Traitement efficace des cellules auxiliaires folliculaires T amygdaliennes et analyse fonctionnelle grâce à la cytométrie en flux de grande dimension

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour la collecte et le traitement d’échantillons d’amygdales, le phénotypage à l’aide de la cytométrie en flux spectral de haute dimension et la réalisation d’analyses non supervisées.

Abstract

Les lymphocytes T auxiliaires folliculaires (Tfh) sont un sous-ensemble de lymphocytes T auxiliaires CD4⁺ qui aident à la commutation des isotypes des lymphocytes B, à la formation du centre germinatif (GC), à l’hypermutation somatique et à la maturation de l’affinité, aidant ainsi à orchestrer les réponses immunitaires humorales adaptatives dans les tissus lymphoïdes secondaires pendant l’infection, l’auto-immunité et la vaccination. Comprendre le développement et la fonction des cellules Tfh est crucial pour concevoir des vaccins efficaces et développer des stratégies de traitement ciblées pour les maladies impliquant cette population. Les amygdales humaines sont des organes lymphoïdes muqueux accessibles. Ils offrent une occasion unique de profiler des populations immunitaires distinctes telles que les cellules Tfh et GC, d’interroger les interactions entre cellules, d’évaluer les fonctions cellulaires dynamiques et de découvrir leurs mécanismes de régulation au niveau des organes. De plus, les cultures in vitro de cellules amygdales sont simples à traiter et permettent d’évaluer la biologie des cellules Tfh dans diverses conditions. Ici, nous introduisons un protocole pour la collecte, l’isolement, la préservation et la culture de cellules amygdales humaines. Nous décrivons également deux panels de cytométrie en flux spectral optimisés conçus pour la caractérisation approfondie des cellules Tfh. Enfin, en utilisant l’exemple d’un traitement inhibiteur de la protéine phosphatase 2A (PP2A), nous démontrons l’efficacité et la puissance des analyses non supervisées de données de cytométrie en flux de grande dimension, révélant efficacement les différences induites par le traitement à une échelle de grande dimension.

Introduction

Les cellules T auxiliaires folliculaires (Tfh) sont un sous-ensemble distinct de cellules T auxiliaires CD4⁺ qui sont essentielles à la formation et à la fonction des centres germinaux (GC) et à la production d’anticorps contre les cellules B. Les cellules Tfh proviennent de lymphocytes T CD4⁺ naïfs par le biais d’interactions avec les cellules présentatrices d’antigènes et de l’intégration de facteurs intrinsèques et extrinsèques, y compris la signalisation des récepteurs des lymphocytes T, les interactions costimulatoires avec les lymphocytes B, les cytokines et les chimiokines¹. Les cellules Tfh expriment CXCR5 et-1, qui guident leur position à l’intérieur ou à proximité du GC. BCL-6 est le facteur de transcription maître essentiel au développement, à la maintenance et à la fonction ^1,2 de Tfh. Les cellules Tfh sont essentielles pour l’augmentation des réponses immunitaires humorales, en particulier dans les réponses vaccinales et dans la défense contre les agents pathogènes bactériens et viraux. Des réponses anormales des cellules Tfh sont impliquées dans divers troubles, notamment les maladies auto-immunes, l’immunodéficience et potentiellement certaines formes de cancer 3,4,5,6. Il est donc important de comprendre leur fonction et leur régulation pour développer des stratégies vaccinales et thérapeutiques efficaces⁷.

Contrairement à d’autres cellules T auxiliaires CD4⁺ comme Th1, Treg et Th17, pour lesquelles les systèmes de différenciation in vitro sont bien établis⁸, les cellules Tfh sont plus complexes à étudier car leur développement implique des interactions dynamiques de cellule à cellule et des structures anatomiques spécialisées⁷. Ainsi, les études sur les cellules Tfh se sont largement appuyées sur le phénotypage ex vivo des cellules Tfh circulantes périphériques humaines (cTfh) et des modèles murins in vivo . L’étude de la régulation de molécules spécifiques sur les cellules Tfh est donc un défi, en particulier pour les cellules Tfh humaines⁹. Ainsi, une étude ex vivo approfondie des cellules Tfh dérivées des tissus lymphoïdes est essentielle pour améliorer notre compréhension des cellules Tfh humaines.

