Extraction de phéromones sexuelles volatiles et test de chimioattraction chez Caenorhabditis elegans

Résumé

Ce protocole établit des méthodes pour extraire et quantifier les réponses à la phéromone sexuelle volatile chez C. elegans, fournissant des outils pour étudier la communication chimique et la trajectoire de navigation.

Résumé

La communication chimique est vitale pour la santé de l’organisme, la reproduction et le bien-être général. La compréhension des voies moléculaires, des processus neuronaux et des calculs régissant ces signaux reste un domaine de recherche actif. Le nématode Caenorhabditis elegans fournit un modèle puissant pour étudier ces processus car il produit une phéromone sexuelle volatile. Cette phéromone est synthétisée par les femelles vierges ou les hermaphrodites appauvris en spermatozoïdes et sert d’attractif pour les mâles.

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour isoler la phéromone sexuelle volatile de plusieurs souches de C. elegans (souche WT N2, daf-22 et fog-2) et C. remanei. Nous fournissons également un protocole pour quantifier la réponse chimiotaxique masculine à la phéromone sexuelle volatile. Notre analyse utilise des mesures telles que l’indice de chimiotaxie (C.I.), le temps d’arrivée (A.T.) et un tracé de trajectoire pour comparer avec précision les réponses masculines dans diverses conditions. Cette méthode permet d’établir des comparaisons robustes entre des mâles de différents antécédents génétiques ou stades de développement. De plus, le dispositif expérimental décrit ici est adaptable à l’étude d’autres produits chimiques de chimioattraction.

Introduction

L’interaction entre la communication chimique et le succès de la reproduction est un principe fondamental dans le règne animal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Les phéromones sexuelles déclenchent un large éventail de comportements sexuellement dimorphes essentiels pour localiser les partenaires, coordonner les é....

Protocole

1. Extraction brute de phéromones sexuelles chez les femelles et les hermaphrodites

1. Protocole pour la synchronisation de C. elegans
   1. Préparation des femelles adultes ou hermaphrodites
      1. Surveiller quotidiennement les plaques de culture jusqu’à ce qu’il y ait une grande population de femelles adultes/hermaphrodites et que la source de nourriture OP50 s’épuise. À l’aide de femelles fog-2 C. elegans et WT C. remanei pour l’extraction brute des phéromones sexuelles, préparez des œufs synchronisés à partir des femelles accouplées.
         REMARQUE : Dans ce protocole, les animaux....

Résultats

Analyse de trajectoire de la perception des phéromones sexuelles volatiles : souche défectueuse dans le test de chimioattraction
Ce test de chimioattraction différencie de manière fiable les souches de type sauvage et mutantes de C. elegans dans leur réponse aux phéromones sexuelles volatiles. Les expériences réussies avec les mâles him-5 démontrent systématiquement une chimiotaxie robuste envers la source de phéromones. Cela se traduit par un indice.......

Discussion

Ce protocole fournit une méthodologie robuste pour l’extraction des phéromones sexuelles volatiles de C. elegans, ainsi que l’établissement d’un test de chimioattraction robuste pour mesurer les réponses de chimioattraction masculine. Des informations supplémentaires peuvent être trouvées dans le guide d’utilisation de WormLab (voir la table des matériaux) ; Pour un code de base permettant de visualiser la trajectoire du mouvement du ver, reportez-vous à la sect.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 cm Petri dishes	Falcon	25373-100	Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes	Falcon	25373-085	Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)	CGC
Centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418	Toute marque devrait fonctionner.
Chemoattraction assay plates	Homemade solution	N/A	1,5% d'agar, 25 mM NaCl, 1,5 mM de Tris-base et 3,5 mM de Tris-Cl
Cholesterol	Alfa Aesar	57-88-5
Dissecting Microscope	Leica	LeicaMZ75	Toute marque devrait fonctionner.
E. Coli OP50	CGC
Ethanol	Koptec	64-17-5
fog-2(q71) (JK574)	CGC
him-5(e1490)(CB4088)	CGC
Household bleach	Clorox Germicidal bleach concentrated		Javellisant
M9 buffer	Homemade solution	N/A	3 g de KH2PO4, 11,3 g de Na2HPO4.7H2O, 5 g de NaCl, H2O à 1 L. Stériliser par autoclavage. Ajouter 1 mL de MgSO4 1 M après refroidissement à la température ambiante.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder	Macron	M1063-500GM-EA
Microwave	TOSHIBA	N/A	Toute marque devrait fonctionner.
N2	CGC
NaOH	Sigma-aldrich	S318-3	1 M
NGM plates solution	Homemade solution	N/A	2,5 g de peptone, 18 g d'agar, 3 g de NaCl, H2O à 1 L. Stériliser par autoclavage. Une fois l'autoclave terminé (2 h), attendez que la température du milieu baisse à 65 °C. Mettez sur une plaque chauffante à 65 °C et remuez. Ajoutez ensuite les éléments suivants, en attendant 5 min entre chacun pour éviter la cristallisation : 1 mL de CaCl2 (1 M), 1 mL de MgSO4 (1 M), 25 mL de K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL de cholestérol ( 5 mg/mL dans l'éthanol).
Parafilm	Bemis	13-374-10	Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone	VWR	97063-324
Pipet- aid	Drummond Scientific	4-000-100	Toute marque devrait fonctionner.
Plastic paper	Octago	Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film	https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride	Sigma-aldrich	SLBP2366V
Potassium phosphate	Spectrum	7778-77-0
Pipette	Eppendorf	SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006	20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, toute marque devrait fonctionner.
Rotator	Labnet	SKU: LI-H5500	Labnet H5500 Mini LabRoller avec rotateur à double direction. Toute marque devrait fonctionner.
Sodium chloride	VWR	7647-14-5
sodium phosphate dibasic	Sigma-aldrich	SLCG3888
Tris-base	Sigma-aldrich	77-86-1
Tris-Cl	Roche	1185-53-1
Tryptone	VWR	97063-390
Vortex	Scientific industries	Vortex-Genie 2	Toute marque devrait fonctionner.
WormLab system	MBF Bioscience	N/A	https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker	Homemade	N/A	fait avec des pointes de pipette en platine et en verre