Method Article

Isolement, caractérisation et analyse protéomique de vésicules extracellulaires dérivées du plasma pour la découverte de biomarqueurs cardiovasculaires

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit une méthodologie pour l’isolement, la caractérisation et la quantification des vésicules extracellulaires (VE) dérivées du plasma humain et présente un flux de travail pour l’analyse sans marquage du protéome EV à l’aide de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules non reproductibles dérivées de cellules, enfermées dans des bicouches lipidiques. Les VE attirent actuellement l’attention de la recherche cardiovasculaire en raison de leur rôle dans la régulation de la communication intercellulaire, servant potentiellement de biomarqueurs précieux pour les maladies cardiovasculaires. Cependant, le protéome de l’EV et son potentiel en tant que biomarqueur dans le diagnostic cardiovasculaire restent mal compris. Ce protocole présente une méthode standardisée pour l’isolement et la quantification des VE dérivées du plasma et l’analyse de leur cargaison protéique à partir d’échantillons de plasma de patients se présentant au service de douleur thoracique d’un grand hôpital universitaire. Après une phlébotomie de routine, les EV sont isolées du plasma par ultracentrifugation différentielle. L’enrichissement de protéines marqueurs EV spécifiques dans les isolats de VE est visualisé par immunoblottage, et la distribution granulométrique moyenne et les concentrations plasmatiques de VE sont quantifiées par l’analyse de suivi des nanoparticules. Enfin, la chromatographie liquide ultra-performante couplée à la spectrométrie de masse en tandem est utilisée pour l’analyse sans marquage du protéome EV. Ce protocole fournit donc une approche complète pour étudier et utiliser les VE dérivées du plasma comme vecteurs potentiels d’informations biologiques critiques, ainsi que pour explorer leur potentiel en tant que nouveaux biomarqueurs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (VE), dont la nomenclature n’est pas uniformément définie, sont des nanoparticules entourées d’une bicouche lipidique et libérées par divers types de cellules, sans capacité de réplication1. Ce groupe diversifié comprend les exosomes, une sous-population d’EV d’origine endosomale, allant généralement d’environ 40 nm à 160 nm de diamètre2. Détectables dans de nombreux fluides corporels3, les VE facilitent la communication intercellulaire en transférant diverses biomolécules actives telles que des protéines, des ARNm, des microARN et des lipides. Ainsi, les EV fournissent des informations sur leur cellule d’origine par le biais de marqueurs de surface et de biomolécules spécifiques à la cellule, leurs propriétés étant fortement influencées par l’état de la cellule mère et son environnement4. Ces caractéristiques ont conduit à un intérêt croissant pour le rôle potentiel des VE en tant que biomarqueurs, en particulier dans le contexte des maladies cardiovasculaires.

De nombreuses études in vitro et in vivo ont démontré que le stress hypoxique myocardique entraîne une libération accrue de EV 5,6,7. La recherche contemporaine sur le fret des VE s’est largement concentrée sur les microARN liés aux VE, qui ont le potentiel de servir de biomarqueur dans le diagnostic de diverses maladies cardiovasculaires 8,9,10. En revanche, les preuves sur le protéome circulant des VE restent relativement rares, avec encore moins d’études portant sur les VE plasmatiques chez les patients cardiovasculaires. Dans deux études exhaustives sur les VE dérivées du plasma de patients souffrant d’infarctus du myocarde, les auteurs ont identifié un profil protéome spécifique des VE induit par l’ischémie avec une pertinence diagnostique potentielle 6,11.

Le traitement méthodologique des VE s’est historiquement avéré difficile, et à l’heure actuelle, il n’existe aucune recommandation définitive pour l’approche optimale de l’isolement, de la caractérisation et de la quantification des VE. Les méthodes couramment utilisées pour l’isolation des VE comprennent l’ultracentrifugation différentielle, la centrifugation à gradient de densité et les méthodes de filtration telles que la chromatographie d’exclusion stérique1. Selon les lignes directrices consensuelles actuelles, la caractérisation des isolats de VE doit inclure la mise en évidence d’au moins trois marqueurs protéiques de surface typiques de VE, tels que les tétraspanines ou les annexines, combinés à une modalité d’imagerie1. Pour examiner la cargaison de VE au niveau de la protéine, les méthodes à base d’anticorps telles que le Western blot ou l’ELISA sont les plus fréquemment utilisées.