Les amygdales, en tant qu’organes lymphoïdes secondaires, abritent des populations cellulaires uniques qui ne sont pas présentes dans le sang périphérique, telles que les cellules pré-Tfh (CXCR5^int-1^int CD4⁺) et les cellules GC-Tfh (CXCR5^hi-1^hi CD4⁺), qui jouent toutes deux un rôle déterminant dans la formation des GC. De plus, les amygdales palatines sont parmi les tissus les plus fréquemment retirés dans les chirurgies pédiatriques et sont facilement accessibles, ce qui en fait une source de tissus humains inestimable pour l’exploration de mécanismes immunitaires complexes impliquant des cellules Tfh. Parce qu’elles sont situées dans les voies respiratoires supérieures, un site primaire pour les infections virales respiratoires, les amygdales offrent un tissu avantageux pour étudier les réponses immunitaires à de telles infections virales. Par exemple, notre laboratoire a précédemment caractérisé les cellules Tfh dans les amygdales et les végétations adénoïdes d’enfants qui s’étaient rétablis de la COVID-19 et a comparé ces tissus à ceux de témoins non infectés¹⁰. Ici, nous décrivons notre protocole de traitement et de stockage des amygdales. En utilisant l’exemple des amygdales traitées par un inhibiteur de la PP2A, nous détaillons comment caractériser ces cellules par cytométrie en flux spectral de haute dimension et analyser les données à l’aide d’une analyse non supervisée.

Protocol

Le Code de déontologie de l’Association médicale mondiale (Déclaration d’Helsinki) a été suivi dans toutes les recherches humaines de cette étude. Des échantillons d’amygdales humaines ont été prélevés chez des patients atteints d’hypertrophie adéno-amygdalienne causant des troubles respiratoires du sommeil ou d’apnée obstructive du sommeil, provenant de la Division d’oto-rhino-laryngologie pédiatrique de l’Hôpital national pour enfants, Washington, DC, États-Unis. Cette étude a reçu l’approbation de l’Institutional Review Board (IRB) de l’Hôpital national pour enfants (numéro de protocole IRB 00009806). Le consentement éclairé a été signé par les parents ou les tuteurs de tous les participants inscrits, et l’assentiment a été obtenu des participants mineurs âgés de 7 ans et plus.

