La microfluidique dans l’évaluation de la fonction plaquettaire

Summary

La fonction plaquettaire sous flux peut être évaluée et la réanimation hémostatique simulée peut être modélisée à l’aide d’un dispositif microfluidique, qui a des applications en traumatologie et en médecine transfusionnelle.

Abstract

La microfluidique incorpore des substrats et des écoulements physiologiquement pertinents qui imitent le système vasculaire et constituent donc un outil précieux pour étudier les aspects de la thrombose et de l’hémostase. Dans des environnements à fort cisaillement simulant un flux artériel, un test microfluidique facilite l’étude de la fonction plaquettaire, car des thrombus riches en plaquettes se forment dans une région sténosée localisée d’un canal d’écoulement. L’utilisation de dispositifs qui permettent de réduire le volume d’échantillon peut également aider à évaluer la fonction plaquettaire en flux à partir d’échantillons de patients ou de modèles animaux à volume limité. L’étude d’échantillons de patients traumatisés ou d’échantillons après une transfusion de produits plaquettaires peut aider à orienter les stratégies thérapeutiques pour les populations de patients dans lesquelles la fonction plaquettaire est essentielle. Les effets de l’inhibition plaquettaire via des agents pharmacologiques peuvent également être étudiés dans ce modèle. L’objectif de ce protocole est d’établir une plateforme microfluidique qui intègre le flux physiologique, les surfaces biologiques et les mécanismes hémostatiques pertinents pour évaluer la fonction plaquettaire avec des implications pour l’étude de la coagulopathie induite par un traumatisme et de la médecine transfusionnelle.

Introduction

Les traumatismes sont l’une des principales causes mondiales de décès et d’invalidité. Les lésions graves sont souvent compliquées par une perturbation endogène unique de l’hémostase et de la thrombose, appelée coagulopathie induite par un traumatisme (TIC)¹. Les plaquettes jouent un rôle essentiel dans les TIC, et elles ont été décrites comme ayant des fonctions adaptatives et inadaptées². Les mécanismes de la dysfonction plaquettaire après une blessure restent incertains, et il est essentiel de mieux comprendre la réponse cellulaire pour guider le développement d’une réanimation et d’un traitement améliorés. Un autre problème épineux concernant la fonction plaquettaire après une blessure est l’incertitude de la fiabilité des lectures actuelles de la fonction plaquettaire chez le patient traumatisé.

De nombreuses études ont montré que même les patients légèrement blessés, sans phénotype clinique de saignement connu, ont une fonction plaquettaire anormale à l’aide de tests conventionnels de la fonction plaquettaire tels que l’agrégométrie ^3,4. Cependant, les limites de l’aggrégométrie pour évaluer la fonction plaquettaire dans un contexte de blessure comprennent l’absence de surface de blessure physiologiquement pertinente, une approche réductionniste de la stimulation par agoniste, la dilution de l’échantillon avec l’agrégation d’impédance du sang total, la séparation du plasma avec l’agrégation de transmission optique de la lumière et l’évaluation de l’échantillon stagnant. De plus, il n’est pas clair si cette sensibilité de la fonction plaquettaire représente un véritable dysfonctionnement cellulaire ou un artefact de mesure, tel qu’une augmentation de l’impédance électrique de base, dans le cadre de la lésion². Ainsi, l’étude des fonctions plaquettaires pertinentes dans le contexte d’un traumatisme est cruciale pour comprendre les TIC, et il y a une marge d’innovation et d’amélioration substantielle dans ce domaine.

Les plateformes traditionnellement utilisées pour étudier la fonction plaquettaire n’incluent pas la dynamique des fluides et l’écoulement, ce qui peut être essentiel pour comprendre le dysfonctionnement plaquettaire lié aux traumatismes et à la coagulopathie induite par un traumatisme⁵. Les mécanismes de l’hémostase qui dépendent du flux comprennent l’élongation du facteur de von Willebrand (VWF) à fort cisaillement, au-dessus d’un taux de cisaillement critique, et la capture plaquettaire via la glycoprotéine 1b ^6,7,8, qui ne sont pas capturées à l’aide de tests de fonction plaquettaire stagnante. De plus, les plaquettes se lient préférentiellement au VWF ou au fibrinogène en fonction du régime d’écoulement et jouent des rôles différentiels dans la thrombose artérielle par rapport à la thrombose veineuse ^9,10. Les thrombus artériels sont principalement constitués de plaquettes, tandis que les thrombus veineux sont principalement composés de globules rouges, en partie sur les régimes de flux¹¹. Les dosages qui intègrent les régimes d’écoulement peuvent aider à élucider les dysfonctionnements relatifs au spectre des phénotypes TIC, de l’hypocoagulabilité et des phénotypes hémorragiques à l’hypercoagulabilité et aux phénotypes thrombotiques. Enfin, les contraintes d’échantillonnage du volume sanguin avec les populations de patients traumatisés peuvent rendre difficiles les tests traditionnels de la fonction plaquettaire. Bien que des tests tels que la cytométrie en flux puissent et doivent être utilisés dans ces circonstances, les résultats décrivent souvent une caractérisation physique d’un échantillon et non une évaluation fonctionnelle hémostatique.