Compte tenu des défis méthodologiques associés à l’isolement et au traitement des EV circulantes, ce protocole présente une voie complète depuis le recrutement des patients et la collecte d’échantillons jusqu’à l’isolement, la caractérisation et la quantification ultérieures des isolats plasmatiques de VE. De plus, cette étude met en évidence un flux de travail pour l’isolement immédiat des VE dérivées du plasma chez les patients se présentant au service des urgences (unité de douleur thoracique) d’un centre de soins tertiaires dans le sud-ouest de l’Allemagne, suivi de l’analyse sans marquage du protéome des VE plasmatiques spécifiques à la maladie à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). L’objectif est de faciliter une analyse à haut débit afin d’identifier des protéines liées à l’EV enrichies de manière différentielle dans une large cohorte de patients atteints de diverses maladies cardiovasculaires ischémiques, congénitales ou (auto-)immunes au moment du diagnostic initial et tout au long de la progression et/ou de la résolution de la maladie. Cette approche de criblage protéomique vise à identifier les modèles d’enrichissement en protéines spécifiques aux VE associés à des voies pathologiques distinctes, dans le but ultime de découvrir de nouveaux biomarqueurs protéiques liés aux VE afin d’améliorer les diagnostics actuels et le suivi thérapeutique des maladies cardiovasculaires.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour ce protocole, une cohorte de patients exemplaire a été recrutée, composée de trois patients témoins sains sans signes de maladie cardiovasculaire apparente ou sous-jacente et de deux patients atteints d’infarctus du myocarde non élevé du segment ST (NSTEMI). L’approbation préalable a été accordée par le comité d’examen institutionnel de la faculté de médecine de l’Université de Heidelberg (approbation de l’IRB #S-351/2015), et le consentement écrit a été obtenu de tous les patients avant le recrutement. Les patients ont été recrutés dans l’unité de douleur thoracique du département de cardiologie de l’hôpital universitaire de Heidelberg sur la base de la présentation clinique initiale, des antécédents médicaux et des résultats des tests de diagnostic.

Les critères d’inclusion pour les patients témoins sains comprenaient une présentation clinique atypique ou non spécifique, des taux de biomarqueurs cardiaques dans les limites normales, aucun antécédent de maladie cardiovasculaire et des résultats normaux lors de tout test diagnostique supplémentaire. Les critères d’exclusion comprenaient des antécédents de malignité ou de traitement cytostatique au cours des cinq dernières années, une hémodialyse, des syndromes d’hyperlipidémie familiale et des antécédents de maladie cardiovasculaire. NSTEMI a été diagnostiqué conformément aux directives actuelles12, avec une sténose coronaire hémodynamiquement pertinente confirmée par angiographie coronarienne. Pour chaque patient, jusqu’à 36 ml de sang ont été prélevés dans la veine antécubitale dans des tubes de prélèvement supplémentés en citrate par phlébotomie standard13, et les échantillons de sang ont été immédiatement transportés à 4 °C pour un traitement ultérieur. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Isolation des VE par centrifugation différentielle

REMARQUE : Un protocole de centrifugation différentielle a été utilisé pour isoler l’EV à partir d’échantillons de plasma humain. Deux cycles d’ultracentrifugation (UC) avec une force centrifuge croissante ont été effectués pour maximiser la pureté de la pastille EV résultante.

