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Article de méthode

Détection de cassures d’ADN dans des cellules humaines en division par dosage de comète neutre

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DOI :

10.3791/67110

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23 août 2024

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of South Florida, Tampa

Dans cet article

Résumé

Ce protocole est conçu pour étudier l’étendue des dommages à l’ADN survenant lors de la réplication de l’ADN. Dans des conditions neutres, l’induction de cassures de l’ADN peut être facilement évaluée dans un court laps de temps. De plus, le protocole est adaptable à d’autres types de cellules et à divers réactifs de stress de réplication.

Résumé

La réplication de l’ADN est constamment mise à l’épreuve par une grande variété de facteurs de stress endogènes et exogènes qui peuvent endommager l’ADN. De telles lésions rencontrées lors de la duplication du génome peuvent bloquer les réplisomes et convertir les fourches de réplication en cassures double brin. Si elles ne sont pas réparées, ces cassures d’ADN toxiques peuvent déclencher des réarrangements chromosomiques, entraînant une instabilité accrue du génome et une probabilité accrue de transformation cellulaire. De plus, les cellules cancéreuses présentent un stress de réplication persistant, ce qui fait du ciblage des vulnérabilités de la fourche de réplication dans les cellules tumorales une stratégie attrayante pour la chimiothérapie. Le test des comètes est une technique très polyvalente et puissante pour étudier les cassures de l’ADN pendant la réplication. Cette technique d’électrophorèse sur gel détecte de manière fiable l’induction et la réparation des cassures de l’ADN au niveau de la cellule unique. Ici, un protocole est décrit qui permet aux chercheurs de mesurer l’étendue des dommages à l’ADN dans la division mitotique des cellules humaines à l’aide d’agents de blocage à la fourche sur plusieurs types de cellules. Le couplage avec le scoring automatisé des comètes facilite l’analyse rapide et améliore la fiabilité de l’étude de l’induction des cassures de l’ADN.

Introduction

Le test des comètes est une méthode d’électrophorèse sur gel utilisée pour détecter les cassures de l’ADN au niveau de la cellule unique. Il repose sur le principe que les cassures d’ADN ouvertes migrent dans des conditions électrophorétiques, tandis que l’ADN intact reste largement statique. L’ADN brisé migre parce que les cassures entraînent la relaxation de l’ADN surenroulé, provoquant sa relocalisation spatiale progressive vers l’anode dans la chambre électrophorétique, ce qui entraîne une apparence de comète observée par immunofluorescence 1,2. L’étendue des dommages à l’ADN est ensuite mesurée en quantifiant la quantité d’ADN brisé qui a migré par rapport à l’ADN compact.

Les deux méthodes de dosage des comètes les plus couramment utilisées sont le dosage des comètes alcalines (AC) et le dosage des comètes neutres (NC). Le dosage AC est effectué dans des conditions de dénaturation à l’aide d’une solution à pH alcalin élevé, tandis que le dosage NC est effectué dans une solution à pH neutre. Les tests NC et AC peuvent détecter de manière fiable les cassures d’ADN qui se produisent dans le noyau. Cependant, la version alcaline est également avantageuse pour la détection des sites alcalins-labiles3. Les deux formats de test nécessitent l’utilisation de conditions de lyse pour s’assurer que l’ADN est exempt de protéines avant l’électrophorèse.

Ce test est une méthode simple pour détecter les cassures de l’ADN et offre plusieurs avantages uniques pour déterminer les dommages à l’ADN cellulaire. La méthode est relativement facile à mettre en place et nécessite des réactifs qui peuvent être préparés en laboratoire ou achetés auprès de fournisseurs commerciaux. En tant que technique de résolution unicellulaire, le test nécessite très peu de matériel de départ. Notamment, le test NC peut mesurer les cassures avec une sensibilité élevée, détectant entre 50 et 10 000 cassures par cellule4. La polyvalence de cette technique est démontrée par son large éventail d’applications, notamment l’écotoxicologie5, la biosurveillance humaine6 et les études de génotoxicité7. Le test peut également être utilisé de manière fiable sur divers types de cellules et adapté aux tests à haut débit8 et à l’évaluation des cassures dans des régions génomiques spécifiques9. Ainsi, ce test constitue une technique rapide et fiable pour étudier la formation de cassures au niveau de la cellule unique.