Bien que les mécanismes de la dysfonction plaquettaire ne soient pas complètement compris dans les traumatismes, la modélisation de la dysfonction plaquettaire in vitro, avec des antagonistes de P2Y12 par exemple, peut également aider à guider l’étude des interventions thérapeutiques. La réanimation hémostatique est d’une importance cruciale chez les patients traumatisés où les produits sanguins sont transfusés dans une approche équilibrée pour traiter le choc, la coagulopathie et les lésions endothéliales avec du sang total ou des composants sanguins (globules rouges, plasma et concentrés de plaquettes) dans un rapport unitaire de 1:1:1 12,13,14. Chez les patients traumatisés, l’utilisation précoce de produits sanguins est associée à une amélioration de la survie^15,16. Pour prolonger la durée de conservation, les produits plaquettaires conservés au froid sont de plus en plus étudiés. L’examen des plaquettes stockées au froid montre une activité hémostatique accrue, ainsi qu’une sécurité lors de la transfusion après une blessure^17,18.

L’évolution de la réanimation plaquettaire conservée au froid souligne la nécessité de tests supplémentaires pour comprendre le produit plaquettaire le plus efficace disponible pour les traumatismes. Cependant, les tests traditionnels de la fonction plaquettaire sont souvent sur- ou sous-potentialisés pour détecter le dysfonctionnement, survenant à la fois chez le patient traumatisé recevant une transfusion de plaquettes thérapeutique et dans le produit transfusé lui-même observé dans les lésions de stockage plaquettaire. Déterminer l’origine du dysfonctionnement peut être difficile, compte tenu des limites des tests actuels de la fonction plaquettaire, y compris la nature statique de la plupart de ces tests. Par conséquent, lors de l’étude de la réanimation hémostatique in vitro, la plateforme et les méthodes de détection pour les populations de plaquettes du receveur et du produit sont d’une importance cruciale pour déterminer les interventions thérapeutiques optimales.

Les tests microfluidiques offrent des profils d’écoulement et des surfaces biofidéliques pour créer un test physiologiquement pertinent sur lequel étudier les plaquettes. Les dispositifs microfluidiques peuvent être personnalisés pour étudier une physiopathologie ou des types de blessures particuliers, tels que la perforation des vaisseaux¹⁹ ou les lésions endothéliales²⁰. Ces dispositifs sont généralement composés de polydiméthylsiloxane (PDMS) lié à une lame de microscope en verre avec des modifications de surface, telles que le collagène, pour imiter les lésions sous-endothéliales et tissulaires. L’utilisation de ces types de dispositifs basés sur le flux peut aider à guider la recherche sur la dysfonction plaquettaire liée aux traumatismes et à examiner les approches optimales de la médecine transfusionnelle pour améliorer la dysfonction plaquettaire. Ces stratégies peuvent aider à dissiper la confusion existante quant à la pertinence des dosages plaquettaires statiques, tels que l’agrégométrie chez le patient blessé.

Protocol

Toutes les recherches ont été effectuées dans le respect des directives institutionnelles. L’approbation du Bureau de protection de la recherche humaine de l’Université de Pittsburgh a été obtenue et le consentement éclairé de volontaires humains en bonne santé a été obtenu.

