Analyse introductive et validation des données de séquençage CUT&#38;RUN

Junwoo Lee; Biji Chatterjee; Nakyung Oh; Dhurjhoti Saha; Yue Lu; Blaine Bartholomew; Charles A. Ishak

doi:10.3791/67359

Article de méthode

Analyse introductive et validation des données de séquençage CUT&RUN

DOI :

10.3791/67359

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13 décembre 2024

Junwoo Lee¹ , Biji Chatterjee¹^,² , Nakyung Oh¹ , Dhurjhoti Saha¹ , Yue Lu¹ , Blaine Bartholomew¹ , Charles A. Ishak¹^,³

¹Department of Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, University of Texas MD Anderson Cancer Center, ²Department of Genomic Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center, ³Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, University of Texas MD Anderson Cancer Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole guide les débutants en bioinformatique à travers un pipeline d’analyse CUT&RUN d’introduction qui permet aux utilisateurs d’effectuer une analyse initiale et de valider les données de séquençage CUT&RUN. La réalisation des étapes d’analyse décrites ici, combinée à l’annotation des pics en aval, permettra aux utilisateurs de tirer des enseignements mécanistes de la régulation de la chromatine.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technique CUT&RUN facilite la détection des interactions protéine-ADN à travers le génome. Les applications typiques de CUT&RUN comprennent le profilage, les modifications de la queue des histones ou la cartographie de l’occupation de la chromatine par le facteur de transcription. L’adoption généralisée de CUT&RUN est motivée, en partie, par des avantages techniques par rapport au ChIP-seq conventionnel, notamment des exigences d’entrée de cellule plus faibles, des exigences de profondeur de séquençage plus faibles et une sensibilité accrue avec un signal de fond réduit en raison d’un manque d’agents de réticulation qui masquent autrement les épitopes d’anticorps. L’adoption généralisée de CUT&RUN a également été réalisée grâce au partage généreux de réactifs par le laboratoire Henikoff et au développement de kits commerciaux pour accélérer l’adoption par les débutants. À mesure que l’adoption technique de CUT&RUN augmente, l’analyse et la validation du séquençage CUT&RUN deviennent des goulets d’étranglement critiques qui doivent être surmontés pour permettre une adoption complète par des équipes de laboratoire principalement humides. L’analyse CUT&RUN commence généralement par des contrôles de qualité sur les lectures de séquençage brutes afin d’évaluer la profondeur de séquençage, la qualité de lecture et les biais potentiels. Les lectures sont ensuite alignées sur un assemblage de séquence génomique de référence, et plusieurs outils bioinformatiques sont ensuite utilisés pour annoter les régions génomiques d’enrichissement en protéines, confirmer l’interprétabilité des données et tirer des conclusions biologiques. Bien que plusieurs pipelines d’analyse in silico aient été développés pour prendre en charge l’analyse de données CUT&RUN, leur structure multi-modules complexe et l’utilisation de plusieurs langages de programmation rendent les plateformes difficiles pour les débutants en bioinformatique qui peuvent manquer de familiarité avec plusieurs langages de programmation mais souhaitent comprendre la procédure d’analyse CUT&RUN et personnaliser leurs pipelines d’analyse. Ici, nous fournissons un protocole de pipeline d’analyse CUT&RUN étape par étape en langage unique, conçu pour les utilisateurs de tout niveau d’expérience en bioinformatique. Ce protocole comprend la réalisation de contrôles de qualité critiques pour valider que les données de séquençage sont adaptées à l’interprétation biologique. Nous nous attendons à ce que le respect du protocole d’introduction fourni dans cet article, combiné à l’annotation des pics en aval, permette aux utilisateurs de tirer des informations biologiques de leurs propres ensembles de données CUT&RUN.

Introduction

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La capacité de mesurer les interactions entre les protéines et l’ADN génomique est fondamentale pour comprendre la biologie de la régulation de la chromatine. Des tests efficaces qui mesurent l’occupation de la chromatine pour une protéine donnée fournissent au moins deux éléments d’information clés : i) la localisation génomique et ii) l’abondance des protéines dans une région génomique donnée. Le suivi des changements de recrutement et de localisation d’une protéine d’intérêt dans la chromatine peut révéler des loci cibles directs de la protéine et révéler les rôles mécanistes de cette protéine dans les processus biologiques basés sur la chromatine tels que la régulation de la transcription, la réparation de l’ADN ou la réplication de l’ADN. Les techniques disponibles aujourd’hui pour profiler les interactions protéine-ADN permettent aux chercheurs d’explorer la régulation à une résolution sans précédent. De telles avancées techniques ont été rendues possibles par l’introduction de nouvelles techniques de profilage de la chromatine qui incluent le développement du clivage sous les cibles et de la libération à l’aide de nucléases (CUT & RUN) par le laboratoire Henikoff. CUT&RUN offre plusieurs avantages techniques par rapport à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) conventionnelle, notamment des exigences d’entrée de cellule plus faibles, des exigences de profondeur de séquençage plus faibles et une sensibilité accrue avec un signal de fond réduit en raison de l’absence d’agents de réticulation qui masquent autrement les épitopes des anticorps. L’adoption de cette technique pour étudier la régulation de la chromatine nécessite une compréhension approfondie du principe sous-jacent à la technique et une compréhension de la façon d’analyser, de valider et d’interpréter les données CUT&RUN.

La procédure CUT&RUN commence par la liaison des cellules à Concanavalin A conjuguées à des billes magnétiques pour permettre la manipulation d’un faible nombre de cellules tout au long de la procédure. Les cellules isolées sont perméabilisées à l’aide d’un détergent doux pour faciliter l’introduction d’un anticorps qui cible la protéine d’intérêt. La nucléase micrococcique (MNase) est ensuite recrutée dans l’anticorps lié à l’aide d’une étiquette de protéine A ou de protéine A/G attachée à l’enzyme. Le calcium est introduit pour initier l’activité enzymatique. La digestion de la MNase aboutit à des complexes mononucléosomales ADN-protéines. Le calcium est ensuite chélaté pour terminer la réaction de digestion, et de courts fragments d’ADN issus de la digestion de la MNase sont libérés des noyaux, puis soumis à la purification de l’ADN, à la préparation de la banque et au séquençage à haut débit¹ (Figure 1).

Des approches in silico pour cartographier et quantifier l’occupation des protéines dans le génome se sont développées parallèlement aux approches de laboratoire humide utilisées pour enrichir ces interactions ADN-protéine. L’identification des régions de signaux enrichis (pics) est l’une des étapes les plus critiques de l’analyse bioinformatique. Les premières méthodes d’analyse ChIP-seq ont utilisé des algorithmes tels que MACS² et SICER³, qui ont utilisé des modèles statistiques pour distinguer les véritables sites de liaison protéine-ADN du bruit de fond. Cependant, le bruit de fond plus faible et la résolution plus élevée des données CUT&RUN rendent certains programmes d’appel de pointe utilisés dans l’analyse ChIP-seq inadaptés à l’analyse CUT&RUN⁴. Cet enjeu met en évidence le besoin de nouveaux outils mieux adaptés à l’analyse des données CUT&RUN. SEACR⁴ représente l’un de ces outils récemment développé pour permettre des appels de pointe à partir de données CUT&RUN tout en surmontant les limites associées aux outils généralement utilisés pour l’analyse ChIP-seq.

Les interprétations biologiques des données de séquençage CUT&RUN sont tirées des sorties en aval de l’appel de pic dans le pipeline d’analyse. Plusieurs programmes d’annotation fonctionnelle peuvent être mis en œuvre pour prédire la pertinence biologique potentielle des pics appelés à partir des données CUT&RUN. Par exemple, le projet Gene Ontology (GO) fournit une identification fonctionnelle bien établie des gènes d’intérêt ^5,6,7. Divers outils et ressources logiciels facilitent l’analyse GO pour révéler les gènes et les ensembles de gènes enrichis parmi les pics CUT&RUN 8,9,10,11,12,13,14. De plus, les logiciels de visualisation tels que Deeptools¹⁵, Integrative genomics viewer (IGV)¹⁶ et UCSC Genome Browser¹⁷ permettent de visualiser la distribution des signaux et les modèles dans les régions d’intérêt du génome.