Le processus de réplication de l’ADN est constamment mis à l’épreuve par plusieurs facteurs de stress endogènes et exogènes10,11. Le blocage des réplisomes dû à de telles lésions peut provoquer des cassures de l’ADN et entraîner une instabilité accrue du génome. Les cassures de l’ADN se produisent également souvent en tant qu’intermédiaires de réplication pour faciliter la réparation de l’ADN12. De plus, plusieurs agents chimiothérapeutiques induisent des cassures double brin (CDB) dépendantes de la réplication, telles que la camptothécine (CPT)13,14,15 et les inhibiteurs de PARP 16,17. Ainsi, ce test constitue une méthodologie puissante pour étudier la nature des lésions de l’ADN, évaluer le traitement des fourches de réplication et étudier le potentiel thérapeutique des agents endommageant l’ADN. Les adaptations du test qui impliquent le marquage de l’ADN nouvellement synthétisé avec BrdU ont été utiles pour étudier les phénotypes de stress associés à la réplication 18,19,20,21. Notamment, le test NC est une méthode fiable pour étudier l’induction des cassures de l’ADN dans le contexte de la réplication, comme le démontrent les études impliquant la caractérisation des protéines de fourche22,23, l’analyse des intermédiaires de réplication24,25 et l’étude des conflits de transcription-réplication dans la maintenance dugénome 26,27. Dans cet article, nous décrivons un protocole de test NC dans le but de quantifier les cassures de l’ADN lors de la réplication dans les cellules humaines. Ce protocole peut être facilement mis en œuvre par les chercheurs intéressés à évaluer les dommages associés au stress de réplication dans une grande variété de cellules humaines en division.

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Protocole

Ce protocole (Figure 1) utilise principalement des lignées cellulaires cancéreuses U2OS adhérentes, mais est adaptable à une grande variété de cellules adhérentes et en suspension cultivées en culture tissulaire. Les solutions et les tampons utilisés dans cette étude sont détaillés dans le tableau 1. Les réactifs et l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des matériaux

  1. Avant le jour de l’expérience, placez la bouteille fournie avec de l’agarose à bas point de fusion (1% d’agarose à bas point de fusion dans PBS) dans un bain d’eau chaude pendant 5 à 10 minutes pour vous assurer que l’agarose a complètement fondu.
    REMARQUE : Ne chauffez pas le biberon au micro-ondes.
  2. Une fois fondu, aliquote rapidement 100 μL de l’agarose dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL au besoin et stocker les tubes à 4 °C. L’agarose solidifiée peut être conservée à 4 °C jusqu’à 1 an.
  3. Le jour de l’expérience, retirer le nombre requis de tubes à centrifuger de la zone de stockage à 4 °C. Faites fondre l’agarose en plaçant les tubes dans un bloc de chaleur ou un bain-marie à 42 °C.
    REMARQUE : Placez les tubes à 42 °C avant de récolter les cellules pour vous assurer que l’agarose est complètement fondue pour la remise en suspension (étape 3.7).
  4. Préparez le tampon de lyse frais et le tampon TAE le jour de l’expérience et conservez-les à température ambiante et à 4 °C, respectivement, jusqu’au moment de l’utiliser. De plus, aliquote 1x PBS dans un tube conique de 15 mL et placez-le au réfrigérateur pour l’utiliser dans l’étape de remise en suspension (étape 3.5).
  5. Marquez les identifications d’échantillons sur l’extrémité givrée des lames de comète à 2 puits et conservez-les à température ambiante jusqu’au moment de les utiliser.

2. Préparation des échantillons

  1. Avant le jour de l’expérience, ensemencez les cellules dans une boîte à 6 puits et cultivez-les pendant une nuit à 37 °C avec 5 % de CO2. Pour les cellules U2OS, environ 2 à 3 x 105 cellules ont été ensemencées pour chaque échantillon.
    REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster les numéros de cellule en fonction du type de cellule utilisé pour les analyses.
  2. Le jour de l’expérience, traitez les cellules dans les conditions prévues par le plan expérimental. En tant que contrôle positif pour démontrer l’induction de cassures dépendante de la réplication, traitez les cellules avec 1 μM CPT pendant 1 h. CPT est un inhibiteur de la topoisomérase-1 qui induit des cassures double brin de manière dépendante de la réplication14.