1. Préparation du dispositif microfluidique

1. Pour fabriquer la partie PDMS de l’appareil, préparez un moule maître à l’aide de laiton via un micro-usinage à commande numérique par ordinateur (CNC).
   REMARQUE : Selon les dimensions du canal, des techniques de photolithographie peuvent être utilisées pour créer un moule maître. Le dispositif utilisé dans ce protocole comprend huit canaux micro-usinés parallèles d’environ 480 μm de large, 140 μm de haut à l’entrée et à la sortie du dispositif, et 40 μm de haut à la sténose du dispositif, avec une longueur de rampe vers/depuis la région sténosée d’environ 0,3 mm. La longueur des canaux est d’environ 6 mm.
2. Avec un moule maître obtenu, versez la Base en Élastomère de Silicone (obtenue à partir du kit élastomère) dans un plat de pesée. Ajouter l’agent de durcissement du silicone (obtenu à partir du kit élastomère), qui facilite la réticulation des chaînes de polymère de silicone pour transformer le PDMS liquide en un solide durable et flexible, dans un rapport de 10:1 (agent de base) et bien mélanger le mélange.
3. Placez le moule dans une boîte de Pétri et versez le PDMS non durci sur le moule. Placez la boîte de Pétri à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide pendant 30 min pour éliminer les bulles.
4. Terminez le durcissement du PDMS dans le moule maître en le plaçant dans un four réglé à 70 °C pendant 90 min.
5. Après un durcissement complet du PDMS, découpez le plâtre microfluidique à l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel. Percez des trous sur les bords des canaux (1,5 mm de diamètre des deux côtés).
6. À l’aide de ruban adhésif de laboratoire, nettoyez la surface d’une lame de verre et le côté gravé de la fonte microfluidique. Utilisez de l’air comprimé au besoin pour enlever les débris restants.
7. Placez la lame de verre et la coulée microfluidique avec le côté gravé vers le haut dans un nettoyant plasma. Démarrez la pompe à vide, scellez la chambre et allumez le nettoyeur plasma à haut niveau. Laissez la glissière et le PDMS dans le nettoyeur plasma pendant 30 s, puis éteignez le nettoyeur plasma et retirez l’aspirateur.
8. Liez le coulé nettoyé au plasma et la lame de verre ensemble en appuyant doucement ensemble sur les côtés qui étaient face vers le haut dans le nettoyant plasma. Ensuite, placez le dispositif microfluidique dans un four/plaque chauffante à 70 °C pendant 10 min.
   REMARQUE : N’appliquez pas trop de pression lors du collage de la coulée et de la lame de verre ensemble, car cela pourrait entraîner une perte de morphologie du canal.
9. Rincez chaque chambre avec 10 à 30 μL d’éthanol à 70 % pour stériliser et laissez sécher le dispositif microfluidique sur une plaque chauffante à 70 °C.
   REMARQUE : Les appareils doivent être fabriqués au moins 24 h à l’avance, mais peuvent être fabriqués des semaines ou des mois à l’avance. Les appareils doivent être conservés dans un contenant hermétique ou une boîte de Pétri couverte à température ambiante.
10. La veille de l’expérimentation avec le dispositif microfluidique, rincez à nouveau chaque chambre avec 10 à 30 μL d’éthanol à 70 % pour stériliser et laissez sécher le dispositif microfluidique sur une plaque chauffante à 70 °C.
11. Enduire la chambre d’un réactif de collagène fibrillaire équin de type 1 (1 mg/mL), dilué dans 0,9 % de NaCl dans un rapport volumétrique de 1:5 à travers une sortie désignée vers l’entrée désignée. Assurez-vous que la directionnalité est conservée dans une expérience. Stockez l’appareil dans un récipient fermé chaud et humide pour éviter l’évaporation du collagène enrobé dans le canal.
12. Après 1 h, rincez avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour rincer la solution de collagène. Affleurer dans le sens opposé du revêtement. Lorsqu’il n’est pas utilisé, rangez à nouveau l’appareil dans un récipient chaud, humide et fermé.

2. Préparation de l’échantillon de sang

1. Obtenez un échantillon de sang total citraté par ponction veineuse. Incuber du sang total citraté avec une solution bloquant les récepteurs FC (1:600).
   REMARQUE : Les échantillons de sang sont conservés à température ambiante avant et pendant l’expérimentation.
2. Incuber du sang total citrated avec un anticorps CD41 conjugué à la fluorescence (à l’aide d’un fluorophore de votre choix) (1:600). Colorer pendant 30 min sur une bascule à nutation.
3. Comme contrôle positif de l’inhibition plaquettaire, ajoutez du Ticagrelor, un antagoniste des récepteurs P2Y12 reconstitué dans une solution de 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine à 30 % p/v (HP-β-CD) dans du PBS.
   REMARQUE : Des souches de Ticagrelor allant jusqu’à 6,4 mM doivent être préparées et une dilution supplémentaire des souches de Ticagrelor dans une solution de HP-β-CD (30 % de HP-β-CD dissous dans du PBS) peut être effectuée avant l’expérimentation (des concentrations de 1 000 fois supérieures sont recommandées).
4. Incuber l’échantillon de citrated avec du Ticagrelor (concentration finale jusqu’à 6,4 μM) pendant 30 min pour observer l’inhibition plaquettaire.
5. Si vous mélangez le produit sanguin avec l’échantillon citraté, colorez le produit sanguin avec une solution bloquant les récepteurs FC (1:600) et un anticorps CD41 conjugué à la fluorescence (à l’aide d’un fluorophore séparé et distinct de l’échantillon citraté) (1:600).
   1. Mélanger un équivalent volumétrique des unités de produit transfusées avec l’échantillon citraté. Par exemple, pour simuler la transfusion de 2 unités de produits plaquettaires à une personne hémorragique (environ 250 ml par produit pour un volume sanguin total de 5 000 ml), mélangez 100 μL de produit sanguin dans 1 000 μL d’échantillon de sang citraté.
6. Immédiatement avant l’expérience, filtrez l’échantillon de sang à travers un filtre de 40 μm dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL.

