Isolement de chondrocytes et de chondroprogéniteurs à l’aide de l’adhésion de la fibronectine et du dosage migratoire

Résumé

Ce protocole détaille l’isolement des chondrocytes, des chondroprogéniteurs dérivés du test d’adhésion à la fibronectine (FAA-CP) et des chondroprogéniteurs migrateurs (MCP) du cartilage articulaire humain. Il couvre la digestion enzymatique, l’adhésion de la fibronectine et les tests basés sur la migration pour isoler et caractériser ces cellules.

Résumé

Les cellules chondroprogénitaires (CPC), récemment identifiées comme une sous-population distincte, sont prometteuses en raison de leurs propriétés mésenchymateuses, de leur chondrogenèse accrue et de leurs traits hypertrophiques limités. L’enrichissement des progéniteurs est obtenu grâce à des tests d’adhésion différentielle de la fibronectine et d’explants basés sur la migration, les chondroprogéniteurs dérivés du test d’adhésion de la fibronectine (FAA-CP) et les chondroprogéniteurs migrateurs (MCP) démontrant un potentiel supérieur par rapport aux chondrocytes. Cet article se penche sur les détails de l’isolement des cellules résidentes dérivées du cartilage, à savoir les chondrocytes et les chondroprogéniteurs. Bien que les précieuses informations de la recherche sur les chondrocytes contribuent à notre compréhension de la réparation du cartilage, les efforts continus sont dirigés vers l’utilisation des chondroprogéniteurs et l’exploration de leur potentiel en tant qu’approche thérapeutique alternative. De plus, cet article méthodologique fournit un protocole détaillé, étape par étape, pour isoler trois types de cellules spécifiques du cartilage : les chondrocytes, les FAA-CP et les MCP. En suivant des procédures standardisées, ce protocole facilite l’extraction réussie de ces sous-types cellulaires. Fondé sur des recherches approfondies, l’article se concentre sur les techniques complexes utilisées pour isoler les différents sous-ensembles et les conditions de culture optimisées nécessaires à l’expansion et au maintien de leurs cultures. La méthodologie comprend l’isolement enzymatique de chondrocytes dérivés du cartilage articulaire humain, l’adhésion différentielle de la fibronectine après une digestion enzymatique séquentielle et des tests d’explant basés sur la migration pour obtenir des cellules résidentes du cartilage.

Introduction

L’émergence de la thérapie régénérative cellulaire représente une approche importante pour traiter les affections liées au cartilage, telles que l’arthrose et^{les anomalies} chondrales1. Ces troubles, caractérisés par la dégradation ou la lésion du cartilage dans les articulations, présentent des défis importants pendant le traitement. L’auto-réparation du cartilage articulaire serait limitée en raison de son architecture anévale, de son avascularité et de sa faible activité mitotique².

Les cellules les plus utilisées pour la régénération du tissu cartilagineux sont les cellules souches mésenchymateuses (CSM) et les chondrocytes³. Cependant, plusieurs études ont rapporté des limites dans l’utilisation de ces cellules pour la régénération⁴. Ces limitations comprennent la différenciation terminale des chondrocytes lors d’une expansion in vitro prolongée pour atteindre le nombre de cellules requis et la tendance hypertrophique des CSM. Ces facteurs peuvent entraîner la formation d’un tissu de réparation avec une combinaison sous-optimale de fibrocartilage et de^hyaline 5,6,7,8.

La découverte des cellules chondrodrogènes (CPC) est née de la recherche de cellules alternatives dans le cartilage articulaire⁹. Ils ont suscité un immense intérêt en raison de leur ressemblance avec les CSM et de leur potentiel chondrogénique supérieur, tout en présentant une hypertrophie réduite - une combinaison indispensable recherchée^10,11. Contrairement aux chondrocytes, il a été rapporté que ces populations de progéniteurs présentent une activité réplicative et télomérase accrue, ainsi qu’une expression accrue de la protéine homologue du locus neurogène 1 (NOTCH-1) et du facteur de transcription SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. Il existe deux méthodes standard pour isoler les CPC signalées à la fois dans le cartilage et le ménisque, y compris l’une basée sur l’expression de leur récepteur de l’intégrine (CD49e/CD29), isolée par un test d’adhésion à la fibronectine - Fibronectin Adhesion Assay-derived Chondroprogenitors (FAA-CP), et l’autre basée sur leur potentiel migratoire accru à partir d’explants de cartilage - Chondroprogéniteurs migrateurs (MCP)11,13,16,17,^{18 et 19}. De nombreuses études in vitro démontrent la supériorité chondrogénique et la réduction de l’hypertrophie des CPC FAA et des MCP par rapport aux chondrocytes et aux CSM de moelle osseuse (BM) 20,21,22,23.