1. Prélèvement d’amygdales humaines et isolement et stockage de cellules uniques

1. Isolement de cellules uniques amygdaliennes
   1. Prélèvement d’échantillons chirurgicaux
      1. Prélever les amygdales des patients subissant une amygdalectomie et prélever les morceaux de tissu frais dans la salle d’opération dans un tube à centrifuger de 50 mL rempli de 25 à 35 mL de milieu amygdale stérile glacé : RPMI complété par 5 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 0,05 mg/mL de gentamicine, 10 mM de glutamine et un mélange d’antibiotiques et d’antimycosiques (100 unités/mL de streptomycine, 100 unités/mL de pénicilline, et 0,25 μg/mL d’amphotéricine B).
         REMARQUE : Les amygdales dans le milieu ci-dessus peuvent être stockées à 4 °C pendant la nuit et traitées le lendemain. Une perte minime de viabilité cellulaire a été observée avec l’entreposage de nuit par rapport au traitement le jour même (figure 1A). Les amygdales peuvent également être expédiées pendant la nuit sur de la glace.
   2. Traitement des amygdales
      REMARQUE : Tous les milieux, tampons et outils chirurgicaux doivent être stériles, et l’isolement des amygdales doit être effectué sur de la glace dans une cagoule de biosécurité.
      1. Placez les amygdales dans une boîte de culture cellulaire en plastique de 60 mm contenant 5 ml de milieu d’amygdale réfrigéré. Travail sur glace. À l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux stériles ou d’un scalpel, retirez soigneusement tous les caillots sanguins visibles, la graisse et le tissu conjonctif (figures 1B et C).
      2. Placez les amygdales dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 60 mm avec 5 ml de milieu d’amygdale glacé. Coupez les amygdales en fragments de 3 à 5 mm.
      3. Préparez une nouvelle boîte de culture cellulaire de 60 mm avec 10 ml de milieu amygdale froid et placez une passoire cellulaire de 70 μm dans la boîte.
      4. Déplacez les fragments d’amygdales dans la passoire et écrasez-les à l’aide de l’extrémité du piston d’une seringue stérile de 3 ml à travers la passoire.
      5. Recueillir le milieu contenant les cellules à l’extérieur de la passoire dans la boîte et transférer dans un tube conique de 50 ml.
      6. Ajoutez 10 ml supplémentaires de milieu amygdalien dans le plat à l’aide de la passoire, écrasez les fragments d’amygdales avec le piston et recueillez le milieu dans le tube conique. Pour les grosses amygdales, répétez cette étape 2 à 3 fois plus jusqu’à ce qu’il ne reste que des fragments de tissu conjonctif dans la passoire. Mettez le reste des mouchoirs et des plaques usagées dans un sac à risque biologique et dans les déchets médicaux.
      7. Remplissez le tube conique de 50 mL jusqu’en haut avec du milieu amygdalique.
      8. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
         REMARQUE : L’extension de la centrifugation à 20 min peut augmenter le rendement.
      9. Retirez le surnageant en l’aspirant ou en le pipetant avec précaution et mettez-le en suspension dans 5 ml de tampon de lysage d’ammonium-chlorure-potassium (ACK) à température ambiante (RT) pour lyser les globules rouges. Incuber pendant 5 minutes à RT, puis ajouter 35 ml de PBS réfrigéré pour éviter une lyse supplémentaire. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
      10. Laver une fois avec 50 ml de PBS réfrigéré et centrifuger. Remettre en suspension avec 10 mL de PBS et les cellules de contrainte à travers une passoire en plastique de 70 μm. Comptez les cellules.
2. Cryoconservation des amygdales
   1. Préparez le fluide de congélation (90 % de FBS inactivé par la chaleur et 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO)).
      REMARQUE : Il peut être conservé à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   2. Centrifuger la suspension cellulaire (étape 1.1.2.10) à 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un produit de congélation.
      REMARQUE : Nous conseillons de congeler les cellules à une densité de 10 × 10⁶ à 50 × 10⁶ cellules / ml de milieu de congélation¹¹.
   3. Aliquote de 0,5 à 1 mL de la suspension cellulaire dans des cryoflacons stériles. Congelez les flacons dans des récipients de congélation à débit contrôlé dans un congélateur à -80 °C. Transférez les flacons dans un réservoir de stockage contenant de l’azote liquide dans un délai d’une semaine pour une conservation à long terme.
3. Décongélation des cellules congelées
   REMARQUE : Une approche de décongélation par dilution séquentielle référencée à partir d’un protocole de préparation d’échantillon pour le séquençage de l’ARN sur cellule unique est décrite ci-dessous¹². D’autres méthodes de décongélation peuvent également fonctionner, mais nous avons constaté une plus grande viabilité cellulaire avec cette approche par rapport à la mise en place immédiate de cellules dans un tampon de décongélation à chaud (Figure 1D). Le tampon de lavage peut être préparé à l’avance. Le tampon de décongélation est composé d’un tampon de lavage et de 0,1 mg/mL de DNase I (la DNase I doit être ajoutée juste avant de commencer la décongélation). L’augmentation du temps de centrifugation à 1 min/mL (pour les tubes de 15 mL) est facultative pour augmenter le rendement de la cellule.
   1. Faites chauffer un bain-marie à 37 °C. Préchauffez le tampon de décongélation et de lavage dans le bain-marie à 37 °C.
      REMARQUE : Tous les lavages de cellules sont effectués à RT.
   2. Décongelez les cryoflacons dans le bain-marie à 37 °C pendant 2 à 3 minutes immédiatement après leur sortie de l’entrepôt. Évitez d’immerger complètement le flacon dans le bain-marie. Retirez le flacon du bain-marie pendant qu’un petit cristal de glace reste visible.
   3. Transférez doucement les cellules décongelées dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pointe de pipette à large calibre dans une hotte de biosécurité. Rincez le flacon cryogénique avec 0,5 mL de tampon de décongélation préchauffé et ajoutez le rinçage goutte à goutte (1 goutte toutes les 5 s) dans le tube conique de 15 mL, en secouant doucement le tube pour mélanger.
   4. Diluez séquentiellement les cellules dans le tube conique de 15 mL en ajoutant progressivement 2 mL, puis 4 mL de milieu avec un temps d’attente de ~1 min entre les ajouts. Ajouter le milieu à raison de 1 mL toutes les 3 à 5 s dans le tube, en remuant doucement pour mélanger.
   5. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min à RT.
   6. Retirer le surnageant ; remettre en suspension la pastille cellulaire dans 300 μL de tampon de décongélation ; et incuber à RT pendant 5 min.
   7. Ajouter 10 ml de tampon de lavage (pas de DNase I). Centrifuger à nouveau à 400 × g pendant 5 min à RT.
   8. Laver une fois de plus : retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de tampon de lavage. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min à RT.
   9. Filtrez les cellules à travers une passoire de 70 μm. Centrifugez à nouveau pendant 5 min à 400 × g à RT et comptez les cellules. Remettre en suspension dans le milieu de culture.