  1. Isolement plasmatique
    1. Commencer le traitement des échantillons de sang total, refroidis à 4 °C, dans les 120 minutes suivant le prélèvement afin d’assurer l’intégrité des VEr plasmatiques. Utilisez des tubes de prélèvement sanguin supplémentés en citrate (0,106 mol/L de citrate) pour prévenir la coagulation.
    2. Diluer 9 mL de sang total citraté 1:1 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée pour réduire la viscosité. Ajouter 5 mL de milieu à gradient de densité (1,077 g/mL) pour la séparation pendant la centrifugation.
    3. Centrifugeuse à 600 × g pendant 25-30 min à 4 °C. Pipetez soigneusement la fraction plasmatique du haut de chaque colonne dans des tubes de centrifugation spécialisés. Passez aux étapes suivantes ou congelez à -80 °C.
  2. Élimination des débris cellulaires et des corps apoptotiques
    1. Centrifuger le plasma à 20 000 × g pendant 15 min à 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse à rotor à angle fixe, sans freinage. Une pastille visible de débris cellulaires et de corps apoptotiques doit se former au fond du tube.
  3. Isolation des véhicules électriques
    1. Transférez le surnageant dans un nouveau tube. Ultracentrifugeuse à 100 000 × g pendant 2 h à 4 °C, sans freinage, pour isoler l’EV, qui formera une pastille visible sur la paroi du tube.
    2. Pipeter soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette électronique, en laissant environ 1 mL de plasma appauvri en VE. Passez à une pipette de 1000 μL pour le plasma restant, en pipetant lentement pour ne pas perturber la pastille EV. Inclinez progressivement le tube pendant le pipetage pour vous assurer qu’il ne reste pas de plasma dans le tube.
  4. Préparation à l’analyse en aval
    1. Remettre en suspension la pastille EV isolée selon les exigences d’analyse en aval : pour le suivi des nanoparticules, remettre en suspension la pastille EV de 9 mL de sang total dans 200 μL de PBS ; pour la LC-MS/MS, remettre en suspension l’EV isolée de 36 mL de sang total dans 50 μL de 1 tampon RIPA avec 1 % d’inhibiteur de protéase/phosphatase
    2. Transférez la pastille EV remise en suspension dans un tube de 1,5 à 2 ml. Conserver à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie ou procéder au besoin.

2. Analyse du suivi des nanoparticules

REMARQUE : La quantification de la distribution moyenne de la taille des VE dans les échantillons de plasma humain a été réalisée à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), une méthode de détection basée sur le laser qui analyse le mouvement brownien des nanoparticules.

  1. Dilutions de travail pour NTA
    1. Diluer la solution mère EV (pastille EV remise en suspension dans 200 μL de PBS) avec du PBS glacé dans des rapports de 1:10, 1:50, 1:100 et 1:200. Créez diverses dilutions de travail pour déterminer la dilution la plus appropriée pour obtenir un comptage final de 10 à 100 nanoparticules par image pendant le suivi des nanoparticules.
  2. Exécution de NTA
    1. Allumez l’instrument NTA et lancez le logiciel applicable sur l’ordinateur connecté. Placez la chambre à l’intérieur du cercueil laser et cliquez sur Démarrer la caméra pour l’activer.
    2. Prélever 1 mL de PBS dans une seringue. Branchez la seringue dans le tube avant et rincez soigneusement le système de tubulure, en vous assurant qu’il ne reste pas d’air dans la chambre. Surveillez la caméra pour détecter les bulles d’air ou les particules contaminantes.
    3. Prélevez la dilution de travail EV préparée dans une seringue de 1 mL et injectez-la dans la chambre.
    4. Ajustez le gain de l’écran pour qu’il corresponde à la luminosité du moniteur dans les onglets Capture et Traitement . Modifiez le niveau de la caméra pour différencier clairement les nanoparticules à l’écran.
    5. Définissez un seuil de détection approprié dans l’onglet Processus pour ajuster la sensibilité permettant de différencier les particules du bruit de fond. Maintenez cette valeur constante pour toutes les mesures au sein d’une même expérience.
    6. Faites la mise au point de la caméra à l’aide de la molette de chaque côté de l’instrument jusqu’à ce que les nanoparticules apparaissent nettes à l’écran.
    7. Réglez une température constante (idéalement 22 °C) pour toutes les mesures dans les paramètres matériels , car le mouvement brownien dépend de la température.
    8. Cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer la mesure. Entrez l’ID de l’échantillon et le solvant dans la fenêtre contextuelle.
    9. Enregistrez un minimum de trois vidéos de 30 s pour chaque échantillon. Faites avancer l’échantillon entre les mesures pour capturer un échantillon représentatif de la solution de nanoparticules. Si un pousse-seringue est disponible, réglez-le à une vitesse constante et enregistrez en continu.
    10. Après l’enregistrement, le logiciel calcule automatiquement la concentration et la distribution granulométrique des nanoparticules. Cliquez sur Modifier pour saisir le facteur de dilution utilisé pour l’échantillon, puis enregistrez les résultats en cliquant sur Exporter.
  3. Analyse des données
    1. Analysez les résultats à l’aide des fichiers de sortie d’un logiciel statistique.