3. Test de la fonction plaquettaire sous écoulement (méthode 1)

1. Allumez le microscope et les logiciels associés.
2. Réglez le niveau de la pompe de la seringue de prélèvement avec la platine du microscope. Ajustez les paramètres sur le pousse-seringue.
   1. Calculez un débit volumétrique (Q) pour un taux de cisaillement moyen de paroi souhaité (γ) de 3 500 ^s-1 dans la région sténosée du canal à l’aide des équations (1) et (2)²¹.
      (1)
      (2)
      Où A est l’aire de la section transversale du canal, P est le périmètre mouillé, λ est le facteur de forme, b est le côté court du rectangle (hauteur) et a est le côté long du rectangle (largeur).
      REMARQUE : La valeur de 3 500 ^s-1 est choisie en raison du cisaillement critique VWF et se situe dans le régime artériel ^7,22,23.
3. Placez le dispositif microfluidique sur la platine du microscope. Collez les bords du dispositif microfluidique sur la platine pour éviter tout mouvement. Assurez-vous que la sortie est orientée vers l’arrière du microscope.
4. Connectez une extrémité du tube de 1/16 » de diamètre intérieur (environ 30 cm de long) à un connecteur coudé et l’autre extrémité à une seringue de 10 ml avec un connecteur de 1/16 » de diamètre intérieur.
5. Remplissez la seringue de PBS stérile et connectez-la au pousse-seringue.
6. Placez le connecteur coudé dans la prise de l’appareil.
7. Préparez des conduites d’entrée d’environ 10 cm de long avec le connecteur coudé à une extrémité et la coupe coudée à l’autre extrémité.
8. Connectez le connecteur coudé d’entrée dans l’entrée de l’appareil.
9. Positionnez la conduite d’entrée dans un tube de microcentrifugation à déchets sur un support coudé.
10. Utilisez l’objectif 10x pour des dimensions de canal d’environ 500 μm de largeur et concentrez-vous sur les bords du canal du dispositif microfluidique.
11. Amorcez les conduites avec du PBS et débarrassez le canal de tout PDMS/débris en avançant manuellement le pousse-seringue. Assurez-vous de vérifier près de l’entrée et de la sortie du canal.
12. Ouvrez les paramètres de capture d’image enregistrés ou créez une procédure de capture d’image pour les images de séries chronologiques capturées toutes les 1 à 2 s avec un canal en fond clair et des canaux fluorescents correspondant aux anticorps CD41 fluorescents utilisés dans l’échantillon de sang.
13. Obtenez l’échantillon de sang citrated filtré et mélangez en pipetant de haut en bas juste avant l’expérience. Placez l’échantillon sur le support de microcentrifugeuse coudé.
14. Positionnez la ligne d’entrée dans l’échantillon.
15. Lancez l’enregistrement de la capture d’image.
16. Lentement, retirez la seringue pour remplir le volume mort dans la tubulure. Une fois que le sang atteint le canal, appuyez immédiatement sur le bouton de lecture de la pompe à seringue pour reprendre l’écoulement au taux de cisaillement souhaité.
17. Ajustez la mise au point si nécessaire.
18. Exécutez l’expérience jusqu’à ce que les plaquettes aient complètement occlus la région sténosée du dispositif microfluidique ou jusqu’à un point final expérimental (c’est-à-dire 10 min).
19. Assurez-vous que le tube d’entrée est immergé dans l’échantillon de sang pendant toute la durée de l’expérience.
20. Une fois l’expérience terminée, arrêtez la capture d’image et arrêtez le pousse-seringue. Enregistrez la capture d’image.
21. Retirez le connecteur coudé d’entrée et videz le contenu du tube dans une conique de vidage. Videz également le contenu de la seringue et des conduites de sortie dans les déchets coniques.
22. Remplacez les connecteurs d’entrée et de sortie et les tubes au besoin pour les échantillons suivants.