3. Mise en suspension et lyse cellulaires

  1. Aspirez le milieu de culture cellulaire et rincez-le deux fois avec 1x PBS.
  2. Ajouter 300 μL de trypsine dans chaque puits. Incuber la boîte dans un incubateur de culture tissulaire pendant 2-3 min.
    REMARQUE : Une incubation prolongée dans la trypsine peut générer des résultats parasites lors des analyses de comètes.
  3. Ajouter 700 μL de milieu de culture cellulaire dans chaque puits. Remettre doucement les échantillons en suspension et transférer les échantillons dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL.
    REMARQUE : Il est recommandé de compter les cellules à cette étape pour obtenir la densité de cellules appropriée à l’étape 3.6 afin de réduire la fréquence des queues qui se chevauchent pendant l’analyse.
  4. Centrifuger la suspension cellulaire à 2400 x g pendant 5 min à température ambiante.
  5. Aspirez le milieu et mettez les cellules en suspension dans 1 mL de PBS froid.
  6. Répétez deux fois les étapes 3.4 et 3.5 et mettez les cellules en suspension dans du PBS froid 1x PBS à une densité cellulaire de 2 x 105 cellules par ml.
    REMARQUE : Il est recommandé d’évaluer la viabilité des cellules à cette étape pour s’assurer qu’un nombre adéquat de cellules viables sont présentes. Une viabilité d’au moins 90 % est recommandée.
  7. Remettre en suspension 10 μL de suspension cellulaire dans 100 μL d’aliquote d’agarose fondue et, à l’aide de la même pointe de pipette, mélanger doucement et étaler le mélange uniformément dans un puits de la lame. Répétez cette étape pour tous les échantillons si nécessaire.
    REMARQUE : Évitez de retirer toutes les aliquotes du bain-marie à 42 °C en une seule fois pour éviter que l’agarose ne se solidifie. Cette étape doit de préférence être effectuée au bain-marie, et chaque échantillon est remis en suspension et étalé de manière échelonnée. Évitez d’introduire des bulles lors de l’étalement de l’agarose sur la lame car les poches d’air affecteront la migration des queues de comète lors de l’électrophorèse (étape 4.5) et introduiront des fissures dans l’étape de séchage (étape 5.3)
  8. Conservez les lames à 4 °C dans l’obscurité pendant 15 à 20 minutes pour vous assurer que l’agarose s’est complètement solidifiée (figure 2A).
  9. Placez les lames dans des bocaux Coplin et plongez les lames dans un tampon de lyse pendant 1 h à température ambiante.
  10. Rincez une fois les lames avec un tampon TAE froid et plongez les lames dans un tampon TAE froid pendant 30 min à 4 °C.

4. Électrophorèse

  1. Installez la chambre électrophorétique sur une surface plane et nivelez le système à l’aide des quatre boutons de nivellement situés sur les bords de l’appareil. Insérez des compresses froides dans la chambre inférieure pour garder la solution froide pendant l’électrophorèse.
  2. Versez environ ~850 mL de tampon froid 1x TAE dans l’appareil.
  3. Retirez les lames à 4 °C et placez-les sur le plateau d’électrophorèse dans la bonne orientation pour permettre la migration de l’ADN cassé.
    REMARQUE : Le plateau contient dix lames à 2 puits. Placez les lames au centre du plateau si vous travaillez avec un nombre inférieur d’échantillons. Si vous travaillez avec un nombre impair de diapositives, incluez une diapositive vierge telle que chaque puits puisse accueillir 2 diapositives.
  4. Placez délicatement le revêtement du plateau de diapositives fourni sur le dessus du plateau pour couvrir les diapositives.
    REMARQUE : Pour le bon fonctionnement de l’appareil, le volume du tampon TAE ne doit pas être inférieur à la surface inférieure du revêtement et ne doit pas dépasser la surface supérieure du revêtement.
  5. Après avoir connecté les câbles, réglez l’alimentation à 21 V et effectuez une électrophorèse (1 V/cm) pendant 40 min.
    REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster le temps d’électrophorèse en fonction du type de cellule utilisé pour les analyses. De longues queues dans les échantillons non traités indiquent un temps d’exécution excessif. À l’inverse, des queues courtes dans les échantillons de contrôle positif peuvent refléter un temps d’exécution insuffisant.

5. Coloration

  1. Une fois l’électrophorèse terminée, retirez les lames de l’appareil et immergez-les dans une solution de précipitation d’ADN pendant 30 minutes à température ambiante.
  2. Jetez la solution de précipitation de l’ADN et plongez les lames dans une solution d’éthanol à 70 % pendant 30 minutes à température ambiante.
  3. Jetez la solution d’éthanol à 70 %. Retirer les lames et les faire sécher dans un four d’hybridation à 45 °C pendant 30 min dans l’obscurité (figure 2B).
    REMARQUE : Les lames peuvent être laissées dans un endroit sombre et sec pendant la nuit pour l’étape de séchage.
  4. Incuber les puits avec 100 μL de 1x SYBR Green solution pendant 30 min à température ambiante dans l’obscurité.
  5. Décantez la solution SYBR Green en inclinant les lames et en enlevant l’excédent en tamponnant doucement le bord du puits avec une lingette non pelucheuse.
  6. Placez les lames dans un tiroir et laissez sécher pendant 30 min.
  7. Procédez à l’imagerie des lames.

