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Article de méthode

Dévoilement du transport et des effets des xénobiotiques dans les mitochondries isolées : résultats des essais respiratoires et enzymatiques

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DOI :

10.3791/67146

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7 mars 2025

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1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente une méthodologie pour étudier les effets xénobiotiques sur la fonction mitochondriale via des tests respiratoires et enzymatiques. Il examine la modulation de la chaîne de transport d’électrons chez diverses espèces, offrant des informations pour le développement de biopesticides ciblés contre les maladies à transmission vectorielle des insectes.

Résumé

Les mitochondries sont souvent appelées la centrale électrique de la cellule en raison de leur rôle crucial dans la production d’énergie par le biais de la chaîne de transport d’électrons (CTE). Cependant, leur importance s’étend bien au-delà de la production d’énergie. La dérégulation de la bioénergétique mitochondriale peut déclencher des cascades intracellulaires qui ont un impact sur la santé et la fonction cellulaire. Compte tenu de leur importance physiologique, il y a un intérêt croissant pour l’exploration du potentiel pharmacologique de la fonction mitochondriale pour le développement de nouvelles thérapies et de nouveaux bioproduits. La modulation de la bioénergétique mitochondriale pourrait fournir des approches innovantes pour relever des défis tels que les troubles neurodégénératifs, les maladies métaboliques et le cancer, ainsi que pour développer des bioproduits pour lutter contre les ravageurs et les maladies à transmission vectorielle.

Ce travail présente une méthode d’évaluation des effets des xénobiotiques sur la chaîne de transport d’électrons (CTE) à l’aide de divers substrats, dont le glutamate et le NADH pour le complexe I, le succinate pour le complexe II et le cytochrome c (à la fois oxydé et réduit) pour les complexes III et IV. Cette méthodologie permet d’évaluer l’activation ou l’inhibition du transport d’électrons à travers les complexes mitochondriaux à l’aide d’un respiromètre et d’un spectrophotomètre. Les mitochondries peuvent provenir de mitochondries isolées, de cellules fragmentées ou de tissus homogénéisés de diverses espèces.

En laboratoire, la fonction mitochondriale a été analysée chez les rats Aedes aegypti et Wistar, mais cette méthode est également applicable à d’autres espèces, telles que Rhipicephalus microplus et Rhodnius prolixus. Cette approche fournit la base de la théorie sur l’existence de protéines découplées et de préférences de substrat oxydable spécifiques à l’espèce influencées par leurs demandes énergétiques uniques. Des découvertes récentes offrent des informations précieuses sur des stratégies innovantes de conception de bioinsecticides qui ciblent la fonction mitochondriale, offrant un potentiel important pour lutter efficacement contre les maladies à transmission vectorielle et les infestations de ravageurs.

Introduction

Les mitochondries ont toujours été appelées la centrale électrique des cellules en raison de leur production d’énergie chimique pendant le processus de phosphorylation oxydative 1,2. Au-delà de leurs principales fonctions métaboliques de base, les mitochondries sont également impliquées dans de nombreux autres processus cellulaires, allant des niveaux de régulation intracellulaire Ca2+, des processus inflammatoires et de la production d’espèces réactives de l’oxygène aux processus d’induction de la mort cellulaire3. La bioénergétique mitochondriale et sa dérégulation ont été associées à des processus intracellulaires qui affectent la fonction cellulaire et la santé globale. Cela a suscité un intérêt croissant pour la recherche sur le potentiel pharmaceutique du ciblage de la fonction mitochondriale afin de développer des thérapies innovantes et des bioproduits sûrs 4,5,6. De plus, la compréhension de l’interaction complexe des processus mitochondriaux et de leur impact sur la fonction cellulaire est cruciale pour développer des thérapies ciblées et présenter des opportunités pour la conception de bioproduits visant à contrôler les maladies à transmission vectorielle et les infestations de ravageurs 7,8.