Des études in vitro récentes comparant les CPC-FAA aux MCP ont démontré l’amélioration de la capacité de régénération du cartilage de cette dernière population progénitrice dans des conditions normales d’oxygène²⁴. Ces résultats in vitro optimistes mettent en évidence une régénération de type hyalin, encourageant d’autres expériences in vivo. Néanmoins, il a été rapporté que les deux populations de CPC réparent et régénèrent efficacement le cartilage dans l’arthrose et d’autres troubles ostéochondrales dans des modèles animaux 25,26,27,28,29.

Notre laboratoire a activement contribué à la standardisation des techniques d’isolement des CPC et à la comparaison de leurs caractéristiques phénotypiques avec les chondrocytes et les CSM. Cet article fournit un protocole détaillé expliquant les étapes impliquées dans l’isolement et la culture des cellules résidentes du cartilage, à savoir les chondrocytes, les FAA-CPC et les MCP.

Protocole

Le protocole a été approuvé et est conforme aux réglementations et directives appropriées du comité d’examen institutionnel (comité de recherche et d’éthique). Après l’obtention d’un consentement éclairé écrit, des articulations tibio-fémorales humaines sont obtenues auprès de patients atteints d’arthrose (score radiologique de Kellgren-Lawrence 4)³⁰ qui nécessitent une arthroplastie totale du genou dans le cadre de leur traitement. Les articulations des patients présentant des signes de tumeurs, d’infections ou d’arthrite inflammatoire (comme la polyarthrite rhumatoïde ou la goutte) ont été exclues de l’étude. Il est garanti que toutes les procédures sont menées dans des conditions stériles, en respectant les protocoles de laboratoire standard tout au long du processus expérimental.

1. Obtention des articulations tibio-fémorales

1. Obtenir des articulations du genou (articulations tibio-fémorales) de donneurs humains nécessitant une amputation au-dessus du genou dans le cadre du traitement ou de personnes atteintes d’arthrose de grade IV³⁰ (preuves radiologiques montrant une réduction marquée de l’espace articulaire avec sclérose chondrale) subissant une arthroplastie totale du genou.
   REMARQUE : S’assurer que le consentement éclairé des patients est obtenu conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Veiller au respect des règles du Comité d’éthique et du Conseil d’examen institutionnel.
2. Excluez toutes les articulations présentant des symptômes d’infection ou d’inflammation.

2. Traitement des joints récoltés

1. Placez les articulations tibio-fémorales récoltées dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans des conditions stériles.
2. Préparez une zone stérile sous la capuche en plaçant un sous-matelas stérile. Transférez les articulations récoltées sur le sous-tapis.
3. Stabilisez les articulations tibio-fémorales sectionnées en tenant l’os sous-chondral avec le cartilage tourné vers le haut.
4. À l’aide d’une lame de scalpel (n° 22), prélevez des copeaux de cartilage de forme rectangulaire dans les zones non portantes pour les patients atteints d’arthrose dans les 1 à 2 heures suivant l’obtention de l’articulation.
5. Récoltez les sections de cartilage de 8 mm x 10 mm de la couche superficielle vers la couche plus profonde.
6. Lavez les tranches de cartilage avec 1 solution PBS et placez-les dans une boîte de Pétri contenant 1 à 2 ml de milieu DMEM nature.
7. Émincez joliment le cartilage à une taille inférieure à 1 mm x 1 mm x 1 mm avec une lame de scalpel (n° 22).
   REMARQUE : Assurez-vous que les tranches de cartilage ou le cartilage haché ne se dessèchent pas ; placez-les dans un milieu de culture ou PBS dépourvu de sérum.

3. Isolement des chondrocytes

1. Placez le cartilage haché dans une fiole verticale T-25 contenant 10 ml de Dulbecco’s Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) avec 0,15 % de collagénase de type II pour la digestion enzymatique. Laisser le ballon intact pendant 12 à 14 h dans un incubateur de_CO2 , en assurant des conditions de culture standard³¹.
   REMARQUE : Un milieu DMEM-F12 simple sans traces de sérum doit être utilisé, car le sérum inactive l’action enzymatique.
2. Après la digestion pendant la nuit, transférez le milieu contenant les cellules libérées dans un tube à centrifuger frais et stérile contenant un volume égal de DMEM-F12 + 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), en utilisant une passoire cellulaire pour séparer les cellules des débris. Les cellules libérées sont les « chondrocytes ».
3. Centrifuger les cellules filtrées à une vitesse de 1200 x g pendant 5 minutes à 37 °C.
4. Jetez le surnageant sans déranger la pastille. Reconstituer la pastille obtenue dans 1 mL de milieu et compter les cellules viables libérées à l’aide d’un test d’exclusion au bleu de trypan.
5. Chargez les chondrocytes dans une fiole T-25 à une concentration de 10 000 cellules/cm² et étendez-les jusqu’au nombre de passage requis à l’aide de DMEM-F12 contenant 10 % de FBS. Les autres composants du milieu comprennent l’acide ascorbique (62 μg/mL), la L-glutamine (2,5 mM/L), la pénicilline-streptomycine (100 UI/mL) et l’amphotéricine B (2 μg/mL).
6. Rafraîchissez le milieu tous les 3 jours et récoltez les cellules à la sous-confluence en utilisant 0,125 % de trypsine contenant de l’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA).