La capacité à tirer des interprétations biologiques des données CUT&RUN dépend essentiellement de la validation de la qualité des données. Les composants critiques à valider comprennent l’évaluation de : i) la qualité du séquençage de la bibliothèque CUT&RUN, ii) la similarité des répliques et iii) la distribution du signal aux centres de pointe. La validation des trois composants est cruciale pour garantir la fiabilité des échantillons de la bibliothèque CUT&RUN et des résultats d’analyse en aval. Par conséquent, il est essentiel d’établir des guides d’analyse CUT&RUN d’introduction pour permettre aux débutants en bioinformatique et aux chercheurs en laboratoire humide d’effectuer de telles étapes de validation dans le cadre de leurs pipelines d’analyse CUT&RUN standard.

Parallèlement au développement de l’expérience CUT&RUN en laboratoire humide, divers pipelines d’analyse CUT&RUN in silico, tels que CUT&RUNTools 2.0^18,19, nf-core/cutandrun²⁰ et CnRAP²¹, ont été développés pour soutenir l’analyse des données CUT&RUN. Ces outils offrent des approches puissantes pour analyser les ensembles de données CUT&RUN et CUT&Tag unicellulaires et en vrac. Cependant, la structure modulaire relativement complexe du programme et la familiarité requise avec plusieurs langages de programmation pour effectuer ces pipelines d’analyse peuvent entraver l’adoption par les débutants en bioinformatique qui cherchent à comprendre en profondeur les étapes d’analyse CUT&RUN et à personnaliser leurs propres pipelines. Le contournement de cet obstacle nécessite un nouveau pipeline d’analyse CUT&RUN d’introduction qui est fourni dans des scripts simples étape par étape encodés à l’aide d’un langage de programmation unique simple.

Dans cet article, nous décrivons un protocole de pipeline d’analyse CUT&RUN simple et monolangage qui fournit des scripts étape par étape pris en charge par des descriptions détaillées pour permettre aux utilisateurs novices et débutants d’effectuer une analyse de séquençage CUT&RUN. Les programmes utilisés dans ce pipeline sont accessibles au public par les groupes de développeurs d’origine. Les principales étapes décrites dans ce protocole comprennent l’alignement de lecture, l’appel de pointe, l’analyse fonctionnelle et, surtout, les étapes de validation pour évaluer la qualité de l’échantillon afin de déterminer la pertinence et la fiabilité des données pour l’interprétation biologique (figure 2). De plus, ce pipeline offre aux utilisateurs la possibilité de croiser les résultats d’analyse avec les ensembles de données CUT&RUN accessibles au public. En fin de compte, ce protocole de pipeline d’analyse CUT&RUN sert de guide d’introduction et de référence pour les débutants en analyse bioinformatique et les chercheurs en laboratoire humide.

Protocole

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REMARQUE : Les informations sur les fichiers CUT&RUN fastq dans GSE126612 sont disponibles dans le Tableau 1. Les renseignements relatifs aux applications logicielles utilisées dans cette étude sont énumérés dans la Table des matières.

1. Télécharger le pipeline Easy-Shells_CUTnRUN depuis sa page Github

Ouvrez le terminal à partir du système d’exploitation.
REMARQUE : Si l’utilisateur ne sait pas comment ouvrir le terminal sous macOS et Windows, consultez cette page Web (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). Pour Linux, consultez cette page Web (https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/).
Téléchargez le pipeline d’analyse compressé à partir de Github en tapant wget https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/archive/refs/heads/main.zip -O ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip dans le terminal.
Après avoir téléchargé le fichier zip, décompressez le fichier zip téléchargé en tapant unzip ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip -d ~/Desktop/ dans le terminal.
Après la décompression, supprimez le fichier zip en tapant rm ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip dans le terminal et modifiez le nom du dossier en tapant mv ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN-master ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.
Après avoir supprimé le fichier compressé, tapez chmod +x ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/script/*.sh dans le terminal pour définir l’autorisation exécutable pour tous les scripts shell dans le répertoire de travail. À partir de maintenant, il suffit de taper le chemin et le nom de ces scripts shell dans le terminal ou de faire glisser les scripts dans le terminal et d’entrer pour exécuter ces scripts shell dans le terminal.
REMARQUE : Le shell Bash est généralement préinstallé sur la plupart des distributions Linux. Cependant, les versions récentes de macOS ne fournissent plus de shell Bash préinstallé. Si le système ne dispose pas de Bash, installez d’abord le shell Bash. Consultez les liens ci-dessous pour obtenir des instructions décrivant comment installer le shell Bash dans le système d’exploitation Linux (https://ioflood.com/blog/install-bash-shell-linux/) et macOS (https://www.cs.cornell.edu/courses/cs2043/2024sp/styled-3/#:~:text=The first thing you will,you will see the following :). Ces scripts shell étape par étape sont écrits pour créer un dossier ~/Desktop/GSE126612 pour effectuer la plupart de cette analyse CUT&RUN dans ce répertoire sans qu’il soit nécessaire de le modifier. Si l’utilisateur comprend comment utiliser ces scripts shell, il peut réviser et personnaliser ces scripts shell pour analyser d’autres ensembles de données CUT&RUN et modifier les options selon les besoins spécifiques du projet. Pour lire et modifier ces scripts shell, envisagez d’utiliser Visual Studio Code (https://code.visualstudio.com/) comme option pour un programme facile à utiliser disponible pour les principaux systèmes d’exploitation.

2. Installation des programmes nécessaires à Easy Shells CUTnRUN

Parmi les scripts shell portant le nom de Script_01_installation_***.sh, découvrez le script shell dont le nom inclut le type de système d’exploitation du système de l’utilisateur. Actuellement, Easy Shells CUTnRUN prend en charge le script d’installation pour les systèmes basés sur macOS, Debian/Ubuntu et CentOS/RPM.
Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Dans le terminal, utilisez le script shell d’installation en tapant ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_01_installation_***.sh ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
Lisez le fichier Test_README.md dans le dossier /path/to/SEACR-1.3/Testfiles. Suivez les instructions du fichier README pour déterminer si le SEACR dans le système de l’utilisateur fonctionne correctement.
REMARQUE : Il est crucial de valider la fonction SEACR avec les fichiers de test fournis par la page Github SEACR pour obtenir des résultats d’appel de pointe corrects à partir des données CUT&RUN. Par conséquent, suivez les instructions de Test_README.md dans /path/to/SEACR-1.3/Testfiles immédiatement après l’installation de SEACR. Bien que Easy Shells CUTnRUN fournisse des scripts shell d’installation pour certains systèmes d’exploitation, ces scripts peuvent ne pas fonctionner dans le système de certains utilisateurs pour installer tous les programmes requis pour Easy Shells CUTnRUN. En cas de problème lors de l’installation, consultez le site Web d’origine du programme désinstallé ou demandez de l’aide à l’aide de la page Web des problèmes GitHub de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).

3. Téléchargement de l’ensemble de données CUT&RUN accessible au public à partir de Sequence Read Archive (SRA)

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_02_download-fastq.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE :Ce script va : (i) Créer un dossier (~/Desktop/GSE126612/fastq) et télécharger une liste de fichiers SRA écrits dans un fichier texte (~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/sample_info/SRR_list.txt) dans le dossier fastq. À titre d’exemple, le SRR_list.txt inclut les fichiers fastq d’un sous-ensemble de GSE126612 échantillons CUT&RUN. (ii) Téléchargez les fichiers bruts fastq dans le dossier fastq. (iii) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/log/fastq) et notez un fichier journal (download-fastq_log.txt) et un fichier d’informations d’exemple téléchargé (SRR_list_info.txt) dans ce dossier de journal.
Après avoir exécuté le script, vérifiez le fichier journal. S’il y a un message d’erreur dans le fichier journal, corrigez-le et essayez à nouveau l’étape 3.3. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide sur la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Pour faciliter la mise en pratique de ce pipeline d’analyse CUT&RUN, les échantillons suivants accessibles au public sont extraits de SRA : un échantillon provenant d’un contrôle simulé (IgG), trois échantillons d’une protéine d’architecture de la chromatine et du facteur de transcription (CTCF), quatre échantillons correspondant à une marque d’histone « active » (H3K27Ac) et trois échantillons correspondant à des régions d’initiation transcriptionnelle marquées par l’ARN polymérase II (RNAPII-S5P). Le séquençage a été effectué en tant qu’extrémité appariée, donc deux fichiers sont appariés par échantillon.

