaptée pour étudier le rôle du couple dans ce processus, car le substrat d’ADN utilisé est entièrement double brin.

Applications plus larges de la méthode
Le test hybride décrit ouvrira la voie à la reconstitution complète d’un réplisome eucaryote complet, nous permettant, ainsi qu’à d’autres, d’observer et de quantifier la dynamique importante qui permet au réplisome de réussir dans toutes ses différentes tâches. Mis à part la réplication de l’ADN, le test que nous rapportons représente une avancée importante dans la traduction d’une réaction biochimique complexe du niveau biochimique en vrac au niveau de la molécule unique. Nous prévoyons que ce test pourra être facilement modifié pour étudier des interactions ADN/protéines tout aussi complexes impliquées dans différents mécanismes de traitement de l’ADN.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AflII  ;	NEB	R0520L
Billes de polystyrène revêtues d’anti-digoxigénine  ;	Spheroteck	DIGP-20-2
ATP solution	Thermo Fisher	R0441
ATP&gamma ; S	Roche	11162306001
BSA	NEB	B9000S
C-Trap	Lumicks
CutSmart Buffer	NEB	B6004S	Fourni avec AflII
dCTP	Promega	U122B
D-Desthiobiotin-7-dATP	Jena Bioscience  ;	NU-835-Desthiobio
dGTP	Thermo Fisher	10218014
Digoxigénine-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Streptavidin perles magnétiques	Invitrogen	11205D
Klenow Fragment (3'&rarr ; 5' exo-)  ;	NEB	M0212L
Microspin S-400 HR Colonnes de centrifugation  ;	GE Healthcare	GE27-5140-01
NEBuffer2	NEB	B7002S	Fourni avec Klenow Fragment
Nonidet  ; P 40 Substitut	Sigma	74385
Pluronic F-127  ;	Sigma	P2443