4. Isolement de chondroprogéniteurs dérivés d’un test d’adhésion à la fibronectine (FAA-CP)

1. 12 h avant la libération des chondrocytes, préparer 10 mL de 1x PBS contenant 1 mM de MgCl₂ (10 μL) et 1 mM de CaCl₂ (10 μL), et 100 μL de fibronectine (10 μL/mL)³².
2. Enduire le nombre requis de puits d’une plaque à 6 puits (1,5 ml/9,3 cm²) avec la solution préparée.
3. Fermez hermétiquement la plaque et réfrigérez toute la nuit à 4 °C.
4. De plus, obtenez des copeaux de cartilage d’une manière similaire à celle expliquée pour l’isolement des chondrocytes (étapes 2.1-2.5).
5. Soumettez les copeaux de cartilage à une digestion enzymatique séquentielle pendant la nuit (0,2 % de pronase pendant 3 h ; suivi de 0,04 % de collagénase de type II pendant 12 h) dans un bain d’eau agitée maintenu à 37 °C pour obtenir des chondrocytes individuels.
6. Le lendemain, retirez la plaque à 6 puits recouverte de fibronectine du réfrigérateur et retirez l’excès de fibronectine.
   REMARQUE : L’excès de fibronectine doit être éliminé lentement et doucement sans perturber le revêtement au fond du puits. La présence de MgCl₂ (10 μL) et de 1 mM de CaCl₂ est cruciale pour assurer la fixation des cellules.
7. Ajouter 2 à 3 ml de milieu DMEM-F12 ordinaire dans les puits enrobés.
8. Ensemencez les chondrocytes libérés dans les puits enrobés à une densité de charge de 4000 cellules/puits et laissez la plaque intacte pendant une période de 20 min.
9. Après l’incubation, retirez l’excès de milieu et les cellules non adhérentes. Ajouter 2 à 3 mL de milieu de croissance standard comme utilisé pour les chondrocytes (DMEM-F12 + 10 % FBS).
10. Maintenir les cellules adhérentes dans des conditions de culture standard pendant 10 à 12 jours pour obtenir des clones CPC (colonies de >32 cellules).
11. Isoler à l’aide de 0,125 % de trypsine-EDTA pendant 180 s, replaquer les clones à un rapport de 1 clone/5 cm² et étendre les CP polyclonaux enrichis jusqu’à la confluence requise. Ces cellules obtenues sont appelées « FAA-CPC ».
12. Cultivez ensuite les cellules dans un milieu DMEM-F12 + 10 % de FBS + facteur de croissance transformant bêta 2 (TGFβ2 : 1 ng/mL) + facteur de croissance des fibroblastes (FGF2 : 5 ng/mL).
    REMARQUE : L’incubation des cellules sur des plaques recouvertes de fibronectine ne doit pas dépasser 20 min, car les chondrocytes peuvent également commencer à adhérer. Pendant la période d’adhérence de 20 min, le milieu doit être dépourvu de sérum. Ensuite, les cellules qui adhèrent à former des clones doivent être cultivées dans un milieu contenant en plus du FBS. Les clones ne doivent être isolés qu’après s’être assuré que chaque clone comporte plus de 32 cellules ; Ceci afin d’éviter les amplificateurs de transit. L’expansion ultérieure des clones après la trypsinisation devrait inclure les facteurs de croissance supplémentaires mentionnés. Une densité de charge de 4000 chondrocytes/9,3^cm2 d’une plaque recouverte de fibronectine, après une incubation de 20 minutes suivie d’un lavage, entraîne l’adhésion de 80 à 100 cellules au total. Parmi ceux-ci, environ 20 clones progresseront pour grandir et atteindre un doublement de la population de 5 en 10 à 12 jours.