4. Contrôle qualité initial des fichiers de séquençage bruts

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_03_fastQC.sh dans le terminal ou faites glisser le script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script shell va : (i) Exécuter le programme FastQC pour tous les fichiers fastq bruts dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/fastq et enregistrer les fichiers du rapport de contrôle qualité dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/fastqc.1st . (ii) Notez un fichier journal (fastqc.1st.log.SRR-number.txt) par exécution FastQC dans un dossier de journal (~/Desktop/GSE126612/log/fastqc.1st).
Une fois l’exécution du script shell terminée, examinez le fichier journal pour clarifier la réussite de l’exécution. S’il y a un message d’erreur dans le fichier journal, corrigez-le et répétez l’étape 4.3. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Parmi les fichiers de sortie, fastqc.html fichiers incluent des résultats de contrôle de qualité conviviaux. S’il y a de graves problèmes de qualité, discutez avec des collègues en bio-informatique afin de déterminer si les données conviennent à l’analyse en aval. Des rapports de contrôle qualité similaires sont utilisés pour confirmer l’amélioration de la qualité des données après le découpage de l’adaptateur. Pour utiliser ce script pour d’autres jeux de données, modifiez le chemin d’accès des répertoires de travail et de sortie pour répondre aux besoins de l’utilisateur. Une différence notable lors de l’interprétation du contrôle qualité de CUT&RUN par rapport aux lectures ChIP-seq est que les lectures en double dans CUT&RUN n’indiquent pas nécessairement des doublons PCR. En effet, les MNase recrutées digéreront dans les mêmes endroits ou dans des endroits similaires au sein de groupes expérimentaux.

5. Qualité et découpage de l’adaptateur pour les fichiers de séquençage bruts

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_04_trimming.sh dans le terminal ou faites glisser le script Script_04_trimming.sh dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script shell va : (i) Exécuter le programme Trim-Galore pour tous les fichiers bruts fastq dans ~/Desktop/GSE126612/fastq pour effectuer le découpage de l’adaptateur et de la qualité. (ii) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/trimmed) et enregistrez les fichiers de sortie Trim-Galore dans le dossier tronqué. (iii) Créez un dossier de journal (~/Desktop/GSE126612/log/trim_galore) et notez un fichier de journal trim_galore_log_RSS-number.txt lors d’une exécution de Trim-Galore.
Une fois l’exécution terminée, examinez attentivement le fichier journal. S’il y a un message d’erreur dans le fichier journal, corrigez-le et répétez l’étape 5.3. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
Une fois ce processus terminé, comparez les fichiers de sortie .html avec les fichiers fastqc.html créés dans la version 4.3. Révisez le chemin des répertoires d’entrée et de sortie pour effectuer l’étape de découpage de tous les fichiers fastq situés ailleurs.

6. Téléchargement de l’indice Bowtie2 pour les génomes de référence pour les échantillons de contrôle réels et de pointe

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_05_bowtie2-index.sh dans le terminal ou faites glisser le script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce texte radiophonique permettra de : (i) télécharger les indices Bowtie2 pour les génomes de référence des échantillons réels (humain ; hg19 ; utilisé dans la publication originale²²) et les génomes de référence de contrôle Spike-in (levure bourgeonnante ; R64-1-1) dans le dossier bowtie2-index (~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/bowtie2-index). (iii) Notez un fichier journal (bowtie2-index-log.txt) dans un répertoire de journaux (~/Desktop/GSE126612/log/bowtie2-index).
Une fois l’exécution terminée, vérifiez le fichier journal. S’il y a un message d’erreur, corrigez-le et répétez l’étape 6.3. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : À l’heure actuelle, les indices Bowtie2 pour divers génomes de référence sont fournis sur le site Web de Bowtie2 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml). Les utilisateurs peuvent modifier Script_05_bowtie2-index.sh pour télécharger n’importe quel index Bowtie2 afin de répondre à leurs besoins. Si l’utilisateur ne peut pas localiser l’indice Bowtie2 du génome de référence d’intérêt, localisez les fichiers fasta de séquence du génome de référence à partir de :
1. Ensembl ftp (https://ftp.ensembl.org/pub/current_fasta/)
2. Page web de l’UCSC (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/downloads.html)
3. ou d’autres bases de données spécifiques à l’espèce.
  Après avoir localisé les fichiers fasta de séquence du génome de référence, créez un index Bowtie2 pour le génome de référence téléchargé en suivant la section « L’indexeur bowtie2-build » (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#the-bowtie2-build-indexer) du site Web Bowtie2.

7. Cartographie des lectures de séquençage CUT&RUN tronquées sur les génomes de référence

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_06_bowtie2-mapping.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script shell va : (1) Exécuter le programme bowtie2 pour mapper tous les fichiers fastq ajustés de l’adaptateur et de qualité à la fois au contrôle expérimental (humain ; hg19) et au contrôle de pointe (levure bourgeonnante ; R64-1-1) référencent les génomes indépendamment. (ii) Exécutez la fonction de vue samtools pour compresser les fichiers de paires de lecture mappés au format bam. (iii) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/bowtie2-mapped) et enregistrez le fichier compressé des paires de lecture mappées dans le dossier mappé bowtie2. (iv) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/log/bowtie2-mapped) et notez le journal du processus de cartographie sous forme de fichier texte bowtie2_log_hg19_SRR-number.txt pour les paires de lecture cartographiées sur le génome de référence hg19 et bowtie2_log_R64-1-1_SRR-number.txt pour les paires de lecture cartographiées sur R64-1-1) pour indiquer l’efficacité de la cartographie dans le dossier de journal de mappage bowtie2.
Une fois l’exécution terminée, vérifiez le fichier journal. S’il y a un message d’erreur dans le fichier journal, corrigez-le et exécutez à nouveau le script shell. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Ce script shell exécute bowtie2 avec des options pour mapper les fichiers de séquençage d’extrémité appariée afin de trouver des paires de lecture mappées de manière concordante avec des longueurs de fragment de 10 à 700 pb. Découvrez les descriptions des options en tapant bowtie2 --help dans le terminal ou en visitant le site Web de bowtie2 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml#the-bowtie2-aligner) pour comprendre et modifier les options si nécessaire. Utilisez ce script shell pour mapper n’importe quel autre fichier fastq en modifiant le chemin d’accès et le format de nom des fichiers fastq et des index Bowtie2.

8. Tri et filtrage des fichiers de paires de lecture mappés

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant « chsh -s $(which bash) » dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_07_filter-sort-bam.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script va : (i) Exécuter la fonction de vue samtools pour tous les fichiers de paires de lecture mappés compressés dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/bowtie2-mapped pour filtrer les paires de lecture mappées aux régions chromosomiques non canoniques, à la liste noire annotée publiquement et aux régions de répétition TA. (ii) Exécutez la fonction de tri samtools pour trier les fichiers bam filtrés par les noms des fragments ou les coordonnées au sein du même répertoire. (iii) Notez un fichier journal pour un fichier bam d’entrée dans le répertoire ~/Desktop/GSE126612/log/filter-sort-bam .
Une fois l’exécution terminée, examinez attentivement les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur dans les fichiers journaux, corrigez-le et essayez d’exécuter à nouveau le script shell. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Les fichiers bam résultants (sortie) triés par les noms des fragments serviront de fichiers d’entrée pour créer des fichiers BED de fragment et des fichiers bedGraph de comptage de lectures brutes. Les fichiers bam triés par coordonnées serviront de fichiers d’entrée pour générer des fichiers BEDPE fragmentaires. Tous les BED, bedGraph et BEDPE seront utilisés pour les appels de pic et la visualisation dans l’analyse en aval. Tous les fichiers de lit d’annotation pour les régions chromosomiques canoniques (chr1~22, chrX, chrY et chrM), les régions de la liste noire^{annotées publiquement 23} et les régions de répétition TA¹⁸ se trouvent dans le répertoire ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/blacklist . Si nécessaire, utilisez ce répertoire pour ajouter des fichiers de liste noire supplémentaires. Utilisez ce script shell pour exécuter les mêmes fonctions pour d’autres fichiers bam de paires de lecture mappées en modifiant le chemin d’accès et le nom des fichiers bam. Tapez samtools view --help et samtools sort --help dans le terminal pour plus de description de ces fonctions.