2. Mesure de l’expression des cytokines intracellulaires et des facteurs de transcription après traitement ex vivo

REMARQUE : Ici, nous détaillons notre méthode de caractérisation phénotypique des cellules amygdales Tfh à l’aide de deux panels de cytométrie en flux de haute dimension. Étant donné que l’activité de PP2A est essentielle pour l’expression optimale de la protéine BCL-6 et la différenciation⁴ de Tfh, nous illustrons notre évaluation du maintien et de la fonctionnalité des cellules Tfh par l’examen de cellules amygdales traitées avec la cantharidine, un inhibiteur de la PP2A (CAN).

1. Coloration cytométrique en flux
   1. Coloration intracellulaire des cytokines
      REMARQUE : Les incubations sont effectuées dans l’obscurité. Les réactifs, les anticorps et leurs quantités respectives par puits utilisé dans les deux panneaux sont répertoriés dans la table des matériaux. Pour évaluer la dégranulation des lymphocytes T, l’anticorps anti-CD107a est ajouté lors de l’étape de traitement afin de minimiser les résultats faussement négatifs causés par son internalisation¹³.
      1. Plaque 2 × 10 cellules de⁶ amygdales avec 200 μL de milieu de culture (1 × 10⁷ cellules/mL) dans un puits de fond en U de 96 puits avec les quantités suivantes d’inhibiteur de PP2A CAN pendant 16 h : témoin du véhicule, 3 μM et 6 μM.
         REMARQUE : Le CAN a été reconstitué à 0,1 M avec 1 % de DMSO.
      2. Ajouter du monensin (0,7 μL/mL), de la bréfeldine (1:1 000), de l’acétate de myristate de phorbol (50 ng/mL, PMA), de l’ionomycine (1 000 ng/mL) et 2 μL d’anti-CD107a dans chaque puits pendant 2,5 h dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 ^°C. Le volume total de la culture est de 200 μL par puits.
      3. Centrifuger les anticorps de coloration à ~16 000 × g pendant 3 à 5 min à 4 °C pour éliminer les agrégats d’anticorps. Préparez le mélange d’anticorps de surface pour l’étape 2.1.1.8, qui comprend tous les anticorps de surface, à l’exception des récepteurs de chimiokines, du tampon de coloration brillant Plus et du tampon FACS (volume de chacun indiqué dans la Table des matériaux, total de 112 μL de mélange par réaction).
      4. Après 2,5 h de culture, laver les cellules 2 fois avec 200 μL de PBS glacé par centrifugation à 400 × g pendant 2 min à 4 °C. Entre les lavages, jetez le surnageant en retournant rapidement la plaque. Effectuez la coloration dans la même plaque.
      5. Incuber les cellules dans 100 μL/puits de colorant LIVE/DEAD Blue dilué 1:800 dans du PBS pendant 15 min à RT. Laver 2 fois avec 200 μL de tampon FACS.
      6. Remettre les cellules en suspension avec le bloqueur de monocytes True Stain (bloqueur de monocytes de 5 μL + tampon FACS de 45 μL par puits) pendant 5 min à RT.
      7. Ajoutez séquentiellement des anticorps anti-récepteurs de chimiokines directement à la réaction de coloration (d’abord, anti-CXCR3 et anti-CCR7 pendant 10 min chacun, suivis d’un mélange d’anti-CXCR5 et d’anti-CCR6 avec 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus pendant 5 min à RT). Bien mélanger après chaque ajout en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Voir le tableau des matériaux pour les volumes d’anticorps.