5. Isolement des chondroprogéniteurs migrateurs

1. Rasez les explants de cartilage (10 mm x 5 mm x 1 mm) de l’articulation articulaire récoltée et placez-les dans une plaque stérile à 6 puits contenant un milieu DMEM-F12 avec 10 % de FBS et 10 mM de Glutamax (2-3 explants/puits)³³.
2. Laissez la plaque avec les explants sans être dérangés pendant 48 h dans un incubateur de CO₂ maintenu à 37 °C.
3. Après 2 jours, transférez les explants dans un tube à centrifuger contenant 10 ml de solution de collagénase à 0,1 % pour la digestion enzymatique. Incuber le tube à 37 °C pendant 2 h.
   REMARQUE : Les explants doivent être rincés avec 1x PBS avant la digestion enzymatique, car des traces de sérum peuvent inactiver l’action enzymatique. Pour le lavage, trempez les explants dans une boîte de Pétri remplie de 2-3 mL de 1x PBS ; Il s’agit également d’assurer la non-contamination par les chondrocytes libérés. La manipulation des explants doit être réduite au minimum, et ce afin d’éviter de stresser les géniteurs qui ont commencé à migrer.
4. Après la digestion, rincez les explants avec 1x PBS et remettez-les dans les mêmes puits de la plaque contenant du milieu DMEM-F12 frais avec 10 % de FBS et 10 mM de milieu Glutamax.
5. Maintenir la plaque dans des conditions de culture standard dans l’incubateur. Observer la migration des chondroprogéniteurs dans les jours qui suivent.
6. Une fois la sous-confluence atteinte, récoltez les MCP en utilisant 0,125 % de trypsine contenant de l’EDTA.
7. Développez les MCP à l’aide du milieu d’expansion standard, qui comprend le DMEM-F12, qui contient 10 % de FBS et 10 mM de Glutamax.

6. Caractérisation phénotypique des chondrocytes, des FAA-CP et des MCP

1. Analyse par cytométrie en flux (FACS)
   REMARQUE : Les étapes suivantes sont suivies pour l’analyse FACS des groupes de cellules récoltés.
   1. Trypsiniser les cellules selon le protocole standard en utilisant 0,125 % de trypsine et centrifuger à 1200 x g, 5 min, température ambiante pour obtenir la pastille cellulaire.
   2. Jetez le surnageant, lavez et remettez en suspension la pastille avec 1x PBS.
   3. Transférez la suspension dans des tubes étiquetés pour FACS.
   4. Divisez la suspension à parts égales en deux tubes : un tube « non coloré » qui agit comme un contrôle (suspension cellulaire sans anticorps) et des tubes « colorés » qui agissent comme des tests (suspension cellulaire avec anticorps).
   5. Suivre la fiche technique des anticorps individuels/marqueurs de différenciation (CD) pour la coloration. Les anticorps à comparer comprennent CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (marqueurs d’expression positifs) ; CD34-PE, CD45-FITC et CD14-FITC (marqueurs d’expression négative)^34,35 ; CD166-BB515 et CD146-PE (marqueurs chondrogéniques potentiels)^36,37.
      REMARQUE : Les marqueurs CD sont sensibles à la lumière. Pour s’assurer que les étapes sont faites dans l’obscurité.
   6. Incuber la suspension cellulaire avec l’anticorps pendant 30 min dans l’obscurité.
   7. Après la coloration, ajouter 1 mL de 1x PBS dans les tubes et centrifuger à 1200 x g, 5 min, à température ambiante pour obtenir la pastille de cellule.
   8. Jetez les trois quarts du surnageant. Remettre la pastille en suspension dans le contenu surnageant restant par trituration douce.
   9. Passez à l’analyse FACS.

7. qRT-PCR

REMARQUE : L’analyse qRT-PCR de l’expression génique implique l’évaluation du collagène de type I (COL1A1), du collagène de type X (COL10A1) et du facteur de transcription lié à Runt (RUNX2) pour l’expression hypertrophique, et de SOX-9, Aggrecan (ACAN) et Collagène de type II (COL2A1) pour la chondrogenèse.

1. Extrayez l’ARN des groupes cellulaires à l’aide de kits disponibles dans le commerce selon les instructions du fabricant.
2. Après l’extraction, évaluez le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ et la concentration en ARN.
3. Utilisez 280 ng de l’ARN extrait pour construire de l’ADN complémentaire (ADNc).
4. Initier la qRT-PCR à l’aide de Sybr Green, chaque réaction contenant une concentration finale de 7 ng d’ADNc sur un thermocycleur.
5. Normaliser l’expression relative de l’ARNm de chaque gène par rapport au gène de référence GAPDH (ΔCt).
6. Calculez l’expression relative de chaque gène à l’aide de la technique ^2-ΔΔCt en comparant la valeur ΔCt de chaque gène individuel à celle des FAA-CP (ΔΔCt)³⁷.

8. Différenciation multilignée

REMARQUE : Les milieux différentiels disponibles dans le commerce induisent la différenciation des trilignées en lignées adipogènes, ostéogéniques et chondrogènes.

1. Pour la différenciation adipogénique, ensemencer des cellules à une densité de charge de 1000 cellules/cm² dans une plaque de culture cellulaire et cultiver en utilisant un milieu de différenciation adipogénique (changement de milieu - une fois tous les 3 jours) jusqu’à une sous-confluence de 80 % pendant 3 semaines.
2. Pour la différenciation ostéogénique et chondrogénique, suivre le système de culture de granulés de 28 jours³⁸.
3. Centrifuger 0,5 x 10⁶ cellules à 400 x g pendant 12 min à 37 °C pour former des granulés et initier la différenciation à l’aide d’un milieu de différenciation ostéogénique et chondrogénique.
4. Fixez, encastrez et sectionnez les granules pour une coloration de confirmation (étape 9).