9. Convertissez les paires de lectures mappées en fichiers bedGraph de fragments BEDPE, BED et de comptages bruts

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_08_bam-to-BEDPE-BED-bedGraph.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script va : (i) Exécuter macs3 filterdup et la fonction awk pour convertir les fichiers bam triés par coordonnées en fragmenter les fichiers BEDPE dont la longueur des fragments est inférieure à 1 ko, et enregistrer les fichiers BEDPE dans ~/Desktop/GSE126612/BEDPE. (ii) Créez un répertoire de journaux (~/Desktop/GSE126612/log/bam-to-BEDPE) et notez un fichier journal par fichier de fragments de lectures mappés. (iii) Exécuter les fonctions bedtools bamtobed et awk, cut, sort pour convertir les fichiers bam triés par les noms des fragments en fichiers BED fragmentés dont la longueur des fragments est inférieure à 1 kb. (iv) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/bam-to-bed) et enregistrez les fichiers BED fragmentaires dans le dossier bam-to-bed. (v) Notez un fichier journal par fragments de lecture mappé dans un répertoire de journaux (~/Desktop/GSE126612/log/bam-to-bed). (vi) Exécuter la fonction bedtools genomecov pour générer des fichiers bedGraph bruts readcounts en utilisant les fichiers BED fragmentés dans un dossier (~/Desktop/GSE126612/bedGraph).
Une fois l’exécution terminée, vérifiez attentivement les fichiers journaux. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Les fichiers bedGraph de sortie seront utilisés comme fichiers d’entrée pour le programme d’appel de crête SEACR avec l’option de normalisation dans la section 12 et la normalisation SFRC (Scaled Fractional Readcount)²² dans la section 10. Les fichiers BED de fragments serviront de fichiers d’entrée pour les lectures mappées normalisées par million de pointes dans la normalisation de contrôle négatif (SRPMC) ^24,25 dans la section^10.To capturer de courts fragments (>100 pb) uniquement pour les données CUT&RUN de facteurs associés à la chromatine, modifier l’étape de filtrage des fragments dans ce script et procéder à l’étape de normalisation. Pour comparer les signaux CUT&RUN entre des fragments de taille courte et normale au sein d’un même échantillon, la normalisation SFRC peut être utile pour réduire l’effet potentiel de sous-échantillonnage causé par la capture de fragments courts uniquement. Utilisez ce script shell pour effectuer les mêmes processus pour d’autres fichiers bam séquencés par paires en modifiant le chemin d’accès et le format de nom des fichiers bam et bed.

10. Conversion de fichiers bedGraph en fichiers bedGraph et bigWig normalisés

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_09_normalization_SFRC.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter la boucle for avec la fonction awk pour créer des fichiers bedGraph normalisés SFRC en utilisant des fichiers bedGraph bruts readcounts dans ~/Desktop/GSE126612/bedGraph. (ii) Exécutez la fonction bedGraphToBigWig pour créer le format compressé (.bw) des fichiers bedGraph normalisés SFRC dans ~/Desktop/GSE126612/bigWig. (iii) Notez un fichier journal pour enregistrer le facteur de normalisation utilisé pour le calcul SFRC par exécution et enregistrez le fichier journal dans ~/Desktop/GSE126612/log/SFRC.
Une fois l’exécution terminée, vérifiez les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur, corrigez-le et exécutez à nouveau le script shell. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : La normalisation du nombre de lectures fractionnées à l’échelle a été utilisée dans la publication originale²² de GSE126612'ensemble de données CUT&RUN. La formule de la normalisation au groupe i est la même que ci-dessous :

Étant donné que cette méthode de normalisation n’inclut pas la normalisation avec un contrôle négatif (par exemple, un échantillon d’IgG) ni un contrôle de pointe, cette approche n’est peut-être pas idéale pour observer la différence de signal à l’échelle du génome entre les échantillons. Cependant, étant donné que cette méthode est théoriquement similaire à d’autres normalisations basées sur le nombre total de lectures (par exemple, le nombre par million), elle serait suffisante pour observer la différence de signal local entre les échantillons.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_09_normalization_SRPMC.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script va : (i) Exécuter la boucle for avec la fonction bedtools genomecov pour créer des fichiers bedgraph normalisés SRPMC dans ~/Desktop/GSE126612/bedGraph en utilisant des fichiers BED fragmentaires dans ~/Desktop/GSE126612/bam-to-bed. (ii) Notez un fichier journal pour enregistrer les facteurs de normalisation utilisés pour la normalisation SRPMC lors d’une exécution dans ~/Desktop/GSE126612/log/SRPMC. (iii) Exécutez la fonction bedGraphToBigWig pour créer le format compressé (.bw) des fichiers bedGraph normalisés et enregistrez les fichiers bigWig normalisés dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/bigWig .
Une fois l’exécution terminée, examinez attentivement les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur dans les fichiers journaux, corrigez-le et exécutez à nouveau le script shell. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : La formule de normalisation SRPMC a été développée pour normaliser le nombre réel de lectures d’échantillons avec un contrôle négatif (échantillon IgG, par exemple) et un contrôle de pic en combinant le facteur de normalisation RPM (lectures par million de lectures mappées), le RPS (ratio de lectures par lecture de pointe) et le rapport de signal relatif au contrôle^24,25. La définition de RPS est la même que ci-dessous :

En appliquant le RPS à la fois pour l’échantillon réel et l’échantillon de contrôle négatif, le rapport de signal relatif (RS) au contrôle pour l’échantillon réel peut être calculé comme suit :

Et la définition du facteur de normalisation RPM (RPM :NF) est la même que ci-dessous :

À partir de là, le facteur de normalisation SRPMC (SRPMC :NF) est sorti en combinant le RS et le RPM :NF ensemble :

Et cette formule peut être simplifiée comme ci-dessous :

Par conséquent, la méthode SRPMC normalise les lectures par le rapport (1) des lectures de pic entre le contrôle et l’échantillon, et (2) les lectures de contrôle normalisées RPM. Étant donné que ce facteur de normalisation prend en compte les lectures de pointe et rend les lectures de contrôle comparables entre les échantillons, cette méthode serait appropriée pour observer la différence à l’échelle du génome entre les échantillons et réduire l’effet de lot dans les lectures totales des échantillons réels et des témoins dans différentes expériences de lot. Ces fichiers bedGraph normalisés deviendront des fichiers d’entrée pour appeler les pics à l’aide de SEACR dans la section 11. Et ces fichiers bigWig normalisés seront utilisés dans la visualisation des loci via IGV et la création de cartes thermiques et de tracés moyens via Deeptools. Il est fortement suggéré d’utiliser un navigateur génomique pour visualiser le modèle de paysage de l’ensemble de données CUT&RUN à l’aide des fichiers bigWig normalisés dans des régions génomiques représentatives afin d’évaluer la qualité des données. Les échantillons CUT&RUN qui présentent des modèles de signal de fond bruyants qui ressemblent au contrôle IgG sont probablement appropriés à omettre pour les analyses en aval. Utilisez ces scripts shell pour normaliser d’autres fichiers bedGraph de lecture, de lecture et de comptage brut, en modifiant le chemin d’accès et les noms de fichiers pour les fichiers bed et bedgraph d’entrée et de sortie. Modifiez ces scripts pour appliquer d’autres calculs de normalisation en modifiant les facteurs et la formule dans ce script.