      8. Ajouter le mélange d’anticorps de surface préparé à l’étape 2.1.1.3 directement à la réaction de coloration et incuber pendant 30 min à RT. Le volume total de coloration par réaction est de 180 μL : 50 μL d’inhibiteur de monocytes dans le tampon (voir étape 2.1.1.6) + 18 μL d’anticorps anti-récepteurs de chimiokines (voir étape 2.1.1.7) + 112 μL de mélange d’anticorps de surface (voir étape 2.1.1.3).
      9. Laver 2 fois avec 200 μL de tampon FACS froid.
      10. Remettre les cellules en suspension et incuber avec 80 μL/puits de tampon de fixation à base de paraformaldéhyde à RT pendant 20 min.
      11. Ajouter 160 μL de 1x tampon de perméabilisation dans chaque puits, qui contient déjà un tampon de fixation. Centrifuger la plaque à 400 × g pendant 2 min à RT et laver 1x avec 200 μL de tampon de perméabilisation.
      12. Préparez un mélange d’anticorps anti-cytokines intracellulaires (ICS), qui comprend des anticorps anti-cytokines, Brilliant Stain Buffer Plus et un tampon de perméabilisation (volume total 50 μL/puits, Table des matériaux). Incuber les cellules avec ce mélange d’anticorps cytokines intracellulaires à RT pendant 30 min.
      13. Laver 2 fois avec un tampon de perméabilisation de 200 μL/puits. Remettre en suspension avec 200 μL/puits de tampon FACS.
      14. Stockez les cellules colorées à 4 °C dans l’obscurité et acquérez les données sur un cytomètre en flux spectral dans les 24 heures afin de minimiser la perte d’intensité de coloration¹⁴.
   2. Coloration du facteur de transcription nucléaire
      1. Cultivez les cellules avec CAN comme à l’étape 2.1.1.1 (sans stimuler les cellules).
      2. Ajouter l’anticorps CD40 humain (0,5 μg/mL) dans le milieu de culture et cultiver avec des cellules pendant 15 minutes avant de commencer la coloration. Si les cellules sont stimulées, ajoutez cet anticorps 15 min avant de commencer la stimulation pour éviter l’internalisation de CD40L lors de l’activation^15,16.
      3. Centrifuger les anticorps de coloration et préparer le mélange d’anticorps de surface comme à l’étape 2.1.1.3 : anticorps de surface dans la table des matériaux, 10 μL/puits de tampon de coloration brillant Plus et 54,1 μL/puits de tampon FACS.
         REMARQUE : Le volume total de coloration par puits est de 180 μL : 50 μL de bloqueur de monocytes dans le tampon + 13 μL d’anticorps du récepteur des chimiokines + 117 μL de mélange d’anticorps de surface.
      4. Lavez les cellules et effectuez la coloration LIVE/DEAD Blue et la coloration de surface et les lavages comme aux étapes 2.1.1.5-2.1.1.8.
         REMARQUE : L’anticorps anti-CXCR3 n’est pas inclus dans ce panneau.
      5. Fixez les cellules avec 80 μL de tampon de fixation du facteur de transcription nucléaire de FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set. Incuber pendant 30 min à RT.
      6. Lavez les cellules avec un tampon de perméabilisation comme à l’étape 2.1.1.11.
      7. Préparez le mélange d’anticorps anti-facteur de transcription intracellulaire (TF), qui comprend les anticorps anti-facteur de transcription énumérés dans le tableau des matériaux, 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus et 16 μL de tampon de perméabilisation (volume total de 40 μL/puits). Incuber les cellules avec ce mélange pendant 1 h à 4 °C.
      8. Laver et acquérir sur un cytomètre spectral comme aux étapes 2.1.1.13 et 2.1.1.14.