9. Coloration de confirmation

1. Dans le cas des cellules de la lignée adipogénique, fixez les cellules avec du formol tamponné, lavez-les et colorez-les avec du Oil Red O (0,5 %). Colorez également les témoins (cultivés sur un milieu DMEM standard avec 10 % de FBS).
2. Observez au microscope et acquérez les images.
3. Pour les cellules de la lignée ostéogénique différenciée, colorer au rouge d’alizarine (2 %).
   REMARQUE : Plusieurs protocoles de coloration de confirmation sont applicables pour les cellules différenciées chondrogènes.
4. Coloration au bleu d’Alcian : Teindre les cellules fixées avec du bleu d’Alcian pendant 5 min et contre-colorer avec du Rouge Neutre.
5. Pour évaluer la teneur en glycosaminoglycanes (GAG), effectuez une coloration à la safranine O : Colorez les lames avec de l’hématoxyline de fer de Wiegert, puis incubez avec de l’alcool acide (1 %), une solution verte rapide (0,05 %), de l’acide acétique (1 %) et une solution de safranine O (1 %).
6. Coloration au bleu de toluidine : Teindre les lames avec du bleu de toluidine (0,1 %) pendant 5 min.
7. Coloration PicroSirius Red : Teindre les lames avec du Picrosirius Red (0,1 %) et contre-colorer avec un colorant à l’hématoxyline.
   REMARQUE : Après la coloration, déshydratez les lames à l’aide d’alcool gradué et éclaircissez-les à l’aide de xylène. Montez les lames à l’aide d’un enrobant de polystyrène xylène de dibutylphtalate, observez-les au microscope et acquérez des images.
8. Pour la coloration immunohistochimique (collagène de type II) de la pastille différenciée chondrogénique, soumettre les sections de la pastille à une récupération enzymatique de l’antigène à l’aide des enzymes pronase (1 mg/mL) et hyaluronidase (2,5 mg/mL).
9. Incuber les sections avec un anticorps monoclonal primaire anti-collagène de souris de type II, suivi d’un anticorps anti-souris secondaire de chèvre marqué HRP 1:250.
10. Teindre les lames avec le chromogène 3,3′-diaminobenzidine (DAB) et les contre-colorer à l’aide d’hématoxyline.
11. Observez au microscope et capturez des images.

10. Détermination de la teneur en GAG/ADN

1. Digérer les granulés différenciés chondrogéniques à l’aide d’une solution de papaïne-cystéine à 65 °C pendant 16 h.
2. Estimez la concentration d’ADN à l’aide du réactif Picrogreen³⁸ et acquérez l’intensité de fluorescence aux longueurs d’onde - excitation : 480 nm, émission : 520 nm à l’aide d’un lecteur de plaques ELISA.
3. Évaluer la teneur totale en GAG à l’aide de la méthode du colorant au bleu de diméthylméthylène³⁸.
4. Mesurez la densité optique à 525 nm à l’aide d’un lecteur de plaques ELISA.
5. Normalisez les valeurs GAG en fonction des valeurs d’ADN et calculez le rapport GAG/ADN total.

Résultats

À partir de 86,9 mg de coupes de cartilage, un rendement en cellules chondrocytaires de 1,72 x 10⁵ cellules a été noté. Lors de la charge, les chondrocytes adhèrent rapidement, présentant un aspect initial de galets arrondis et se transformant en un état fibroblastique lors d’une expansion ultérieure (Figure 1 A, B). L’ensemencement de ces chondrocytes sur des plaques de fibronectine entraîne généralement une adhésion de 2 %, chaque cellule subissant une croissance clonale (Figure 2 C, D), atteignant une population doublant de 5 jours 10 à 12 (32 cellules/clone). Les clones dans la zone de 10 cm² sont combinés et étendus jusqu’au passage nécessaire pour produire des FAA-CP. Les explants de cartilage, maintenus en culture après incubation de la collagénase, présentent un relâchement de la matrice extracellulaire, et la migration est généralement observée dès le 7^ème jour (Figure 2E). Les PC-FAA et les MCP présentent une structure en forme de fuseau, une caractéristique couramment associée aux BM-MSC, acquérant une structure en nid d’abeille avant la confluence (figures 1E, F).

Les trois types de cellules isolées, à savoir les chondrocytes, les FAA-CP et les MCP, sont étroitement surveillés à l’aide de l’imagerie à contraste de phase. Les PC-FAA ne sont transférés qu’après confirmation de cinq doublements de population.