11. Validation de la distribution de la taille des fragments

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_10_insert-size-analysis.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter picard.jar fonction CollectInsertSizeMetrics à l’aide de fichiers bam de paires de lectures mappées dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/filtered-bam pour identifier la distribution de la taille d’insertion. (ii) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/insert-size-distribution) et enregistrez les résultats de l’analyse de la distribution de la taille d’insertion dans le dossier créé. (iii) Notez un fichier journal pour un fichier bam d’entrée dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/insert-size-distribution .
Une fois l’exécution terminée, vérifiez attentivement les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur dans les fichiers journaux, corrigez-le et essayez d’exécuter à nouveau le script shell. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : En général, l’analyse de la taille de l’insert (sortie) pour les échantillons CUT&RUN montre des pics majeurs dans les plages de taille nucléosomale mono- (100-300 pb) et di- (300-500 pb). Des erreurs ou des limitations techniques (telles qu’une digestion excessive ou insuffisante de la MNase pendant la préparation des échantillons CUT&RUN ou une sélection inappropriée de la taille lors de la préparation de la banque) peuvent entraîner l’enrichissement de fragments trinucléosomales ou plus grands (500 à 700 pb) et identiques ou plus courts que les fragments subnucléosomales (<100 pb). Parfois, l’absence de pics de taille mononucléosomique avec l’enrichissement des fragments longs (>500 pb) et courts (<100 pb) peut être due à des plages de sélection de la taille de la banque choisies au stade du laboratoire humide ou à une faible profondeur de séquençage. Comparez la profondeur de séquençage ('bases séquencées totales' / 'taille totale du génome de référence'), la vue d’ensemble du paysage génomique à l’aide des fichiers bigWig de la section 10 et le modèle de distribution de la taille des inserts pour clarifier la qualité des échantillons CUT&RUN traités. Les lignes pointillées dans les histogrammes représentent la « fraction cumulée » des lectures dont la taille de l’insert est supérieure ou égale à la valeur sur l’axe des x. Cette ligne pointillée permet d’identifier la distribution des tailles d’insertion dans le fichier de lectures mappées en entrée. La progression le long de l’axe des x est associée à l’augmentation de la taille de l’insert. La ligne pointillée identifie la proportion de paires lues mappées dans le fichier bam d’entrée qui ont une taille d’insertion au moins aussi grande que celle indiquée sur la position de l’axe des x d’intersection. Par conséquent, l’interprétation commence à 1 sur la gauche, indiquant que toutes les lectures ont une taille d’insert supérieure ou égale à la plus petite taille, et diminue vers 0 à mesure que la taille de l’insert augmente.

12. Pics d’appels à l’aide de MACS2, MACS3 et SEACR

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_11_peak-calling_MACS.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter les fonctions callpeak macs2 et macs3 callpeak avec et sans contrôle IgG en utilisant des fichiers BEDPE fragmentés pour appeler les peaks et enregistrer les résultats d’appel peak dans les répertoires de sortie (~/Desktop/GSE126612/MACS2 et ~/Desktop/GSE126612/MACS3). (ii) Notez le journal de ces appels de pointe sous forme de fichier texte dans le répertoire de journaux (~/Desktop/GSE126612/log/MACS2 et ~/Desktop/GSE126612/log/MACS3)
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_11_peak-calling_SEACR.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter SEACR_1.3.sh script avec et sans contrôle IgG, avec des options strictes et détendues en utilisant des readcounts bruts bedGraph et des fichiers bedGraph normalisés pour appeler les pics. (ii) Créez le répertoire de sortie (~/Desktop/GSE126612/SEACR-peaks) et enregistrez les résultats d’appel de pointe par SEACR. (iii) Notez le journal de ces appels de pointe sous forme de fichier texte dans le répertoire de journaux (~/Desktop/GSE126612/log/SEACR).
Une fois l’exécution des scripts shell terminée, vérifiez attentivement les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur dans les fichiers journaux, corrigez-le d’abord. Certains programmes peuvent ne pas appeler ensemble les pics de l’échantillon de contrôle IgG avec l’option de contrôle IgG, omettant ainsi le message d’erreur concernant l’échantillon de contrôle IgG avec l’option de contrôle IgG. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Ces deux scripts shell effectuent des appels de pic pour les échantillons CUT&RUN à l’aide de trois appelants de pic (MACS2, MACS3 et SEACR) avec diverses options : avec/sans option de contrôle IgG, utilisation de comptages de lectures bruts fichiers bedGraph avec option de normalisation de l’appelant de pic ou comptages de lectures normalisés fichiers bedGraph sans option de normalisation de l’appelant de pic, et options d’appel de pic SEACR strictes et détendues. Étant donné que les fichiers de sortie d’appel de pic ne sont pas suffisants pour être utilisés directement dans les analyses en aval, Easy Shells CUTnRUN inclut un script pour traiter ces fichiers de sortie de pics appelés afin de créer de nouveaux fichiers de pics qui incluent le chromosome, le début, la fin et le nom des pics. Grâce à des approches d’appels de pointe intensifs, Easy Shells CUTnRUN offre la possibilité de choisir le programme d’appel de pointe le mieux adapté au projet CUT&RUN d’un utilisateur en comparant les pics appelés sur trois appelants de pointe. De plus, ce pipeline d’analyse CUT&RUN offre également la possibilité de sélectionner les options d’appel de pointe les mieux adaptées au projet CUT&RUN d’un utilisateur. Ces comparaisons seront effectuées par diagramme de Venn, et visualisation sous forme de carte thermique et de graphique moyen.

13. Création de limes de lit de pic appelées

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_12_make-peak-bed.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécutez la fonction awk à l’aide des fichiers de lit dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/SEACR pour créer deux types de fichiers de lit de pointe SEACR ~/Desktop/GSE126612/peak-bed_SEACR dossier. L’ensemble des fichiers de lit de crête incluent le début et la fin de chaque crête, et les fichiers de lit de crête focalisés incluent le début et le lit du bac de signal le plus élevé dans chaque crête. (ii) Exécutez la fonction awk à l’aide des fichiers _peaks.xls dans les dossiers ~/Desktop/GSE126612/MACS2 et ~/Desktop/GSE126612/MACS3 pour créer des fichiers de lit de pic entiers qui incluent le début et la fin de chaque pic appelé par MACS2 et MACS3 dans les dossiers ~/Desktop/GSE126612/peak-bed_MACS2 et ~/Desktop/GSE126612/peak-bed_MACS3 . (iii) Exécutez la fonction awk à l’aide des fichiers _summits.bed dans les dossiers ~/Desktop/GSE126612/MACS2 et ~/Desktop/GSE126612/MACS3 pour créer des fichiers de lit de pic ciblés qui incluent le début et la fin du bac le plus significatif dans chaque pic. (iv) Les fichiers journaux sont écrits au format texte dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/peak-bed .
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_13_filter-peaks.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter la fonction bedtools intersect à l’aide de fichiers de lit de crête qui sont appelés sans l’option de contrôle IgG pour supprimer les pics superposés avec les pics de contrôle IgG. (ii) Les fichiers de lit de pic filtrés sont enregistrés dans les dossiers ~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_MACS2, ~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_MACS3 et ~/Desktop/GSE126612/peak-bed-filtered_SEACR . (iii) Un fichier journal log_filter-peaks.txt est créé dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/filter-peaks .
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_14_cat-merge-peak-bed_MACS.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter les fonctions cat et sort pour concaténer les fichiers de lit de pic entiers MACS2 et MACS3 des répliques en un seul fichier de lit de pic et trier le fichier de lit de pic concaténé dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/bed-for-comparison . (ii) Exécutez la fonction de fusion des outils de lit en utilisant les fichiers de lit de pic entiers concaténés pour fusionner les pics qui se chevauchent. (iii) Un fichier journal log_cat-merged-peak-bed_MACS.txt est écrit dans le dossier de journaux ~/Desktop/GSE126612/log/cat-merged-peak-bed.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_14_cat-merge-peak-bed_SEACR.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter les fonctions cat et sort pour concaténer les fichiers de lit de pic SEACR entiers des répliques en un seul fichier de lit de pic et trier le fichier de lit de pic concaténé dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/bed-for-comparison . (ii) Exécutez la fonction de fusion des outils de lit en utilisant les fichiers de lit de pic entiers concaténés pour fusionner les pics qui se chevauchent. (iii) Un fichier journal log_cat-merged-peak-bed_SEACR.txt est écrit dans le dossier de journaux ~/Desktop/GSE126612/log/cat-merged-peak-bed.
Une fois l’exécution des scripts shell terminée, examinez attentivement les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur dans les fichiers journaux, corrigez-le et exécutez à nouveau le(s) script(s). S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Les fichiers de lit de pic de l’ensemble des régions de pic seront utilisés comme fichiers d’entrée de l’analyse du diagramme de Venn pour comparer la similitude entre les options d’appel de pic, les méthodes d’appel de pic, les répétitions et les observations du paysage génomique près des régions de pic. Les fichiers de lit de pic des régions de pic fusionnées seront utilisés pour l’analyse en composantes principales (PC) et l’analyse de corrélation du coefficient de Pearson à l’aide de deeptools. Les fichiers de lit de pic ciblés seront utilisés pour l’analyse de la carte thermique et du tracé moyen à l’aide de Deeptools.

14. Validation de la similarité entre les répétitions à l’aide de la corrélation de Pearson et de l’analyse en composantes principales (PC).