Le ciblage de composants spécifiques de la chaîne de transport d’électrons avec des xénobiotiques est apparu comme une stratégie pour moduler la fonction mitochondriale pour la génération de biopesticides. Il a été démontré que les composés naturels et synthétiques inclus dans les formulations de pesticides, tels que les pesticides ciblant les mitochondries à base de nanoparticules, affectent la fonction mitochondriale en diminuant le potentiel mitochondrial et la synthèse de l’ATP chez S. frugiperda9.

De plus, la plupart des produits à base de carbamates et de pyréthrinoïdes ont été signalés comme inhibiteurs du complexe I chez les moustiques ; cependant, leur exposition prolongée a créé des populations résistantes aux pyréthrinoïdes chez Anopheles gambiae, souvent associées à des niveaux élevés de P450 qui peuvent métaboliser ces substrats10,11. De même, les plantes et leurs huiles essentielles, extraits et métabolites secondaires ont été documentés comme des insecticides potentiels ayant un large éventail de mortalité à différents stades de l’insecte12,13. L’activité insecticide de ces composés naturels peut être liée à l’inhibition du transport d’électrons en un point spécifique de la chaîne respiratoire mitochondriale en modulant la production d’espèces réactives de l’oxygène, le potentiel mitochondrial ΔΨm et la synthèse d’ATP qui peuvent déclencher les processus de mort cellulaire 6,8.

Les composés naturels, en tant que sources de formulation de pesticides, et leurs effets sur les mitochondries jouent un rôle crucial dans la conception de nouveaux biopesticides sûrs. Dans ce contexte, ce manuscrit décrit une méthodologie permettant d’identifier la capacité des xénobiotiques à activer ou à inhiber le transport d’électrons à travers les complexes mitochondriaux. Cette approche complète permet de mesurer avec précision les effets des xénobiotiques sur la fonction mitochondriale à l’aide d’une variété de substrats, en utilisant à la fois des méthodes de respirométrie et de spectrophotométrie. Cette méthodologie a été appliquée pour analyser la fonction mitochondriale d’espèces vectrices clés, y compris Aedes aegypti, ce qui a conduit à théoriser la présence de protéines découplées et des préférences distinctes de substrat oxydable spécifiques à chaque espèce.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité d’éthique « Comité de ética en investigación científica CEINCI » : Comité d’éthique de la recherche scientifique de l’Université industrielle de Santander. De plus, ces tests étaient conformes aux directives d’Arrive et suivaient la loi colombienne 84 de 1989 (chapitre IV, art. 23-26) et la résolution 8430 (1993, titre IV, art. 83-93) qui réglemente la recherche animale en Colombie.

REMARQUE : Il est fortement recommandé de lire le chapitre sur la phosphorylation oxydative de tout livre de biochimie avant de commencer ce protocole.

1. Réactifs et solutions

  1. Pour isoler les mitochondries hépatiques de rat, préparer 250 mL de tampon d’isolement des mitochondries : 250 mM de D-mannitol, 10 mM de HEPES pH 7,2 et 1 mM d’EGTA. Retirez 50 ml de tampon d’isolement (on l’appellera tampon d’isolement sans BSA), puis ajoutez 0,2 g de BSA aux 200 ml restants (on parlera de tampon d’isolement avec BSA).
  2. Pour homogénéiser les larves d’Aedes aegypti , préparer 100 mL de tampon : 250 mM de saccharose, 10 mM d’HEPES, 1 mM d’EGTA pH 7,2.
  3. Préparer le tampon réactionnel : solution tampon de phosphate de sodium 80 mM, pH 7,4, 50 μM EDTA.
  4. Préparer un stock de réactifs utilisés pour les activités enzymatiques à un pH de 7,2 comme décrit ci-dessous : 25 mM de NADH (fraîchement préparé pour chaque essai), 2 mM de succinate de sodium, 4 mM de cytochrome c (fraîchement préparé pour chaque essai), 200 μM de roténone, 0,5 mM de KCN, 6 mM de 2,6-dichlorophénolindophénol (DCPIP), 100 mM de méthosulfate de phénazine (PMS) et 60 mM de ferricyanure de potassium.
    REMARQUE : De l’eau ultrapure d’une résistivité de 18,2 MΩ·cm à 25 °C a été utilisée pour toutes les expériences et la préparation des réactifs. Cette eau a été générée à l’aide d’un système de purification Milli-Q, assurant l’élimination des contaminants organiques, inorganiques et microbiens à des niveaux inférieurs aux limites détectables, ce qui la rend adaptée aux applications biochimiques et de biologie moléculaire à haute sensibilité.