La caractérisation phénotypique des cellules isolées et élargies comprend généralement l’analyse cytométrique en flux pour les marqueurs présumés de la chondrogenèse, à savoir CD146 et CD166, ainsi que l’analyse de l’expression génique pour les marqueurs de chondrogenèse (SOX-9, ACAN, COL2A1), le marqueur fibrocartilagineux COL1A1 et les marqueurs d’hypertrophie (RUNX2 et COL10A1). Les trois groupes de cellules présentent une expression élevée (>95 %) de CD105, CD73 et CD90 ; expression faible à négative de CD34 et CD45 ; et une expression élevée (>98 %) de CD166, avec une expression modérée et dépendante du donneur de CD146 (40 % à 75 %) (figure 2A).

Les résultats de la qRT-PCR montrent une expression comparable et élevée de SOX-9, d’ACAN et de COL1A1, un marqueur du fibrocartilage, car les cellules sont cultivées avant l’évaluation (Figure 2B). Pour confirmer la chondrogenèse, une absorption positive de complexes rouge-orangé dans les zones contenant du GAG après la safranine O, et de complexes bleuâtres à violacés après le bleu d’Alcian et le bleu de toluidine est observée dans tous les groupes de cellules, avec une proportion plus élevée dans les groupes FAA-CP et MCP. L’analyse immunohistochimique des granules différenciées chondrogéniques pour le collagène de type II montre une absorption fibrillaire brunâtre dans les trois groupes (Figure 3). De plus, l’analyse GAG/ADN a également montré la confirmation de la différenciation chondrogénique avec des groupes FAA-CP présentant une expression plus élevée (Figure 2C).

Figure 1 : Isolement et caractérisation des chondrocytes et des chondroprogéniteurs. L’algorithme d’étude décrit l’isolement de trois groupes de cellules et leurs caractéristiques morphologiques sous un microscope à contraste de phase immédiatement après l’isolement et après quelques jours d’expansion. (A) Des chondrocytes fraîchement isolés se fixent aux cultures adhérentes pendant les premiers jours de la culture, acquérant un aspect fibroblastique avec une expansion supplémentaire (B). (C) Les chondrocytes soumis à un test d’adhésion de la fibronectine présentent une croissance clonale, atteignant une population doublant de 5 au jour 10 (D). (E) Les chondroprogéniteurs migrent du bord de l’explant au 10e jour de la culture et présentent un schéma de croissance en forme de fuseau avec une expansion supplémentaire (F). Grossissement de l’image en contraste de phase : 10x ; Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Données de caractérisation moléculaire. (A) Analyse cytométrique en flux pour les marqueurs MSC positifs et négatifs et les marqueurs potentiels de chondrogenèse. (B) Données d’expression RT-PCR pour les trois groupes de cellules pour l’analyse de l’expression génique des marqueurs chondrogéniques et hypertrophiques. (C) Analyse GAG/ADN total des pastilles différenciées chondrogènes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Coloration de confirmation après différenciation chondrogénique. Safranine O et analyse immunohistochimique du collagène de type II entre les trois groupes cellulaires. Barres d’échelle : pour un grossissement de 10x, 50 μm ; Grossissement 40x, 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La régénération potentielle du cartilage articulaire, contenant du tissu hyalin, peut être obtenue grâce à l’optimisation de ses deux types de cellules natives : les chondrocytes et les chondroprogéniteurs. Alors que des recherches approfondies sur les chondrocytes ont fourni des informations précieuses sur leur rôle dans la réparation du cartilage, des questions sur la nature du tissu régénéré ont suscité des efforts pour améliorer leur phénotype et explorer des thérapies alternatives³. Les chondroprogéniteurs, identifiés comme une sous-population cellulaire relativement récente, sont prometteurs en raison de leurs propriétés mésenchymateuses inhérentes, de leur chondrogenèse accrue et de leurs traits hypertrophiques limités¹². Les deux principales techniques de récolte et d’amélioration des progéniteurs impliquent l’adhésion différentielle de la fibronectine et le test d’explant basé sur la migration^18,32. L’isolement des FAA-CP humaines a également été décrit à l’aide de tissu méniscal, faisant état d’un potentiel prolifératif et multipotent élevé^16,17. Des études de caractérisation in vitro comparant les PC-FAA et les MCP aux chondrocytes indiquent un potentiel supérieur pour les CP-FAA et les MCP à présenter des phénotypes chondrogéniques plus élevés et hypertrophiques inférieurs, reflétant un profil favorable avec une accumulation et une production accrues de GAG 15,24,31,39. Des études in vivo limitées suggèrent que les chondroprogéniteurs peuvent atténuer la progression de l’arthrose et démontrer des résultats bénéfiques dans la réparation des défauts ostéochondrales lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec des bioéchafaudages. Au cours des dernières années, d’importants efforts de recherche ont été déployés pour améliorer et découvrir le plein potentiel des chondroprogéniteurs.