4. Test de la fonction plaquettaire sous écoulement avec des échantillons de faible volume (inférieur à 1 ml) (méthode 2)

1. Répétez les étapes 1.1 à 1.4 comme ci-dessus.
2. Perforer une sortie de 1,5 mm de diamètre et une entrée de 3 mm de diamètre sur les bords des canaux.
3. Répétez les étapes 1.6 à 3.6 comme ci-dessus.
4. Utilisez l’objectif 10x pour des dimensions de canal d’environ 500 μm de largeur et concentrez-vous sur les bords du canal du dispositif microfluidique.
5. Nettoyez le canal de tout PDMS/débris en faisant avancer manuellement le pousse-seringue et en évacuant le liquide d’accès avec une lingette de laboratoire. Enlevez tous les débris avec du ruban adhésif de laboratoire sur le dessus du dispositif microfluidique.
6. Avancez manuellement la pompe pour remplir le réservoir d’entrée de 3 mm avec du PBS.
7. Ouvrez les paramètres de capture d’image enregistrés ou créez une procédure de capture d’image pour les images de séries chronologiques capturées toutes les 1 à 2 s avec un canal en fond clair et des canaux fluorescents correspondant aux anticorps CD41 fluorescents utilisés dans l’échantillon de sang.
8. Démarrez le prélèvement sur la pompe à seringue (manuellement ou à la vitesse définie) et une fois que le PBS avance dans le canal et que la conduite de remplissage dans le réservoir descend, interrompez le retrait sur la pompe.
9. Retirez l’excès de PBS du réservoir à l’aide d’une pipette.
10. Lancez la capture d’image.
11. Pipeter l’échantillon de sang dans le réservoir (environ 40 μL) et démarrer immédiatement la seringue de prélèvement. Assurez-vous que le flux démarre.
    REMARQUE : Si le moteur du pousse-seringue pour le retrait n’a pas été amorcé à l’étape 4.8, le débit ne démarrera pas immédiatement et l’expérience doit être répétée.
12. Remplissez le réservoir de sang pendant toute la durée de l’expérience, en vous assurant qu’aucune poche d’air ne pénètre dans le canal.
13. Exécutez l’expérience jusqu’à ce que les plaquettes aient complètement occlus la région sténosée du dispositif microfluidique ou jusqu’à un point final expérimental (c’est-à-dire 10 min).
14. Une fois l’expérience terminée, arrêtez la capture d’image et arrêtez le pousse-seringue. Enregistrez la capture d’image.
15. Retirez l’excès de sang dans le réservoir par pipetage. Videz le contenu du tube de prélèvement dans un tube conique de déchets.
16. Remplacez les connecteurs et les tubes au besoin pour les échantillons suivants.

5. Décontamination

1. Nettoyez les conduites d’entrée et de sortie du sang en rinçant dans une solution d’eau de Javel à 10 %.
2. Si tous les canaux du dispositif microfluidique ont été utilisés, jetez le dispositif dans le conteneur de déchets biologiques dangereux Sharps.
   REMARQUE : Tous les déchets biologiques doivent être éliminés de manière appropriée avec les déchets biologiques.

6. Analyse d’images

1. Exportez les images des expériences cinétiques à l’aide d’un logiciel en cliquant sur Fichier | Exportation/Importation | Exportation.
2. Sélectionnez les paramètres suivants : type de fichier : TIFF (Tagged Image File Format) ; compression : LZW ; cochez Données d’origine et Décalage du pixel ; décochez Appliquer la courbe d’affichage et la couleur du canal ; cochez Définir le sous-ensemble (Région, Région Rectangle, puis sélectionnez la zone du canal avec une mesure de largeur et de hauteur conservée entre les conditions). Exportez vers le dossier de votre choix et cochez la case Créer un dossier.
3. Notez les valeurs expérimentales ci-dessous sur le logiciel : démarrer l’image lorsque le sang pénètre dans le canal ; fréquence d’images (Info, Séries chronologiques).
4. Mesurez l’intensité de fluorescence moyenne normalisée de chaque image dans une expérience à l’aide du code Matlab fourni dans le fichier supplémentaire 1, en modifiant les entrées suivantes pour chaque expérience : image de début/image de fin en fonction de la longueur de l’expérience (assurez-vous que la longueur de l’expérience est conservée entre les conditions) ; le nom de l’expérience/le nom du dossier ; recadrage des paramètres X, Y, H et W. Exécutez le code une fois pour le canal fluorescent plaquettaire du récepteur et une fois pour le canal fluorescent plaquettaire du produit. Indiquez les valeurs normalisées de l’IFM (colonne 2) et de l’AUC normalisée (normalisées à l’image de départ). Soustrayez la valeur de la durée de l’expérience de la valeur AUC normalisée.