2. Dissection hépatique, homogénéisation et isolement des mitochondries à partir du foie de rat

  1. Avant de commencer, placez tous les matériaux et tampons sur de la glace, en vous assurant que tous les matériaux sont glacés pendant toute la durée du test pour éviter les dommages mitochondriaux.
  2. Placez 10 ml de tampon d’isolement des mitochondries dans un tube conique glacé.
  3. Euthanasier le rat Wistar mâle par décapitation cervicale, en évitant l’utilisation de CO2 qui peut interférer avec les tests respiratoires. Pour cela, le Comité d’éthique de la recherche scientifique de l’Université industrielle de Santander (CEINCI) a approuvé les méthodes sur la résolution 13 de 2022.
    REMARQUE : Les rats ne doivent pas peser plus de 170 g ; La graisse peut également affecter les analyses de la respiration.
  4. Faites une incision (environ 4-5 cm) avec un scalpel stérile à travers la section abdominale du rat.
  5. Disséquez complètement le foie une fois que la région abdominale est visible. Le foie de rat est un organe multilobulé, rouge foncé d’environ 10 cm x 5 cm.
  6. Mettez soigneusement le foie dans le tampon d’isolement glacé et rincez deux fois avec ce milieu.
  7. Hacher finement le foie (taille inférieure à 1 cm) avec des ciseaux bien aiguisés dans une boîte de Pétri avec 10 ml de milieu d’isolement.
  8. Mettez la solution dans le tube d’homogénéisation de tissus Potter Elvehjem et homogénéisez soigneusement au moins dix fois, à faible vitesse (~390 tr/min).
  9. Transvaser la solution dans un tube conique et centrifuger à 600 x g pendant 10 min à 4 °C.
  10. Après la centrifugation, versez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube conique. Jetez la pastille avec une partie des tissus, du sang et des composants cellulaires intacts.
  11. Remplissez le tube avec plus de tampon d’isolement (~35 mL) et centrifugez à 6000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  12. Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre soigneusement en suspension la pastille (mitochondries) dans un nouveau tampon d’isolement sans BSA.
    REMARQUE : Pour la remise en suspension mitochondriale, il est recommandé d’utiliser une brosse douce.
  13. Ensuite, centrifuger à 7000 x g pendant 10 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre en suspension les mitochondries isolées dans 2 mL de tampon d’isolement sans BSA.
  14. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de la méthode de Bradford ou d’une méthode similaire14.

3. Homogénéisation de la colonie et des larves d’Aedes aegypti .

REMARQUE : Pour cette procédure, la colonie d’Ae. aegypti a été maintenue à l’intérieur de cages de reproduction (40 cm × 40 cm × 40 cm) dans des conditions insectifiques telles que l’humidité (70 % ± 5 %), la photopériode (12:12) et la température (27 ± 5 °C). Les œufs ont été collectés sur du papier filtre.

  1. Assurez-vous que les œufs sont éclos dans des plateaux avec de l’eau filtrée et déchlorée une semaine avant l’expérience. Identifiez le stade par le processus de mue dans le cycle larvaire. Observez chaque processus de mue pour vérifier son état L1, L2 et L3. Lorsque la larve entre en L3, attendre au maximum 12 h pour recueillir le matériel.
  2. Prélever au moins 100 larves d’Ae. aegypti au stade L3-L4 dans de l’eau sans chlore (~30 mL d’eau). Prélever les larves à l’aide d’une pipette Pasteur.
  3. Filtrer les larves à l’aide de papier filtre, rincer les larves recueillies et les remettre en suspension dans le tampon d’homogénéisation d’Aedes aegypti (~2 mL).
  4. Transférez la solution avec les larves dans le tube d’homogénéisation de tissus Potter Elvehjem et homogénéisez soigneusement au moins dix fois à ~390 tr/min.
  5. Transférez le tissu homogénéisé et filtrez-le à travers une seringue en laine de verre pour éliminer les gros résidus d’exosquelette.
  6. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de la méthode de Bradford ou d’une méthode similaire15.
    REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’isoler les mitochondries des larves de moustiques ; Il est possible d’évaluer l’effet des xénobiotiques à l’aide de l’extrait protéique obtenu dans cette étape.