3. Analyse non supervisée de données de cytométrie en flux de grande dimension

REMARQUE : Les logiciels, les progiciels et leurs versions utilisés pour l’analyse sont répertoriés dans la table des matériaux. Les captures d’écran des étapes 3.2 à 3.4 se trouvent dans le fichier supplémentaire 1. Les scénarios exemplaires des étapes 3.5 à 3.7 se trouvent dans lefichier complémentaire 2 et le fichier supplémentaire 3, les étapes 3.8 à 3.9 dans le fichier supplémentaire 4 et le fichier supplémentaire 5. Les fichiers bruts ICS et TF pour les scripts sont fournis dans le Fichier supplémentaire 6 et le Fichier supplémentaire 7, respectivement.

1. Ouvrez l’espace de travail du logiciel d’analyse de cytométrie en flux où les fichiers « .fcs » sont stockés et effectuez le contrôle comme illustré à la figure 1E.
2. Faites un clic droit sur le nœud cible (cellules T CD4⁺ dans ce cas). Choisissez Sélectionner les nœuds équivalents.
3. Cliquez à nouveau avec le bouton droit de la souris sur le nœud cible. Sélectionnez Exporter/Concaténer des populations.
4. Attendez que la fenêtre Populations : Exporter ou Concaténer s’ouvre, choisissez les valeurs de canal CSV et choisissez la destination des fichiers exportés. Incluez toutes les cellules dans la zone Inclure les événements et sélectionnez Tous les paramètres compensés dans la zone Paramètres . Développez les options avancées, tapez un préfixe pour renommer les fichiers, puis cliquez sur exporter pour exporter les fichiers vers le dossier de destination (exportez un fichier .csv pour chaque échantillon).
5. Lisez les fichiers « *.csv » exportés avec R (un pour chaque échantillon). Attribuez un ID d’échantillon à chaque cellule et combinez les cellules de tous les échantillons dans un seul bloc de données.
6. Ajoutez ou fusionnez des métadonnées (informations supplémentaires sur les échantillons) dans le bloc de données.
7. Sous-échantillonnez au hasard un nombre égal de cellules par échantillon pour l’analyse suivante. Cette étape est facultative.
   REMARQUE : Dans cet exemple, 8 000 lymphocytes T CD4⁺ ont été sous-échantillonnés à partir du nombre total de lymphocytes T CD4⁺ de chaque affection, ce qui représente au moins 1/7 du nombre total de lymphocytes T CD4⁺ .
8. Créer un objet Seurat : interpréter les valeurs de canal pour les marqueurs d’anticorps comme des niveaux d’expression génique lors de la création d’un objet Seurat.
   1. Créez un objet Seurat avec le trame de données généré à partir de l’étape 3.6. Ignorez l’étape NormalizeData et enregistrez-les directement en tant que test de données.
   2. Sélectionnez les marqueurs de surface dans le panneau de flux à utiliser en tant que VariableFeatures dans le clustering non supervisé.
   3. Exécutez ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP en tant que pipeline standard introduit par Seurat, à l’exception de l’étape¹⁷ de NormalizeData.
   4. Ajustez le paramètre de résolution à l’étape FindClusters pour modifier le nombre de clusters, en veillant à ce qu’ils reflètent plus précisément le contexte biologique sous-jacent.
9. Utilisez des outils de visualisation tels que DimPlot et FeaturePlot compatibles avec le package Seurat. Pour comparer des groupes contenant plusieurs échantillons par groupe, calculez le pourcentage de chaque groupe par sujet et effectuez des comparaisons statistiques. Par la suite, utiliser des modèles mathématiques pour des analyses statistiques plus sophistiquées¹⁰.

Results

Pour comparer la viabilité globale des cellules, nous avons coupé l’amygdale en trois morceaux similaires et les avons traités à l’aide de notre protocole dans trois conditions : (1) traitement le jour même, (2) stockage de nuit à 4 °C et (3) stockage de nuit sur glace. La viabilité de ces trois affections était assez similaire, sans différence significative (figure 1A). Nous avons également évalué l’impact du processus de décongélation sur la viabilité des cellules. La méthode de décongélat...