Results

Les expériences microfluidiques suivant l’utilisation de cette méthode devraient montrer la formation de thrombus riches en plaquettes dans la région de sténose du canal d’écoulement (Figure 1). La figure 1A illustre des résultats représentatifs où les plaquettes fonctionnelles ont formé un thrombus dans la région sténosée du canal pour bloquer le flux sanguin à travers le canal. Les courbes d’intensité moyenne de fluorescence (MFI) des images cinétiques prises pendant la durée de l’expérience illustrent un décalage, une croissance et une phase de plateau de l’incorporation plaquettaire dans le thrombus en croissance (Figure 2A,C). L’augmentation des concentrations d’un antagoniste de P2Y12, le ticagrélor, diminue l’IMF plaquettaire ainsi que l’aire sous la courbe calculée (AUC) des courbes MFI (Figure 2B,D). Des temps d’incubation plus longs sont nécessaires (30 min contre 5 min) pour observer un dysfonctionnement plaquettaire prononcé, conformément à une relation dose-réponse plus prononcée utilisant l’agrégométrie d’impédance du sang total après une incubation de Ticagrelor de 30 minutes par rapport à une incubation de 5 min (figure supplémentaire S1). Dans différentes conditions de véhicule, des effets similaires de l’inhibition de P2Y12 en fonction du temps ont été observés dans le modèle microfluidique (figure supplémentaire S2).

La visualisation de deux populations plaquettaires dans la méthode de réanimation hémostatique simulée illustre l’incorporation des deux populations plaquettaires dans le thrombus (Figure 3A). L’incorporation des deux populations de plaquettes dans leur signal fluorescent correspondant peut être quantifiée cinétiquement sur la durée de l’expérience via des mesures MFI (Figure 3B). Des pentes plus raides dans la phase de croissance ainsi que des mesures MFI accrues démontrent une fonctionnalité plaquettaire et un potentiel hémostatique accrus, ce qui peut être observé dans la quantification des plaquettes receveuses lorsque l’échantillon de sang a été induit par un dysfonctionnement plaquettaire via l’inhibition de P2Y12, puis dans la réanimation simulée en mélangeant du sang total autologue frais dans un rapport volumétrique de 1:10 coloré avec un fluorophore plaquettaire distinct. Avec le mélange autologue de sang total, une plus grande quantité de plaquettes a été incorporée à partir du produit transfusé simulé par rapport à un produit plaquettaire d’aphérèse au jour 5 de stockage à température ambiante, ce qui a montré une incorporation minimale du produit dans le thrombus en formation. Le mélange de produits plaquettaires à température ambiante au jour 5 a également montré une incorporation de plaquettes receveurs plus faible par rapport au mélange avec du sang total autologue frais (figure 3B).