4. Détermination des effets des xénobiotiques sur la chaîne de transport d’électrons mitochondriales

REMARQUE : Ce protocole a été conçu pour évaluer l’effet des xénobiotiques sur la bioénergétique mitochondriale sur des mitochondries isolées à partir de tissus homogénéisés de foie de rat et d’insectes.

Les dosages sont divisés en deux : polarographique (NADH et succinate oxydase) et spectrophotométrique (NADH déshydrogénase - complexe I, succinate déshydrogénase - complexe II, cytochrome c réductase - complexe III et cytochrome c oxydase - complexe IV).

  1. Tests polarographiques : Pour cela, utilisez une respirométrie à haute résolution pour mesurer l’oxydation complète du NADH et du succinate par la consommation d’O2 , et rapportez les résultats en NADH et en succinate oxydase.
    1. Étalonnez l’instrument tous les jours avant de commencer les dosages. Cette étape peut varier en fonction de l’oxygraphe utilisé. Suivez les instructions du fabricant.
      1. Pour l’étalonnage Oroboros, ajoutez dans les chambres un excès d’au moins 0,2 mL au-dessus du volume de la chambre expérimentale (2 mL), pour remplir la chambre et injecter le capillaire avec du fluide.
    2. Allumez les touillettes après l’ajout de moyen.
    3. Attendez que le signal de concentration d’oxygène se stabilise et enregistrez-le.
    4. Pour un étalonnage sans oxygène, ajoutez des mitochondries, des suspensions cellulaires, de la levure de boulanger ou de la dithionite (la levure de boulanger est recommandée) qui permettent l’appauvrissement de l’oxygène, et enregistrez-le. Attendez que le signal atteigne les niveaux de fond (généralement ± 2 pmol/mL/s pour le système O2k).
    5. Effectuer des activités de NADH et de succinate oxydase en surveillant la consommation d’oxygène lors de l’ajout d’un tampon de réaction, de 0,1 mg de protéine (mitochondriale ou larves homogénéisées) et du substrat (0,17 mM de NADH ou 10 mM de succinate de sodium) dans la chambre.
    6. Utilisez des inhibiteurs de protéines de transport d’électrons pour confirmer que la consommation d’oxygène observée est due à la chaîne respiratoire mitochondriale. Les plus courants sont la roténone 1 μM et la KCN 1mM16. Dans la cellule oxygraphique, ajoutez les réactifs selon le tableau 1 (la séquence est importante).
  2. Dosages spectrophotométriques
    REMARQUE : Pour évaluer le transport d’électrons à travers les complexes mitochondriaux, des tests enzymatiques ont été effectués et mesurés à l’aide d’un spectrophotomètre et d’accepteurs d’électrons artificiels tels que le PMS, le DCPIP et le cytochrome c. Il est recommandé de mesurer une enzyme par jour. Préparez les tampons et les réactifs au moins un jour avant les dosages. Certains composés sont photosensibles ; voir Tableau 2 pour plus de recommandations.
    1. Pour l’activité de la NADH déshydrogénase, les systèmes réactionnels contiennent une solution tampon de phosphate de 50 mM pH 7,4, 2 mM d’EDTA, 0,1 mg/mL de protéine mitochondriale, 1 μM de roténone et 1 mM de KCN. Dans la cellule du spectrophotomètre, ajoutez les réactifs selon le tableau 2 (la séquence est importante)17. Les étapes recommandées sont les suivantes :
      1. Préparez 100 ml de phosphate tampon mélangé à l’EDTA et vérifiez que le pH ne change pas. Conservez le tampon au réfrigérateur, mais il est obligatoire de le conserver à température ambiante (RT ; environ 25 °C) pendant les dosages.
      2. Préparez des solutions mères fraîches de roténone, de KCN, de NADH et de ferricyanure de potassium (stables jusqu’à 4 h). Le volume suggéré est de 1 mL de solutions concentrées (voir la première colonne du tableau).
      3. Si le composé testé a une faible solubilité dans l’eau, inclure un contrôle supplémentaire de l’activité enzymatique dans le plan d’expérience en utilisant uniquement le solvant du composé.
      4. Tout d’abord, surveiller l’activité de la NADH déshydrogénase par la réduction du ferricyanure de potassium à 420 nm. Calculez sa concentration par son coefficient d’extinction molaire de 1,04 mM-1·cm-1. Le spectrophotomètre a la possibilité de calculer l’activité maximale d’une réaction ; Consultez le manuel d’utilisation. Par la suite, divisez l’activité rapportée par la concentration de protéine utilisée pour obtenir l’activité spécifique de l’enzyme.