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, les utilisateurs peuvent voir ce qui suit : /path/to/bash (ou un message similaire tel que /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, ignorez cette étape.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_15_correlation_plotCorrelation.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter la fonction de fichier BED multiBamSummary à l’aide des fichiers bam des réplicats, qui ont été triés par coordonnées, et fusionner les fichiers de lit de pic entier pour CTCF, H3K27Ac et RNAPII-S5P afin de générer des fichiers matriciels pour l’analyse de corrélation de Pearson dans le dossier Desktop/GSE126612/deeptools_multiBamSummary . (ii) Exécutez la fonction plotCorrelation à l’aide des fichiers de matrice pour effectuer le calcul du coefficient de corrélation de Pearson et le clustering de carte thermique, et enregistrez le résultat dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotCorrelation . (iii) Notez un fichier journal log_plotCorrelation.txt dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/corrélation .
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_15_correlation_plotPCA.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter la fonction de fichier BEDi multiBamSummary à l’aide des fichiers bam, qui ont été triés par coordonnées, et fusionner les fichiers de lit de pic entier, qui comprend tous les pics CTCF, H3K27ac et RNAPII-S5P, afin de générer des fichiers matriciels pour l’analyse en composantes principales (ACP) dans le dossier Desktop/GSE126612/deeptools_multiBamSummary . (ii) Exécutez la fonction plotPCA en utilisant les fichiers matriciels pour effectuer l’ACP et enregistrez le résultat dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotPCA . (iii) Notez un fichier journal log_plotPCA.txt dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/corrélation .
Une fois l’exécution des scripts shell terminée, vérifiez les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur, corrigez-le et exécutez à nouveau les scripts shell. S’il y a un problème pour résoudre le problème, demandez de l’aide en utilisant la page Web des problèmes github de Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : En principe, les répétitions correctement préparées et traitées présentent des valeurs de coefficient de corrélation de Pearson plus élevées au sein d’un même groupe de clustering et un positionnement proche dans l’analyse en composantes principales. Toute répétition, qui présente un coefficient de corrélation de Pearson plus faible et une longue distance par rapport aux autres répétitions dans le graphique en composantes principales, peut représenter une valeur aberrante potentielle parmi les répétitions. Ce script shell s’applique à tous les formats bam pour les données de lecture mappées. Modifiez le chemin d’accès et le nom de fichier des fichiers bigwig pour répondre aux exigences spécifiques du projet.

15. Validation de la similitude entre les répétitions, les méthodes d’appel de pic et les options à l’aide du diagramme de Venn

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, il peut y avoir quelque chose comme /path/to/bash (par exemple, /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, envisagez de sauter cette étape
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_16_venn-diagram_methods.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter la fonction de venn d’intervention en utilisant les fichiers de lit de pic de la région de pic entière pour trouver les chevauchements entre les pics appelés par diverses options (avec/sans option de contrôle IgG, avec/sans normalisation, et options d’appel de pic strictes/détendues pour SEACR). (ii) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/intervene_methods) et enregistrez les résultats de l’analyse du diagramme de Venn dans ce dossier. (iii) Notez un fichier journal log_intervene_methods.txt dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/intervene.
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_16_venn-diagram_replicates.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter la fonction de venn d’intervention en utilisant les fichiers de lit de pic de la région de pic entière pour trouver les chevauchements entre les pics des réplicats. (ii) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/intervene_replicates) et enregistrez les résultats de l’analyse du diagramme de Venn dans ce dossier. (iii) Notez un fichier journal log_intervene_replicates.txt dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/intervene .
Une fois l’exécution des scripts shell terminée, examinez les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur, corrigez-le et exécutez à nouveau les scripts shell. En cas de problème lors de l’utilisation du pipeline d’analyse Easy Shells CUTnRUN, demandez de l’aide sur la page Web des problèmes GitHub d’Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Les résultats de l’analyse du diagramme de Venn permettent de choisir les options d’appel de pic, les méthodes et les réplicats les plus appropriés avec une reproductibilité élevée pour l’analyse en aval. Il peut être préférable de choisir les options et les méthodes d’appel de crête qui montrent les numéros de crête appelés les plus élevés avec un bon chevauchement avec d’autres méthodes et options d’appel de pointe.

16. Analyse des cartes thermiques et des graphiques moyens pour visualiser les pics appelés.

Ouvrez le terminal et tapez echo $SHELL pour vérifier le shell par défaut dans le terminal actif. Si le shell Bash est le shell par défaut dans le terminal actuel, il peut y avoir quelque chose comme /path/to/bash (par exemple, /bin/bash) dans le terminal.
Si le shell par défaut n’est pas Bash, définissez le shell Bash comme shell par défaut en tapant chsh -s $(which bash) dans le terminal. Si le terminal utilise le shell Bash par défaut, envisagez de sauter cette étape
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_27_plotHeatmap_focused.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
REMARQUE : Ce script est écrit pour : (i) Exécuter la fonction de point de référence computeMatrix à l’aide de fichiers bigWig normalisés et de fichiers de lit de pic ciblés pour créer des matrices de comptage de lectures normalisées au centre des pics ciblés dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/deeptools_computeMatrix . (ii) Exécutez la fonction plotHeatmap à l’aide de la matrice de comptages de lectures normalisés pour générer des cartes thermiques et des graphiques moyens qui visualisent le modèle de distribution des comptages de lectures normalisés aux emplacements de pic ciblés. (iii) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotHeatmap) et enregistrez les fichiers de sortie plotHeatmap dans ce dossier. (iv) Notez un fichier journal log_plotHeatmap_focused.txt dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/plotHeatmap .
Tapez ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN/scripts/Script_27_plotHeatmap_whole.sh dans le terminal ou faites glisser le fichier de script shell dans le terminal et entrez.
Ce script est écrit pour : (i) Exécuter la fonction de point de référence computeMatrix à l’aide de fichiers bigWig normalisés et de fichiers de lit de pic entier pour créer des matrices de comptage de lectures normalisées au centre de l’ensemble des pics dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/deeptools_computeMatrix . (ii) Exécutez la fonction plotHeatmap en utilisant la matrice de comptages normalisés pour générer des cartes thermiques et des graphiques moyens qui visualisent le modèle de distribution du nombre de lectures normalisé à l’ensemble des emplacements de pointe. (iii) Créez un dossier (~/Desktop/GSE126612/deeptools_plotHeatmap) et enregistrez les fichiers de sortie plotHeatmap dans ce dossier. (iv) Notez un fichier journal log_plotHeatmap_whole.txt dans le dossier ~/Desktop/GSE126612/log/plotHeatmap .
Une fois l’exécution des scripts shell terminée, examinez les fichiers journaux. S’il y a un message d’erreur, corrigez-le et exécutez à nouveau les scripts shell. En cas de problème lors de l’utilisation du pipeline d’analyse Easy Shells CUTnRUN, demandez de l’aide sur la page Web des problèmes GitHub d’Easy Shells CUTnRUN (https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/issues).
REMARQUE : Idéalement, les emplacements des sommets des pics MACS2/3 et les emplacements des pics focalisés des pics SEACR présentent une distribution de signal nette et ciblée au centre des graphiques. Cependant, si l’algorithme d’appel de crête ne fonctionne pas correctement pour les données CUT&RUN, une distribution de signal « bruyante » moins ciblée peut apparaître dans les graphiques. Par conséquent, l’utilisation du nombre de pics appelés et des modèles de distribution du signal de crête des tracés de sortie guidera la détermination de la validité du pic pour une analyse CUT&RUN ultérieure qui inclut l’annotation de pic en aval.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La qualité et le découpage de l’adaptateur permettent de conserver les lectures avec une qualité de séquençage élevée
Les techniques de séquençage à haut débit sont susceptibles de générer des erreurs de séquençage telles que des « mutations » de séquence dans les lectures. De plus, les dimères d’adaptateur de séquençage peuvent être enrichis dans les ensembles de données de séquençage en raison d’une mauvaise suppression de l’adaptateur lors de la préparation de la bibliothèque. Des erreurs de séquençage excessives, telles que des mutations de lecture, la génération de lectures plus courtes que nécessaire pour un mappage correct et l’enrichissement des dimères de l’adaptateur, peuvent augmenter le temps de mappage de lecture et peuvent produire des lectures mappées faussement positives qui faussent les résultats de l’analyse bio-informatique en aval. Par conséquent, un filtrage de qualité et un découpage de l’adaptateur sont nécessaires pour conserver des lectures de haute qualité pour l’analyse et l’interprétation en aval.