Figure 1 : Représentation des tests de la fonction plaquettaire à l’aide de la microfluidique. (A) Un dispositif expérimental microfluidique schématique pour l’analyse de la fonction plaquettaire à l’aide d’échantillons de sang de faible volume est présenté, y compris une pompe à seringue de prélèvement aspirant le sang à travers une chambre d’écoulement sténosée, permettant la capture d’images en temps réel. (B) Une vue latérale d’une chambre d’écoulement sténosée est représentée, y compris une surface recouverte de collagène sur laquelle les plaquettes adhèrent, s’activent et s’agrègent, entraînant un thrombus croissant dans la région sténosée. (C) Capture d’image en temps réel d’un échantillon de sang citrated sous flux dans un canal microfluidique sténosé (3 500 ^s-1) et d’un thrombus en croissance formé sur 300 s. Barres d’échelle = 200 μm (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Réduction des modifications du pli plaquettaire de l’IFM et de l’aire sous la courbe après 30 min d’incubation avec l’antagoniste de P2Y12 Ticagrelor. (A) L’incubation avec l’antagoniste de P2Y12 pendant seulement 5 min démontre des phases de latence légèrement prolongées des courbes de l’IFM et (B) de légères diminutions de l’AUC de l’IFM. (C) L’incubation pendant 30 minutes avec l’antagoniste P2Y12 entraîne des phases de latence prolongées et des valeurs MFI réduites ainsi que (D) un dysfonctionnement plus robuste démontré par l’ASC MFI. Les points de données individuels représentent les répétitions biologiques et la moyenne ±écart-type est indiquée. Abréviations : MFI = intensité moyenne de fluorescence ; AUC = aire sous la courbe ; HP-β-CD = 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Mélange de produits sanguins avec inhibition coagulopathique de P2Y12 dans l’échantillon du receveur, simulant un dysfonctionnement plaquettaire du patient, dans la chambre microfluidique. (A) Unité plaquettaire d’aphérèse (plasma, stockage 7 jour) (CD41 en cyan) mélangée dans un rapport de 1:10 avec du sang citrated pré-incubé avec 0,8 μM de Ticagrelor pendant 30 min (CD41 en rouge). (B) Courbes d’intensité de fluorescence moyennes normalisées représentatives de l’échantillon de sang du receveur recevant soit une unité plaquettaire d’aphérèse (jour de stockage 5), soit du sang total frais autologue (rapport 1:10) avec la cinétique plaquettaire du receveur au fil du temps. Le sang citrated du receveur a été pré-incubé avec 0,8 μM de Ticagrelor pendant 30 min avant d’être mélangé à des produits sanguins. (C) Image représentative de la pile z d’un dispositif modifié collé à une lamelle pour la microscopie confocale. Le produit plaquettaire d’aphérèse a été mélangé à un échantillon de sang thrombocytopénique dans un rapport volumétrique de 1:5 (produit :sang) en plus d’un anticorps anti-facteur de von Willebrand (1:600). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Code Matlab pour l’analyse d’images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S1 : Aggrégométrie d’impédance du sang total en fonction du temps de l’inhibition de P2Y12 avec le Ticagrelor. L’incubation pendant 30 min entraîne une relation dose-réponse plus prononcée par rapport à 5 min. Les solutions pour véhicules et médicaments ont été utilisées à 0,1 % v/v. Les points de données individuels représentent les répétitions biologiques et la moyenne ±écart-type est indiquée. Abréviations : AUC = aire sous la courbe ; HP-β-CD = 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Inhibition de P2Y12 dépendante du temps avec Ticagrelor dans un modèle microfluidique de la fonction plaquettaire. Les courbes représentatives de l’IFM et les valeurs de l’aire sous la courbe pour les répétitions techniques d’un donneur sain individuel sont indiquées avec le véhicule de l’éthanol (1 % v/v) utilisé pour la solubilité du médicament. Abréviations : MFI = intensité moyenne de fluorescence ; AUC = aire sous la courbe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole ci-dessus comporte quelques étapes essentielles pour assurer la fiabilité et la reproductibilité des expériences. Tout d’abord, les anticorps fluorescents doivent être soigneusement envisagés. Les anticorps utilisés pour détecter les plaquettes dans l’échantillon ne doivent pas bloquer la fonction du récepteur plaquettaire de la glycoprotéine Ib (GPIb). L’appariement des lots, dans la mesure du possible entre les expériences, est également essentiel pour assurer la reproductibilité du signal fluorescent. Une autre étape critique de ce protocole consiste à utiliser des consommables et des solutions stériles et des échantillons filtrés dans la mesure du possible. Le filtrage des échantillons de sang immédiatement avant l’expérimentation empêchera les débris ou les amas de plaquettes plus grands que les dimensions du canal de bloquer l’écoulement, ce qui est un autre paramètre essentiel à maintenir cohérent entre les expériences. De plus, les échantillons de sang doivent être analysés dans les 4 heures suivant le prélèvement, comme décrit dans la circulaire d’information sur l’utilisation du sang humain et des composants sanguins préparée par l’AABB, la Croix-Rouge américaine, les centres de transfusion sanguine des États-Unis et le programme de transfusion sanguine des forces armées, sauf lors de l’analyse des lésions de stockage des produits sanguins.

Des modifications peuvent être envisagées dans ce protocole, telles que la liaison du PDMS à une lamelle de recouvrement pour la microscopie confocale, illustrée à la figure 3C. Si nécessaire, avant l’imagerie, une solution fixatrice peut être perfusée à travers les canaux et lavée avec du PBS pour être stockée avant l’imagerie. De plus, bien que des dimensions de canal reproductibles soient essentielles pour garantir des taux de cisaillement conservés entre les conditions, la hauteur de la région sténosée peut être modifiée, mais affectera directement le moment de la formation du thrombus, même si les taux de cisaillement correspondent. Étant donné que les dimensions de canal plus grandes nécessiteront plus de temps pour atteindre une formation substantielle de thrombus, un volume d’échantillon plus important sera nécessaire. Lors du dépannage de ce protocole, une considération importante doit être la stratégie de revêtement. Le type spécifique de collagène, le moment, la dilution et les conditions de stockage sont tous des facteurs qui peuvent affecter la couche de surface. Bien que ce protocole ait été validé pour ce réactif de collagène particulier (Table des matériaux), des alternatives au collagène capables d’adhérer de manière fiable à la surface du dispositif et d’adhérer validée par coloration par immunofluorescence ou d’autres mesures peuvent être envisagées et ont déjà été utilisées avec succès par d’autres groupes²⁴.