    2. Évaluer l’activité de la succinate déshydrogénase en ajoutant 20 mM de succinate de sodium et 1 mM de méthosulfaté de phénazine (PMS) avec 60 μM de 2,6-dichlorophénolindophénol (DCPIP) comme accepteurs d’électrons artificiels. Dans la cellule du spectrophotomètre, ajoutez les réactifs selon le tableau 3 (la séquence est importante)17. Les recommandations sont les suivantes :
      1. Préparez le même tampon que celui utilisé pour la NADH déshydrogénase. Maintenez-le dans les mêmes conditions.
      2. Préparez des solutions mères fraîches de succinate, de PMS et de DCPIP. Le volume suggéré est de 1 mL de solutions concentrées. Préparer les solutions PMS et DCPIP le jour même du dosage.
      3. Si le composé testé a une faible solubilité dans l’eau, inclure un contrôle supplémentaire de l’activité enzymatique dans le plan d’expérience.
      4. Surveiller l’oxydation du succinate par la réduction du DCPIP à 600 nm. Calculez sa concentration par son coefficient d’extinction molaire de 21,0 mM−1·cm−1, en appliquant la loi de Beer. Par la suite, divisez l’activité rapportée par la concentration de protéine utilisée pour obtenir l’activité spécifique de l’enzyme.
    3. Mesurer l’activité de la cytochrome c réductase (complexe III) en utilisant du NADH ou du succinate comme substrats oxydables. Avec cette enzyme, le transport d’électrons du complexe I (à l’aide du NADH) ou du complexe II (à l’aide du succinate) passe à l’ubiquinone, puis au complexe III, qui transmet les électrons au cytochrome c. Cette réaction est suivie d’une réduction du cytochrome c. Préparez le système réactionnel contenant une solution tampon de phosphate de 50 mM pH 7,4, 2 mM d’EDTA, 0,1 mg de protéine mitochondriale, 50 μM de NADH et 0,1 mM de KCN. Dans la cellule du spectrophotomètre, ajoutez les réactifs selon le tableau 4 (la séquence est importante)18. Les recommandations sont les suivantes :
      1. Préparez le même tampon que celui utilisé pour la NADH déshydrogénase. Maintenez-le dans les mêmes conditions.
      2. Utilisez le même NADH et le même KCN que la NADH déshydrogénase.
      3. Si le composé testé a une faible solubilité dans l’eau, inclure un contrôle supplémentaire de l’activité enzymatique dans le plan d’expérience.
      4. Surveiller la réduction du cytochrome c à 550 nm et calculer sa concentration par son coefficient d’extinction molaire de 19,8 mM−1·cm−1, en appliquant la loi de Beer. Par la suite, divisez l’activité rapportée par la concentration de protéine utilisée pour obtenir l’activité spécifique de l’enzyme.
    4. Mesurer la cytochrome c oxydase (complexe IV) exprimée en activité de la cytochrome c oxydase. Pour cela, préparez une réaction systémique contenant une solution tampon de phosphate de 50 mM, un pH de 7,4, 2 mM d’EDTA et 0,1 mg de protéine mitochondriale (tableau 5). Pour ces tests enzymatiques, réduisez le cytochrome c en mélangeant des quantités équimolaires de cytochrome c et de dithionite sodique, assurant ainsi une réduction complète du cytochrome c.
    5. Ensuite, faites passer le mélange obtenu à travers une colonne de gel de dextran réticulé en utilisant la même solution tamponnée au phosphate que la phase mobile. Par la suite, quantifier les fractions collectées à l’aide d’un spectrophotomètre à 550 nm19. Les recommandations sont les suivantes :
      1. Utilisez le même tampon que celui utilisé pour la NADH déshydrogénase. Maintenez-le dans les mêmes conditions.
      2. Si le composé testé a une faible solubilité dans l’eau, un contrôle supplémentaire de l’activité enzymatique doit être inclus dans le plan d’expérience.
      3. Surveiller l’oxydation du cytochrome c à 550 nm et calculer sa concentration par son coefficient d’extinction molaire de 19,8 mM−1·cm−1, en appliquant la loi de Beer. Par la suite, divisez l’activité rapportée par la concentration de protéine utilisée pour obtenir l’activité spécifique de l’enzyme.
        REMARQUE : Un fichier tableur montrant le processus de calcul de l’activité spécifique des enzymes, mesurée par la consommation d’oxygène et la spectrophotométrie, est inclus dans le fichier supplémentaire 1.