Cet article fournit un protocole détaillé pour l’isolement des cellules résidentes du cartilage. Les cellules primaires et les plus courantes libérées du cartilage sont les chondrocytes. Cependant, le cartilage digéré par voie enzymatique est une population hétérogène de cellules qui contient non seulement des chondrocytes mais aussi des progéniteurs à une très faible concentration, ce qui nécessite un enrichissement dans des conditions in vitro .

Observant des preuves circonstancielles indiquant l’implication de ces cellules dans la croissance de l’apposition, Dowthwaite et al. ont entrepris l’isolement et la caractérisation des chondroprogéniteurs. Ces progéniteurs ont été dérivés de la couche superficielle du cartilage articulaire grâce à l’utilisation d’un test d’adhésion à la fibronectine¹⁰. Cette population distincte a été extraite de veaux fœtaux par un processus impliquant une adhésion sélective à la fibronectine. Il a été démontré qu’il possédait une flexibilité phénotypique et une grande capacité à former des colonies, ainsi que l’expression du gène du sélecteur de destin cellulaire Notch-1. Outre ces études initiales, la caractérisation des progéniteurs du cartilage articulaire humain a révélé des niveaux élevés d’expression de SOX9 et Notch1, une préférence pour CD49e/CD29 et une activité accrue de la télomérase par rapport aux chondrocytes matures^12,32. Ce protocole a également été établi dans le tissu cartilagineux humain arthrosique, avec des rapports montrant sa présence non seulement dans le cartilage superficiel mais aussi dans les couches plus profondes du cartilage, avec de nombreux groupes utilisant des cultures polyclonales pour des cultures monoclonales^11,12.

D’autre part, Koelling et al. ont étudié l’implication potentielle des chondroprogéniteurs dans le retour et la migration en réponse à une lésion du cartilage, contribuant ainsi à la réparation tissulaire¹⁸. De plus, Seol et al. ont démontré que, en réponse à une lésion du cartilage, les progéniteurs présentaient une migration accrue à travers la protéine HMGB1 (High Mobility Group Box 1) et la chimiotaxie¹⁹ médiée par RAGE. Elsaesser et al. ont également observé la capacité migratoire supérieure des chondroprogéniteurs nasaux par rapport aux chondrocytes et aux BM-MSCs²². Une étude menée par Joos et al. a révélé que la libération du facteur de croissance dérivé des plaquettes-BB (PDGF-BB) et du facteur de croissance analogue à l’insuline 1 (IGF-1) améliorait la migration des chondroprogéniteurs, tandis que l’interleukine 1 bêta (IL-1β) et le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNFα) inhibaient le mouvement des progéniteurs après une lésion⁴⁰. Un rapport récent comparant quatre méthodes différentes d’isolement des MCP en termes de méthodes d’isolement et de conditions de culture a été réalisé, et la méthode recommandée est expliquée dans cet article³³. L’approche consistant à isoler les progéniteurs en fonction de leurs capacités migratoires a abouti à des cellules qui présentaient non seulement un potentiel chondrogénique élevé, mais présentaient également des caractéristiques similaires aux cellules souches mésenchymateuses.

En laboratoire, en suivant des protocoles normalisés, l’isolement des trois sous-types a été réussi. De plus, des études comparatives pionnières ont démontré les attributs supérieurs des FAA-CP par rapport aux chondrocytes 12,15,41. Des comparaisons entre chondroprogéniteurs ont également été explorées, révélant que les MCP présentent un potentiel plus élevé²⁴. Il faut garder à l’esprit que, puisque les trois sous-types sont isolés à partir du même tissu et que le progéniteur dans sa forme native est très faible en sa présence lors de la libération initiale du cartilage articulaire - qui contient principalement des chondrocytes - il est nécessaire de les enrichir à l’aide de cultures in vitro.

Les méthodes d’évaluation complètes englobent le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-PCR), l’analyse au microscope électronique, les études de titrage des facteurs de croissance, les techniques de marquage cellulaire, l’immunoprofilage et l’évaluation de leur potentiel thérapeutique pour le traitement de l’arthrose et des anomalies chondrales à l’aide de modèles in vivo 12,24,42.

Les résultats actuels indiquent que l’isolement des trois sous-types est possible même à partir d’articulations arthrosiques, bien qu’il nécessite une durée d’expansion prolongée. Notamment, nous soulignons l’importance d’éviter l’ajout de facteurs de croissance pendant la croissance clonale, soulignant la nécessité cruciale d’introduire des facteurs supplémentaires lors de l’expansion de ces cellules. Des étapes cruciales, telles que le moment de l’incubation sur des plaques recouvertes de fibronectine, l’ajout de facteurs de croissance à différents moments et la manipulation minimale des explants, entre autres éléments essentiels mentionnés, jouent un rôle important dans la culture et l’expansion des cellules récoltées. Il est également essentiel de s’assurer que les cellules n’atteignent pas une confluence de plus de 75 % à 80 % à un moment donné.