6. Imagerie et analyses

  1. Configurez le microscope à des fins d’imagerie.
    REMARQUE : Toutes les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à épifluorescence. Un grossissement de 10x avec une ouverture numérique de 0,45 a été utilisé avec un temps d’exposition de 1/40s et un gain de +6dB. Le mode de capture monochrome 8 bits a été utilisé avec le binning 2 x 2 et la correction de la balance des noirs.
  2. Placez les lames sur la platine du microscope et commencez l’imagerie à l’aide du filtre FITC.
    REMARQUE : Utilisez d’abord l’échantillon non traité pour tester le temps d’exposition. La plupart des cellules ne présentent pas de queues de comète car l’ADN est plus compact. Passez au puits avec des cellules traitées au CPT et imagez en utilisant le même temps d’exposition. Des queues de comète de plus grande longueur seront observées dans cet échantillon en raison de la migration des extrémités d’ADN brisées.
  3. Acquérez des images pour au moins 100 comètes par échantillon en utilisant le même temps d’exposition sur trois réplicats techniques.
    REMARQUE : Les queues de comète à l’extrémité des lamelles ont tendance à migrer de manière inégale et à agir comme des valeurs aberrantes dans la distribution de l’échantillon. La plupart des comètes capturées pour les analyses sont présentes près du centre de la lamelle (Figure 3).
  4. Exportez des images et notez les comètes soit manuellement (à l’aide de l’image J), soit à l’aide d’un logiciel de notation de comètes disponible gratuitement. Les comètes qui sont distinctes individuellement et entièrement contenues dans le champ de vision sont sélectionnées pour l’évaluation. Les comètes qui se chevauchent ou qui sont partiellement visibles ne sont pas prises en compte pour des analyses plus approfondies (Figure 4).
    REMARQUE : Les utilisateurs peuvent noter des comètes sur l’image J à l’aide du plugin suivant : https://cometbio.org/index.html. Les détails de l’évaluation des comètes à l’aide du logiciel CometScore sont inclus dans la figure 5.
  5. Tracez les moments de queue acquis à partir des analyses sous forme de diagrammes en boîte et à moustaches représentant des valeurs de 10 à 90 percentiles. Effectuer des tests de normalité pour déterminer si des tests paramétriques ou non paramétriques doivent être utilisés pour les analyses statistiques.
    REMARQUE : Dans la plupart des cas, les tests non paramétriques sont appliqués à l’aide du test de Mann-Whitney si l’on compare deux échantillons seulement ou du test de Kruskal-Wallis avec les comparaisons multiples de Dunn si l’on compare trois échantillons ou plus.

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Résultats

Analyse de l’induction de cassures par des réactifs de contrainte de réplication
Les cellules U2OS ont été traitées avec du DMSO, 4 de mM d’hydroxyurée (HU) ou 100 nM de CPT pendant 4 h et analysées pour l’accumulation de cassures par le test NC (Figure 6A). Alors que la CPT induit des cassures pendant la phase S en bloquant la topoisomérase-113, l’appauvrissement des pools de nucléotides induit par l’HU bloque les fourches de réplication qui sont ...

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Discussion

Ce protocole décrit un test NC pour évaluer les cassures de l’ADN dans les cellules humaines subissant une réplication active. Le protocole est relativement simple à mettre en œuvre, et les chercheurs peuvent facilement l’adapter à des conditions de pH élevé pour des analyses alcalines8. Il comprend deux étapes critiques, comme décrit aux étapes 3.7 et 4.5. À l’étape 3.7, il est essentiel de répartir uniformément l’agarose fondue avec des cellules dans le puits pour éviter que les comètes ne se ch...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Dungrawala pour leurs contributions et leurs commentaires. Ce travail a été financé par une subvention des NIH R35GM137800 à HD.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x DPBSGibco14190144
CamptothecinSelleckchemS1288
Comet LMAgarose (LMA)R& D systems4250-050-02
Système d’électrophorèse CometAssay IIR& D systems4250-050-ESComprend un réservoir d’électrophorèse, un couvercle de sécurité, des câbles, des plateaux de lames 2/20 puits et une superposition de plateaux de diapositives
Logiciel CometScoreTriTekopen source
CometSlideR& D systems4250-050-03
DMEM, haute teneur en glucoseGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO  ;FisherSciD128-4
Microscope à épifluorescenceKeyenceBZ-X810
Sérum de veau fœtal - PremiumBio-TechneS11150
Gibco Trypsin-EDTA (0.05 %), rouge de phénolGibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T cellulesATCCCRL-11268
Cellules hTERT-RPE-1ATCCCRL-4000
HydroxyureaMillipore SigmaH8627
Inhibiteur de PARP OlaparibSelleckchemS8096
PowerPac  ;FisherSciFB300Q
Plaque de culture de tissus stériles traitée en surfaceFisherSciFB012927
SYBR Green I Teinture gel d’acide nucléique (10 000x)FisherSciS7567
U2OS cellulesATCCHTB-96
UVP  ; HB-1000 Incubateur d’hybridationFisherSciUVP95003001

Références

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