Afin de conserver des lectures de haute qualité pour l’analyse, ce pipeline d’analyse CUT&RUN (Figure 2) utilise FastQC²⁶ et Trim Galore²⁷. Le script shell « Script_03_fastQC.sh » exécute FastQC pour tous les fichiers fastq du répertoire de travail. Les résultats (figure 3) de cette étape, à l’aide de l’ensemble de données CTCF CUT & RUN accessible au public de GSE126612 (SRR8581589), identifient certaines lectures avec des bases de score de faible qualité (figure 3A, C) et certains degrés de non-concordance de la distribution du contenu GC par séquence entre l’estimation théorique et les lectures réelles (figure 3E).

L’exécution du script « Script_04_trimming.sh » pour exécuter Trim Galore supprime avec succès les lectures avec des bases de score de faible qualité (inférieures à 20 dans la figure 3A) et de faibles qualités de séquence moyennes évidentes avant le découpage (Figure 3B-D). De plus, « Script_04_trimming.sh » permet également de supprimer avec succès l’enrichissement moyen du contenu GC de 55 ~ 60 % affiché dans la distribution GC « pré-découpage » sur le graphique de séquence (Figure 3E, F). Ces résultats démontrent que ce pipeline d’analyse CUT&RUN filtre les lectures de haute qualité pour faciliter une cartographie rapide et précise des lectures vers le génome de référence.

La distribution de la taille de l’insert peut donner une estimation des résultats d’appel de pointe
En raison de l’utilisation de la MNase dans CUT&RUN (Figure 1), les lectures CUT&RUN cartographiées devraient présenter des pics de taille de fragments d’ADN mono- (~200 pb) et di-nucléosomale (~350 pb) dans les graphiques de distribution de la taille des inserts (Figure 4). Des problèmes de détection pour certaines cibles peuvent entraîner des inserts courts (< 100 pb) (Figure 4C). Un niveau élevé de lectures courtes réduit le nombre de lectures pouvant être utilisées pour les appels de pointe à haut niveau de confiance, réduisant ainsi le nombre de pics et impactant l’analyse en aval. Dans ce pipeline d’analyse CUT&RUN, « Script_10_insert-size-analysis.sh » exécute la fonction « picard.jar CollectInsertSizeMetrics » pour effectuer l’analyse de la distribution de la taille d’insert et exporter les histogrammes en tant que sortie de visualisation (Figure 2). Dans les tracés de sortie (Figure 4A-C), l’axe des x indique la plage de tailles d’insertion, le côté gauche de l’axe des y et l’histogramme plein représentent le nombre d’inserts dont la valeur se trouve sur l’axe des x, et le côté droit de l’axe des y montre, avec la ligne pointillée, la fraction cumulée des inserts dont la taille est égale ou supérieure à la valeur de l’axe des x. Par conséquent, l’emplacement sur l’axe des X avec le changement de pente le plus spectaculaire de la ligne pointillée qui coupe le niveau supérieur de l’histogramme identifie la taille principale de l’insert dans l’échantillon. Parmi les lectures cartographiées sur le génome de référence d’intérêt (humain, hg19), les fragments d’échantillon H3K27Ac (marque d’histone active) présentent la distribution attendue de la taille des inserts CUT&RUN avec la taille mononucléosomale la plus élevée et des pics de taille di-nucléosomale détectables (Figure 4B). Les fragments d’échantillon CTCF ont montré des groupes supplémentaires dans des régions de longueur de fragment de 100 ~ 200 pb (Figure 4A). Dans l’ensemble, le pipeline d’analyse CUT&RUN fournit des scripts shell faciles à utiliser pour effectuer une analyse de la distribution de la taille des inserts après avoir cartographié les lectures sur les génomes de référence. Ces analyses deviennent importantes pour estimer l’efficacité des appels de pointe avant l’analyse en aval.

Le pipeline d’analyse CUTnRUN d’Easy Shells fournit des options de filtration et de normalisation pour créer des comptages de lecture fiables
L’un des points critiques de l’analyse CUT&RUN est d’obtenir des paires de lecture mappées appropriées en filtrant les paires de lecture problématiques à partir des sorties de mappage initiales et en normalisant le nombre de lectures mappées filtrées avec une méthode de calcul de normalisation spécifique qui peut répondre aux objectifs/besoins de l’analyse de l’utilisateur. Le pipeline d’analyse CUT&RUN discuté dans cette étude comprend un script « Script_07_filter-sort-bam.sh » pour supprimer les paires de lecture qui sont mappées sur des chromosomes non canoniques, les régions²³ de la liste noire annotées publiquement, et TA répète les régions^18,22 à partir des paires lues qui ont été mappées par le nœud papillon2 à l’aide de « Script_06_bowtie2-mapping.sh ». Ces filtrations sont nécessaires pour supprimer les paires de lecture qui peuvent produire des signaux de pointe de faux-positifs, des valeurs aberrantes et des pics appelés dans l’analyse en aval (Figure 5 ; régions de la boîte jaune).

En plus des filtrations, l’application de la bonne méthode de normalisation est un facteur important pour visualiser avec précision la différence de signal entre les échantillons. Par conséquent, le pipeline d’analyse CUT&RUN comprend des scripts « Script_09_normalization_SFRC.sh » et « Script_09_normalization_SRPMC.sh » pour fournir deux méthodes de normalisation vérifiées publiquement : la lecture fractionnée mise à l’échelle (SFRC)²² et le nombre de lectures mappées par million normalisées de pointes de pointe dans le contrôle négatif (SRPMC)^24,25 (Figure 5A-D). Étant donné que SFRC n’inclut pas de contrôle (par exemple, IgG) ni d’échantillon de pointe dans la formule, la normalisation SFRC peut être utilisée pour des échantillons qui ne comprennent aucun échantillon de contrôle ou qui sont censés montrer des différences de signal dans des régions locales uniquement sans différence d’échelle à l’échelle du génome. Les échantillons normalisés SFRC traités par le pipeline d’analyse CUT&RUN (Figure 5A-D ; pistes rouges) produisent les mêmes modèles de distribution de signaux que les lectures cartographiées de GEO accessibles au public (Figure 5A-D ; pistes noires), ce qui suggère que ce pipeline peut reproduire les résultats de la publication.

La méthode SRPMC est utile pour normaliser les échantillons qui comprennent à la fois des échantillons de contrôle et des échantillons de pointe et qui devraient montrer une différence de signal globale entre les échantillons (figure 5A-D ; pistes vertes). Étant donné qu’un échantillon H3K27Ac (SRR8581599) présente un rapport « (lectures CUT et RUN réelles)/(lectures de pointe) » (RPS d’échantillon ; 997) beaucoup plus élevé que les autres répétitions (237, 175 et 161), les signaux H3K27Ac relatifs semblent différents entre les répétitions dans les échantillons normalisés SFRC et SRPMC (Figure 5A-D ; H3K27Ac comparé sur toutes les pistes). Les échantillons RNAPII-S5P présentent un RPS d’échantillon (1,7, 0,8, 2,1) relativement plus faible que le contrôle IgG (259), de sorte que les échantillons RNAPII-S5P présentent un signal inférieur à celui du contrôle IgG après normalisation SRPMC (Figure 5A-D ; RNAPII-S5P comparé sur toutes les pistes). Par conséquent, le pipeline d’analyse CUT&RUN abordé ici recommande d’utiliser la méthode SRPMC uniquement pour les échantillons qui ont suffisamment de lectures dans les échantillons expérimentaux par rapport aux lectures de contrôle IgG et de contrôle de pointe.

La comparaison du diagramme de Venn peut donner des idées pour choisir une meilleure méthode d’appel de pic et des options
Plusieurs programmes d’appel de pic permettent d’identifier une occupation protéique significativement enrichie dans l’ensemble du génome. Les programmes utilisés pour l’analyse CUT&RUN comprennent les programmes de la famille MACS² et SEACR⁴ qui sont les principales méthodes à ce jour. Cependant, il peut être difficile, en particulier pour les débutants en bioinformatique, d’identifier la méthode et les options d’appel de pic les plus appropriées pour un projet CUT&RUN donné. Par conséquent, le pipeline d’analyse CUT&RUN comprend des étapes d’analyse du diagramme de Venn pour donner aux utilisateurs la possibilité de comparer la similitude et la différence des résultats d’appel de pointe entre diverses options d’appel de pointe (options Script_17_intervene) et programmes d’appel de pointe (Script_19_intervene_methods.sh) (Figure 6A-H).