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Résultats

Avant d’analyser les résultats obtenus avec ce protocole, il est essentiel de retenir un peu de la biochimie de la chaîne de transport d’électrons dans les mitochondries. Tout d’abord, le NADH fournit une paire d’électrons aux centres d’oxydoréduction situés dans le complexe I. Là, il commence le transport d’électrons qui passent du complexe I à l’ubiquinone, puis au complexe III, qui les donne au cytochrome c, et enfin au complexe IV, où l’oxygène est l’accepteur final d’électrons, le réduisant en eau. D’autre part, le ...

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Discussion

Une méthode spectrophotométrique et polarographique avec de l’O2 à haute résolution a été utilisée pour étudier les effets des xénobiotiques sur la fonction mitochondriale. L’étude a spécifiquement évalué l’impact de l’huile essentielle de Cymbopogon flexuosus et du carvacrol sur l’oxydation du NADH et du succinate, ainsi que sur le transport d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons mitochondriale, en utilisant deux modèles biologiques différents : des...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs remercient le « Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE » de l’Universidad Industrial de Santander pour le financement de la subvention numéro 3739 correspondant au projet « Formulation d’un ixodicide et d’un ixorépulsif conçu en laboratoire et validé sur le terrain pour prévenir l’infestation de tiques chez les bovins ».

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,6-dichlorophénolindophénolMerck119814Préparer le même jour d’utilisation.
Réactif BradfordMerckB6916
BSAMerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Cytochrome cMerckC2506Convertisseur photosensible couvrez-le d’une feuille d’aluminium. En solution, il doit être conservé au congélateur.
D-mannitolMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Éthylènediamineacide tétraacétique sel tétrasodique dihydratéMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178En solution fonctionne bien pendant 2 semaines.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC Photomètre sur microplaquesThermo Scientific  ;
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k  ;Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Méthosulfaté de phénazine  ;MerckP9625Préparez-vous le même jour d’utilisation.
Ferricyanure de potassiumMerck244023Prepare le jour même de l’utilisation.
Potter Elvehjem tube
de tissus Rotenone Merck557368soluble dans l’éthanol. Le conver photosensible le recouvre d’une feuille d’aluminium. En solution, il doit être conservé au congélateur.
Sodium succinateMerck S9637En solution, il doit être conservé au congélateur.
SaccharoseMerckS0389
&beta ;-Nicotinamide adénine dinucléotide, réduit Hydrate de sel disodiqueMerckN8129Photosensitive conver le couvrir d’une feuille d’aluminium. En solution, il doit être conservé au congélateur.
51119100d’homogénéisateur

Références

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