Analyse sans marquage du protéome EV à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)

NOTE: L’analyse du protéome EV sans marquage a été réalisée à l’aide de la séparation initiale des protéines EV par électrophorèse sur gel après lyse membranaire. Après la digestion des protéines dans le gel avec de la trypsine, les peptides ont été analysés à l’aide de la LC-MS/MS, avec des spectres individuels appariés à une base de données de protéome humain. Notamment, si une analyse non ciblée des lysats EV est souhaitée, une protéomique à canon sans sélection préalable d’une plage de poids moléculaire spécifique est recommandée, ce qui rend les étapes 3.1.1 à 3.1.7 de ce protocole inutiles.

  1. Digestion de la trypsine dans le gel
    1. Préparez une solution d’EV remise en suspension dans 1x tampon RIPA en ajoutant le tampon de chargement Laemmli selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Faire bouillir les échantillons à 95 °C pendant 5 min.
    2. Chargez les échantillons EV, complétés par un tampon de chargement, ainsi qu’une échelle protéique sur des gels Bis-Tris à 4 % à 12 % pour l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE)14. Teignez le gel avec du Coomassie Blue pendant 1 à 4 h pour visualiser les bandes de protéines. Détachez le gel avec de l’eau en l’incubant pendant la nuit.
    3. Excise des bandes colorées à Coomassie dans des régions de gel contenant des protéines d’intérêt à l’aide d’une lame de scalpel.
    4. Lavez les morceaux de gel avec 60 μL de tampon de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB) et d’acétonitrile (ACN) 1:1 (v/v) 50 mM (pH 8,5) pendant 10 min. Rétrécir les morceaux de gel trois fois pendant 10 minutes chacun dans 60 μL d’ACN. Laver à nouveau avec 60 μL 50 mM TEAB, pH 8,5.
    5. Réduire les protéines avec 10 mM de dithiothréitol (DTT) dans 100 mM de TEAB à 57 °C pendant 30 min et déshydrater les morceaux de gel.
    6. Alkylat les protéines avec 10 mM d’iodoacétamide (IAA) dans 100 mM de TEAB à 25 °C pendant 20 min dans l’obscurité.
    7. Lavez les morceaux de gel avec 60 μL de 100 mM de TEAB et rétractez-les deux fois pendant 10 minutes chacun dans 60 μL d’ACN.
    8. Ajouter 50 mM de solution de trypsine TEAB, concentrée en conséquence, aux morceaux de gel secs. Incuber pendant 4 h à 37 °C. Éteignez la réaction en ajoutant 20 μL d’acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 %.
    9. Extraire les peptides obtenus en les incubant avec 30 μL de TFA et d’ACN 1:1 (v/v) 0,1 % pendant 30 min. Déshydratez les gels avec 20 μL d’ACN pendant 20 min, puis lavez-les à nouveau avec 30 μL de 100 mM de TEAB pendant 20 min.
    10. Rétrécir le gel deux fois avec 20 μL d’ACN pendant 20 min chacun.
    11. Concentrer le surnageant recueilli à chaque étape d’extraction dans une centrifugeuse à vide et dissoudre l’échantillon dans 15 μL d’AGT à 0,1 %.
  2. Analyse LC-MS/MS
    1. Effectuez des analyses LC-MS/MS en nanoflux à l’aide d’un spectromètre de masse par chromatographie liquide à haute résolution couplé à un analyseur à piège à ions électrostatiques.
    2. Utilisez 0,1 % d’acide formique (AF)/1 % d’ACN comme solvant A et 0,1 % d’AG/89,9 % d’ACN comme solvant B.
    3. Séparez les peptides selon un gradient linéaire de 25 min : commencez à partir de 3 % de solvant B, augmentez B à 23 % sur 21 min, puis à 38 % sur 4 min, et procédez à un lavage à 95 % B.
    4. Faites fonctionner le spectromètre de masse en mode d’acquisition dépendant des données, en alternant automatiquement entre MS et MS2. Acquérez des spectres MS (m/z 400-1600) avec une résolution de 60 000 à m/z 400, générant des spectres MS2 pour un maximum de 15 précurseurs en utilisant une énergie de collision normalisée de 27 et une largeur d’isolement de 1,4 m/z.
  3. Recherche dans la base de données sur les protéines
    1. Recherchez les spectres MS/MS dans la base de données de protéines Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, juin 2020) et une base de données de contaminants personnalisée (faisant partie de MaxQuant, MPI Martinsried15,16) à l’aide de Proteome Discoverer 2.5 avec Sequest HT.
    2. Configurez les paramètres du programme comme suit : réglez la tolérance de masse ionique du fragment sur 0,02 Da et la tolérance de masse ionique parent sur 5 ppm. Spécifier la trypsine comme enzyme utilisée pour la digestion, et définir le carbamidométhyle comme une modification fixe pour la cystéine, avec l’oxydation (méthionine) et la désamidation (asparagine, glutamine) comme modifications variables. Inclure l’acétylation, la perte de méthionine et leur combinaison en tant que modifications variables de l’extrémité protéique.