Une limitation potentielle de ce protocole est l’absence de réponse endothéliale directe. Cependant, des stratégies de revêtement et des modifications peuvent être apportées pour inclure des tests de fonction plaquettaire en réponse à des lésions endothéliales. Par exemple, les facteurs inflammatoires que les cellules endothéliales sécrètent en réponse à une blessure pourraient être modifiés dans la stratégie d’enrobage de ce protocole ou ajoutés de manière exogène à l’échantillon de sang testé. L’ajout de ces facteurs sans les complexités de la cellularisation permettrait une approche ciblée pour examiner les effets de l’endothéliopathie sur la fonction plaquettaire. Dans le même ordre d’idées, le plasma de patients provenant d’une maladie ou d’états de contrôle sains peut être injecté dans le système pour tester l’impact des médiateurs solubles dans le plasma sur la fonction plaquettaire.

L’étude de la fonction plaquettaire en flux suivant ce protocole peut faciliter l’étude de la coagulopathie induite par le traumatisme et des approches de médecine transfusionnelle dans le traumatisme. Les tests actuels de la fonction plaquettaire sont souvent sur-potentialisés ou sous-potentialisés pour voir une réponse dysfonctionnelle chez un patient traumatisé. Cette méthode permet une flexibilité et des modifications de conception pour observer la fonction plaquettaire dans des échantillons de patients traumatisés, même avec des contraintes de volume, en plus de la simulation de la dysfonction plaquettaire pour évaluer les interventions thérapeutiques. Au-delà du patient traumatisé, cette méthode pourrait être envisagée pour les patients souffrant d’hémorragie post-partum, les patients en chirurgie cardiaque ou les patients atteints de cancer afin d’évaluer la fonctionnalité plaquettaire et les interventions thérapeutiques potentielles. Il est important de noter que cette méthode intègre la dynamique de l’écoulement qui est d’une importance cruciale pour les mécanismes de formation du bouchon plaquettaire et de la fonction hémostatique.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Axio Observer	Zeiss	4917-0001-000
Bel-Art Space Saver Dessiccateurs sous vide	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Agitateur numérique à plaque chauffante	Fisher Scientific	FB30786161
Mélangeur à dessiccation	Fischer Scientific	88-861-043
OHAUS Scout Balance Balance	Uline	H-5852
Four	Fisher Scientific	15-103-0520
Nettoyeur plasma	Harrick	PDC-32G (115V)
Pousse-seringue (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)	Harvard Apparatus	883015
Zen 3.4	Zeiss	Blue edition	Logiciel
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors	Qosina	11691
Seringue de 10 mL	Fischer Scientific	14-955-459
2-Hydroxypropyl-&beta ;-cyclodextrin	Cayman Chemicals	16169	30 % Dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate
Filtres de 40 microns	Fischer Scientific
anticorps CD41	Novus Biologicals	; NB100-2614	Rapport 1:600 dans le sang total
Réactif de collagène Chrono-Par	Chrono Log Corporation	385	Rapport 1:5 dans la microscopie électronique saline à 0,9 %
Sciences Poinçon de biopsie Miltex avec piston, 3,0 mm	Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Microcentrifugeuse à capuchon instantané SafeLock Tubes, 1,5 mL	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Eau de Javel germicide	Fischer Scientific	50371500
Éthanol	Fisher Scientific	07-678-005	70 %
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Gaz comprimé	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	rapport 1:600 dans le sang total
LevGo smartSpatula Spatule jetable en polypropylène	Fisher Scientific	18-001-017
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-550-A3
Saline tamponnée au phosphate	Gibco	10010-023
Scalpel de sécurité	Fisher Scientific	22-079-718
Saline	Millipore	567442	0,90 %
Sartorius Bateaux de pesage en polystyrène	Fisher Scientific	13-735-744
Couvercles Superslip - Superslip No. 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone	Fisher Scientific	NC9285739	Polydiméthylsiloxane (PDMS)
Ticagrelor	Cayman Chemicals	15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16 » ID, 1/8 » OD, 50 ft length	McMaster-Carr	6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass Barre	McMaster-Carr	8954K721	Pour la fabrication de moules
maîtres Vacutainers	BD	363083
World Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm	Fisher Scientific	NC1215626