Discussion

Contrairement aux rapports précédents selon lesquels les amygdales fraîches devraient être traitées dans les 3 heures suivant l’intervention chirurgicale¹⁹, nous avons constaté que les échantillons d’amygdales fraîches pouvaient conserver leur viabilité lorsqu’ils étaient stockés à 4 °C et traités dans les 24 heures. Pour optimiser la viabilité cellulaire des amygdales lors de la décongélation du stockage d’azote liquide, nous avons adopté la méthode de décongélat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Machines et instruments
3 mL Seringue en plastique	BD	309657
96 Well U Bottom Plate	Thermo Scientific	163320
1,2 mL Flacons cryogéniques	Corning	430487
Cell strainer 70 µ ; m	Nylon Falcon	352350
Plat de culture cellulaire (60 mm)	VWR	10062-890
Centrifugeuse	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Digital Water Bath	Benchmark	B2000-2
Ciseaux fins - Sharp	F.S.T	14060-11
Plastic Instrument Cases	F.S.T	20830-05
Cytomètre en flux spectral, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Pince à motif standard	F.S.T	11000-13
Pince à motif standard	F.S.T	11000-20
Analyseur de viabilité cellulaire Vi-cell Blu	Beckman Coulter	C19201
Réactifs
0.5 M EDTA pH 8.0	Qualité Biologie	351-027-101
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023
Tampon de lyse ACK	Gibco	A10492-01
Mélange d’antibiotiques-antimycosiques (suspension de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B, 100x)	Gibco	15240-062
Tampon de Teinture Brillant Plus (RUO)	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
Tampon de Fixation Cytofix	BD	554655
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAase I	Roche	10104159001
Fœtal Sérum bovin (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set	eBioscience	00-5523-00
Gentamicine (50 mg/mL)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomycine	Sigma	; I0634-1mg
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Solution de paraformaldéhyde à 16 %, grade EM (PFA)	Microscopie électronique Science	15710	Diluer avec PBS
PBS, pH 7,4	Gibco	10010072
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Myristate 13-Acétate (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Contenants de congélation à débit contrôlé	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamine)	Gibco	11875-085
Pyruvate de sodium (100 mM)	Gibco	11360-070
Bloqueur de monocytes True Stain	BioLegend	426103
Tampons
Milieu			10 % inactivé thermiquement (VWR), 2 nM glutamine, 0,055 mM 2-mercaptoéthanol, 1 % pénicilline/ streptomycine, 1 mM pyruvate de sodium, 10 mM HEPES, 1 % d’acides aminés non essentiels dans RPMI (+L-Glutamine)
Tampon			2 mM EDTA et 2 % FBS inactivé thermiquement dans PBS
Milieu			90 % FBS inactivé par la chaleur et 10 % DMSO
Tampon			décongélation Tampon de lavage + 0,1 mg/mL de DNaseI
Milieu			amygdalienRPMI complété par 5 % de FBS inactivé par la chaleur, 10 mM de glutamine, 0,05 mg/mL de gentamicine, 1 % d’un mélange d’antibiotiques et d’antimycosiques (pénicilline, streptomycine et amphotéricine B).
Tampon			RPMI (+L-Glutamine) complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur et 10 mM d
>strong et d’autres régents pour le panel de cytokines  ; Anticorps
	Bioten BioLegend	328604	2 &mu ; L sur 200 &mu ; L milieu de culture complet par puits. Cet anticorps a été ajouté avec des cellules lors de la stimulation PMA/ionomycine.
Live Dead	100 &mu ; L mix par puits
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	; 1 : 800, 0,125 &mu ; L sur 100 &mu ; L PBS par puits.
Bloc monocytaire	50 &mu ; L mix par puits
Tampon bloqueur de monocytes	BioLegend	426103	5 &mu ; L True Stain bloqueur de monocytes et 45 &mu ; L tampon FACS par anticorps well
Surface pour panel de cytokines
Chemokine receptors mix			&mu ; L/puits  ;
Anti-humain CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-humain CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-humain CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
Anti-humain CXCR5-BV750	BD	747111	1
Tampon de teinture brillant Plus (RUO)	BD	566385	10
;   ;   ;   ;	18 &mu ; L mix par puits pour les récepteurs de chimiokines ; Ajouter dirigé vers les cellules avec le bloc de monocytes buffer
Other surface antibody mix			&mu ; L/puits  ;
Anti-humain CD103-BUV661	BD	749993	2.5
Anti-humain CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-humain CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-humain CD25-BB515  ;	BD	564467	10
Anti-humain CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
Anti-humain CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-humain CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-humain CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
Anti-humain CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-humain CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-humain CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
Anti-humain CD69-BUV563	BD	748764	1