    3. Quantifier les peptides à l’aide du mode quantificateur d’ions précurseurs, en utilisant la méthode de la moyenne des n premiers (n = 3) pour le calcul de l’abondance des protéines17.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les VE ont été isolées à partir d’échantillons de plasma (n = 3) de patients sans maladie cardiovasculaire manifeste, ainsi que de patients atteints d’un infarctus du myocarde sans élévation du segment ST (NSTEMI ; n = 2), en utilisant le protocole d’ultracentrifugation différentielle établi. La séparation adéquate des EV plasmatiques a été confirmée par immunotransfert des protéines TSG-101, de l’annexine 5 (Anx5) et de CD9 enrichies en EV dans les isolats de VE par rapport au plasma appauvri en EV provenant des mêmes p...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole fournit une méthodologie réelle, étape par étape, prête à l’emploi pour la séparation et la caractérisation de l’EV plasmatique, ainsi qu’une introduction à une analyse protéomique non marquée adaptée à l’intégration dans la pratique clinique de routine. Une description détaillée et le strict respect d’une méthodologie unifiée pour l’isolement des VE à partir d’échantillons de plasma sont importants pour garantir la reproductibilité des résultats obtenus. La littérature actu...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG a reçu des honoraires pour des conférenciers de Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim ; il a reçu des subventions de recherche institutionnelles de Roche Diagnostics et Daiichi Sankyo, et est consultant pour Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis et Boehringer Ingelheim, en dehors des travaux soumis. JBK a reçu un financement lié au projet du Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK) et de Roche Diagnostics. Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts lié au travail soumis.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Heidi Deigentasch, Amelie Werner et Elisabeth Mertz pour leur soutien organisationnel pendant ce projet.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Polisseur d’échantillons LaemmliBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
Bouteille en polycarbonate de 26,3 ml avec bouchon pour ultracentrifugationBeckman Coulter355654
5810R Centrifugeuse de paillasseEppendorf5811000015
Acétonitrile (ACN)Biosolve0001204101BS
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537
Acide formique 99 % ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Iodoacétamide (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Spectromètre de masse Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS tampon de fonctionnementThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical  ;NS300
Nanosight NTA 3.2 LogicielMalvern Panalytical  ;
NuPAGE 4  ; bis 12  ;%, gels de protéines Bis-TrisInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 ultracentrifugeuse au solBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Échelle de protéines précoloréesThermo Fisher Scientific26619
Cocktail inhibiteur de protéase/phosphatase (100X)Technologie de signalisation cellulaire5872S
Marqueur protéiqueThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Spectromètre de masse hybride Quadrupole-OrbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Coloration rapide coomasssieServa35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 & micro ; m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE gel commercialThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  ; Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2 %Sarstedt02.1067.001
Concentrateur d’aspiration rapideSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, juin 2020) base de données de protéinesUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Tampon de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Acide trifluoroacétique (TFA) pour HPLC >99 %, 100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
Trypsine MS-GradeThermo Fisher90058
Type 50.2 Ti Rotor à angle fixeBeckman Coulter337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS

References

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