Le potentiel des chondroprogéniteurs a suscité un intérêt considérable en raison de leur supériorité par rapport aux thérapies cellulaires couramment utilisées dans le domaine de la réparation du cartilage, à savoir les BM-MSC et les chondrocytes. Ces progéniteurs sont prometteurs, plusieurs expériences in vivo ayant démontré leur efficacité à remplacer la norme de soins actuelle. En tant que sous-ensemble récemment découvert, la caractérisation et les informations sur leur phénotype sont toujours en cours, le premier essai clinique utilisant des FAA-CP pour le traitement des anomalies chondrales devant commencer en 2024. Ainsi, l’isolement et l’expansion des cellules dérivées du cartilage, en particulier les chondroprogéniteurs, sont cruciales et prometteuses pour la réparation cellulaire dans le domaine de la régénération du cartilage.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
22-lame de scalpel  ;	FOURGON
VERRE plaque 6 puits  ;	CORNING	3516
Bleu Alcian	THERMO SCIENTIFIC	J6012
Rouge Alizarine  ;	SIGMA	130223
Amphotéricine-B (2 &mu ; g/mL).	GIBCO	15240062
Acide ascorbique (62 &mu ; g/mL)	SIGMA ALDRICH	A4544-25G
CytoFLEX LX cytomètre en flux  ;	BECKMAN COULTER	CYTExpert Software Version 2.5
CaCl2	SIGMA ALDRICH	; C34006
CD105-FITC	BD BIOSCIENCE
CD106-APC	BD BIOSCIENCE
CD14-FITC	BD BIOSCIENCE
CD29-APC	BD BIOSCIENCE
CD34-PE	BD BIOSCIENCE
CD45-FITC	BD BIOSCIENCE
CD49b-FITC	MILTENYL BIOTEC	· MACS 130/100337
CD49E-PE	BD BIOSCIENCE
CD73-PE	BD BIOSCIENCE
CD90-PE	BD BIOSCIENCE	561970
Compteur	de cellules DE NOVIX	Cell Drop BF
Filtre à cellules	HIMEDIA	TCP024
Centrifugeuse	BECKMAN COULTER	Allegra X-30R
Incubateur CO2	THERMO SCIENTIFIC	MODEL-371
Collagène de type X (COL10A1), facteur de transcription lié à l’arunage (RUNX2), facteur de transcription SRY-Box 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN) et collagène de type II (COL2A1)  ;	EUROGENTEC, BELGIQUE
Collagénase de type II	WORTHINGTON	LS004176
DMEM F-12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium F-12)	SIGMA ALDRICH	D8900-1L
Lecteur de plaques ELISA	MOLECULAR DEVICES	SpectraMax i3x Reader
Fast Green	FISHER SIENTIFIC	2353459
Sérum fœtal bovin	GIBCO	10270106
FGF2	CLOUD CLONE CORP	APA551Hu01
Fibronectine (10 µ ; L/mL)	SIGMA ALDRICH	F1141
Système de synthèse Premier brin	TAKARA BIO	6110A
Glutamax	GIBCO	35050061
Hématoxyline	QUALIGENS	Q39411
MgCl2  ;	SIGMA ALDRICH	M8787
Huile Rouge O	SIGMA	1320065
PBS (Phosphate Tamponné Saline)	GIBCO	10010023
Thermocycleur PCR  ;	APPLIED BIOSYSTEMS	Thermocycleur Quantstudio 12K Flex  ;
Pénicilline-streptomycine (100 UI/mL)	GIBCO	15240062
Picrosirius Red	ALFA AESAR	2610108
Anticorps primaire (souris Collagène de type II)	DSHB	DSHB II II6B3
Pronase	ROCHE	10165913103
Quant-iT Picogreen réactif dsDNA	THERMO SCIENTIFIC	P7589
Réfrigérateur	ELANPRO
RNeasy MiniKit	QIAGEN	74104
Safranin O	QUALIGENS	Q39962
Anticorps secondaire (Anticorps IgG anti-souris de chèvre, conjugué HRP)	THERMO SCIENTIFIC	31430
Bain d’eau agité  ;	Kits de différenciation REMI
StemPro  ;	GIBCO	1007201, A1007001 et A1007101
flacon T-25	CORNING	430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Bleu  ;	EUROGENTEC	UF-LSMT-B0701
TGF&beta ;	ABCAM	ab277760
Culture tissulaire Pétride	TARSONS	960010
Bleu de toluidine	QUALIGENS	2040
Bleu de tryphane  ;	GIBCO	15250061
Trypsine EDTA	GIBCO	25200072