Optimisation de la préparation des échantillons pour la microscopie électronique cryogénique

Summary

Ce protocole présente une méthode pratique utilisant Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) comme exemple pour traiter la distribution inégale des particules par l’optimisation de la préparation des échantillons, fournissant une référence aux chercheurs pour élucider efficacement les structures macromoléculaires à l’aide de la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM).

Abstract

La microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) a révolutionné la biologie structurale en permettant l’étude des structures macromoléculaires dans des conditions proches de leur origine, suspendues dans de la glace vitrée. Cette technique permet de visualiser à haute résolution des protéines et d’autres biomolécules sans avoir besoin de cristallisation, offrant ainsi des informations significatives sur leur fonction et leur mécanisme. Les progrès récents de l’analyse des particules uniques, associés à l’amélioration du traitement des données informatiques, ont fait de la cryo-EM un outil indispensable en biologie structurale moderne. Malgré son adoption croissante, la cryo-EM est confrontée à des défis persistants qui peuvent limiter son efficacité, en particulier la distribution inégale des particules. Ce problème conduit souvent à une mauvaise résolution et à une précision réduite dans les structures protéiques reconstruites. Cet article décrit une approche simple et pratique pour relever ce défi, en utilisant la petite protéine de choc thermique de Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) à titre d’exemple. La méthode optimise la préparation des échantillons pour minimiser l’adsorption préférentielle, assurant une distribution plus homogène des particules et des structures cryo-EM protéiques de meilleure qualité. Cette technique offre des conseils précieux aux chercheurs qui souhaitent surmonter des défis similaires dans les études structurales.

Introduction

Avec les progrès récents du matériel d’instrument ^1,2 et de son logiciel de traitement d’image ^3,4,5, la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) est devenue un outil populaire et puissant en biologie structurale moderne. Malgré ces percées, des goulets d’étranglement persistent dans la réalisation de structures macromoléculaires à haute résolution à l’aide de la cryo-EM. L’un de ces défis importants est la distribution inégale des particules, y compris le phénomène de préférenc....

Protocol

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Purification des protéines

1. Induire l’expression de MjsHSP16.5 recombinant chez E. coli BL21(DE3) et purifier la protéine à l’aide d’une colonne de chromatographie chélatrice au nickel comme décrit précédemment²⁶. Après la purification sur une colonne de chromatographie d’exclusion stérique (SEC)²⁶, examiner la pureté de la protéine en chargeant 5 μL de fractions de pic sur un gel SDS-PAGE à 1....

Results

Afin d’identifier les conditions de grille optimales pour MjsHSP16.5, un premier criblage cryo-EM a été effectué, se concentrant principalement sur l’examen de diverses conditions de tampon protéique : (1) le tampon de purification final, qui assure la stabilité et l’homogénéité de MjsHSP16.5 et est important pour sa cristallisation³⁰ ; (2) tampons adaptés aux conditions nécessaires à la croissance de cristaux MjsHSP16.5 de haute qualité de diffraction³⁰ ; et (3) les tampon.......

Discussion

Toutes les études structurales des protéines commencent par la purification des protéines, un processus itératif permettant d’atteindre un équilibre entre l’isolement des cibles protéiques de haute pureté et d’homogénéité tout en préservant leur fonctionnalité native. Même si les compositions tampons permettant de purifier et de préserver les échantillons de protéines sont soigneusement sélectionnées au cours du processus de purification, ces tampons posent souvent des défis lors de

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube à fond rond de 14 mL	SPL Life Sciences	40114
250 & micro ; L Seringue étanche au gaz modèle 1725 LTN	Hamilton	81100	Aiguille cimentée, calibre 22s, 2 po, style de pointe 2
50 & micro ; L Bouton de dialyse	Hampton Research	HR3-326
50 mL BÉCHER EN VERRE	DIAMOND	HA.1010D.50
Ä ; KTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-15	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Réactif	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Micro Tube à centrifuger 1,5 mL	HD Micro	H23015
Tubes PCR 0,2 mL, bouchon plat	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Unité de décharge	Ted Pella	91000
PELCO TEM Bloc porte-grille	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	Microscopie électronique Sciences	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Tube membranaire de dialyse  ;	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Acétate d’uranyle	Merck	8473
Vitrobot Mark IV ThermoFisher	Scientific	VITROBOT
VitroEase Kit de dépistage de tampon et détergents	ThermoFisher Scientific	A49856