Anti-humain CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-humain FAS-BB700	BD	566542	0.6
Anti-humain HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-humain PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-humain-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Tampon de teinture brillant Plus (RUO)	BD	566385	10
Tampon			61
;   ;   ;   ;   ;	;   ;   ;   ;   ;   ;	;   ;   ;   ;   ;   ;	112 &mu ; L mélanger par puits pour les autres anticorps de surface ; Ajouter directement au tampon de bloc de monocytes (50 &mu ; L) et un mélange de récepteurs de chimiokines (18 &mu ; L, 50+18+112 = 180 &mu ; L au total par well)
Anticorps anti-cytokines intracellulaires pour panel de cytokines			&mu ; L/puits  ;
Anti-humain Granzyme B-PE BD			1
Anti-humain IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
Anti-humain IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
Anti-humain IL2-BV650	BioLegend	500334	3
Anti-humain IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
Anti-humain IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
Perforin-APC	BioLegend	353312	2.5
Anti-humain TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
Anti-IFN&gamma ;-Pacific Blue	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Tampon à colorants brillants Plus (RUO)	BD	566385	10
1x tampon de perméabilisation  ;	eBioscience	00-5523-00	19.15
;   ;   ;	(50 &mu ; L mix per well)
Antibodies & other regents for transcription factor panel
CD40 Antibody, anti-human	Miltenyi Biotec	130-094-133	0.5 &mu ; g/mL de milieu de culture pour la concentration de travail
coloration des morts vivants	100 &mu ; L mix par puits
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	; 1 : 800, 0,125 &mu ; L sur 100 &mu ; L PBS par puits.
Tampon bloqueur de monocytes	BioLegend	426103	5 &mu ; L True Stain bloqueur de monocytes et 45 &mu ; L Tampon FACS par anticorps well
Surface pour panel de facteurs de transcription
Chemokine receptors mix			&mu ; L/puits  ;
Anti-humain CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-humain CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-humain CXCR5-BV750	BD	747111	1
Tampon de teinture brillant Plus (RUO)	BD	566385	10 10
° 10 °   ;	13 &mu ; L mélange par mélange d’anticorps de surface
<			/fort&mu ; L/puits  ;
Anti-humain 4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
Anti-humain CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-humain CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-humain CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
Anti-humain CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
Anti-humain CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-humain CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-humain CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
Anti-humain CD40L-PE	BD		15
Anti-humain CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-humain CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-humain CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
Anti-humain CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-humain HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-humain ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
Anti-humain OX40-APC	BioLegend	350008	5
Anti-humain PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-humain-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Tampon de teinture brillant Plus (RUO)	BD	566385	10
Tampon			54.1
;   ;   ;	;   ;   ;	;   ;   ;	117  ; &mu ; L mélanger par puits pour les autres anticorps de surface ; Ajouter directement au bloc de monocytes  ; tampon (50 &mu ; L) et un mélange de récepteurs de chimiokines (13 &mu ; L, 50+13+117 = 180 &mu ; L au total par well)
Anticorps du facteur de transcription pour le panel de facteurs de transcription	&mu ; L/puits  ;
Anti-humain T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
Anti-humain Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
Anti-humain FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
Anti-humain GATA3-BB700	BD	566642	2
Anti-humain Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
Anti-humain Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Tampon de coloration brillant Plus (RUO)	BD	566385	10
1 x tampon de perméabilisation  ;	eBioscience	00-5523-00	16
;   ;   ;   ;	;   ;   ;   ;	;   ;   ;   ;	40 &mu ; L mix per well
Software and Packages for unsupervised analysis
	Software/package	Version	Source
1	data.table	1.16.2	The Comprehensive R Archive Network
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	Le réseau d’archives R complet
4	R	4.3.2	Le réseau d’archives R complet
5	readxl	1.4.3	Le réseau d’archives R complet
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	Le réseau d’archives R complet
8	SeuratData	0.2.2.9001	Le réseau d’archives R complet
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	Le réseau d’archives R complet
11	viridis	0.6.5	Le réseau d’archives R complet