D’après la comparaison, les pics fusionnés CTCF, H3K27ac et RNAPII-S5P qui sont appelés avec et sans option de contrôle IgG pendant l’étape d’appel de pointe, MACS2 et MACS3 ont appelé plus de pics avec l’option de contrôle IgG (Figure 6A), mais SEACR a appelé plus de pics sans option de contrôle IgG dans les options strictes et détendues (Figure 6B-D). Par conséquent, le pipeline d’analyse CUT&RUN suggère (1) d’appliquer l’option de contrôle IgG pour MACS2 et MACS3, (2) d’appeler séparément les pics pour les échantillons expérimentaux CUT&RUN et les échantillons de contrôle IgG, puis de filtrer les pics IgG ultérieurement pour l’appelant de pic SEACR. Entre MACS2 et MACS3, MACS3 a appelé un peu plus de pics (Figure 6A).

De plus, la comparaison des pics appelés par MACS2 et MACS3 avec l’option de contrôle IgG et SEACR sans option de contrôle IgG montre que les pics SEACR appelés avec l’option stricte se chevauchent davantage avec les pics MACS 2 et MACS3 que les pics SEACR appelés avec l’option détendue (Figure 6E,F). Ainsi, les sorties du pipeline d’analyse CUT&RUN suggèrent que l’option stricte maximise la cohérence SEACR avec les appels de pointe MACS. Enfin, le diagramme de Venn permettant de comparer le chevauchement des pics appelés par SEACR avec normalisation pour les fichiers bedGraph CUT&RUN et sans normalisation pour les fichiers bedGraph CUT&RUN normalisés ne révèle aucune différence entre les méthodes SFRC et SRPMC pour SEACR avec l’option stricte. Les pics SFRC présentent des nombres de pics beaucoup plus élevés et un meilleur chevauchement avec les pics d’options normalisées (« norme » dans la figure 6) que les pics SRPMC pour SEACR avec des options détendues (figures 6G, H).

Comparaisons statistiques entre les répétitions et les échantillons
Pour tirer des conclusions précises sur plusieurs répétitions, il faut évaluer la similitude des répétitions. Le pipeline d’analyse CUT&RUN utilisé ici utilise le calcul du coefficient de corrélation statistique basé sur Deeptools2¹⁵, le regroupement de cartes thermiques et l’analyse en composantes principales (PCA) pour faciliter l’identification des échantillons et des réplications appropriés pour une analyse en aval valide. Le regroupement de cartes thermiques basé sur le coefficient de corrélation de Pearson a montré une corrélation statistiquement significative entre les répétitions pour CTCF, H3K27Ac et RNAPII-S5P à leurs régions de pic appelées (figure 7A-C). Cependant, l’ACP a montré qu’un échantillon de CTCF (SRR8581590) et H3K27Ac (SRR8581608) est situé relativement loin des autres réplicats (Figure 7D) dans toutes les régions de CTCF, H3K27Ac et RNAPII-S5P appelées régions de pic.

Selon le diagramme de Venn pour comparer les pics entre les répétitions, les pics CTCF (SRR8581590) ont montré le moins de chevauchement avec d’autres répétitions dans les trois résultats d’appel de pic (Figure 7E-G), et les pics H3K27Ac (SRR8581608) ont montré le moins de chevauchement avec d’autres répétitions dans les résultats d’appel de crête SEACR (Figure 7F). les pics H3K27Ac (SRR8581608) n’ont pas présenté de chevauchement minimal avec d’autres répétitions dans les résultats d’appel de pics MACS2 et MACS3 (figure 7F), ce qui peut suggérer que la distance entre les répétitions dans l’ACP n’est pas suffisante pour définir un échantillon aberrant. Par conséquent, le pipeline d’analyse CUT&RUN propose de définir la réplication aberrante comme « l’échantillon qui présente un faible coefficient de corrélation de Pearson dans le groupe de clustering de cartes thermiques, une longue distance dans le tracé PCA avec d’autres répétitions et un chevauchement de pics le plus faible entre les répétitions ».

L’appel de pointe facilite la visualisation et l’interprétation des données CUT&RUN
Le pipeline d’analyse CUT&RUN détaillé dans cette étude utilise deux types d’appelants de pointe accessibles au public : la famille MACS et SEACR. Pour optimiser la visualisation des pics appelés, ce pipeline sélectionne le bac de signal le plus élevé comme centre de pic pour les analyses de carte thermique et de méta-tracé. Tous les pics CTCF, H3K27Ac et RNAPII-S5P appelés par les appelants de crête MACS3 et SEACR ont montré un modèle de distribution de pic plus net au centre des bins de signaux les plus élevés (Figure 8A-F, graphiques « focalisés ») qu’au centre de régions de pics entières (Figure 8A-F, graphiques « entiers »). Les échantillons CUT&RUN traités par le pipeline d’analyse CUTnRUN d’Easy Shells avec normalisation SFRC (Figure 8 A-F, graphiques « SFRC ») présentent des modèles de distribution de signal similaires à ceux des échantillons normalisés SFRC dont les paires de lecture brutes mappées sont disponibles publiquement dans GEO (Figure 8A-F, graphiques « publics ») aux pics appelés par le pipeline d’analyse. Ainsi, le pipeline d’analyse CUT&RUN peut reproduire avec succès les résultats de publication.

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Figure 1 : Schéma de la procédure expérimentale CUT&RUN. CUT&RUN est une approche enzymatique permettant de détecter les interactions protéine-ADN dans le génome. La procédure CUT&RUN commence par la liaison des cellules (ou des noyaux isolés) au concanavalin A conjugué à des billes magnétiques pour permettre l’isolement et la manipulation d’un faible nombre de cellules tout au long de la procédure. Les cellules isolées sont perméabilisées à l’aide d’un détergent doux pour faciliter l’introduction d’un anticorps qui cible la protéine d’intérêt. La nucléase micrococcique (MNase) attachée à la protéine A ou à l’étiquette de la protéine A/G est ensuite introduite dans la cellule perméabilisée. La pA-MNase (ou pAG-MNase) est recrutée dans l’anticorps lié à l’aide d’une étiquette de protéine A ou de protéine A/G. Une fois que la MNase est localisée sur les sites cibles, la nucléase est brièvement activée par l’introduction de calcium pour digérer l’ADN autour de la protéine cible. La digestion de la MNase aboutit à des complexes mononucléosomales ADN-protéines. Le calcium est ensuite chélaté pour terminer la réaction de digestion, et de courts fragments d’ADN issus de la digestion de la MNase sont libérés des noyaux par une courte incubation à 37°C, puis soumis à la purification de l’ADN, à la préparation de banques et au séquençage à haut débit¹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Résumé schématique du pipeline d’analyse CUT&RUN d’Easy-Shell. Le pipeline d’analyse CUT&RUN Easy-Shell est conçu en trois sections principales : (1) le contrôle qualité et le mappage des fichiers de lecture bruts (à gauche ; violet), (2) la normalisation des lectures et des nombres de lectures mappés et des appels de pics (au centre ; vert), et (3) la validation des lectures mappées et des pics appelés (à droite ; rose). Dans chaque étape, le numéro de script shell correspondant, une brève description et l’outil de programme utilisé dans cette étape (entre parenthèses) sont fournis. Les flèches de la plaine indiquent les écoulements directs entre les pas. Ce pipeline d’analyse CUT&RUN fournit deux méthodes de normalisation de lecture qui peuvent répondre aux besoins des utilisateurs avec et sans lectures de contrôle, des processus de validation multicouches pour identifier les répliques appropriées pour l’analyse en aval et l’identification ciblée des pics pour la création de cartes thermiques et de métaplots bien ciblés. Ce pipeline d’analyse est écrit dans des scripts shells faciles à utiliser de manière étape par étape pour offrir aux débutants en bioinformatique la possibilité d’apprendre et de pratiquer l’analyse de base des données CUT&RUN en lisant et en éditant les scripts eux-mêmes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Comparaison des résultats du contrôle de la qualité avant et après l’élagage de la qualité. Certaines sorties de rapport de contrôle qualité de FastQC affichent l’effet du découpage de la qualité à l’aide des lectures de SRR8581589 (GSM3609748, CTCF). Les résultats affichés sont les suivants : (A) Score de qualité sur l’ensemble des bases avant le rognage. (B) Même lecture que A) post-rognage. (C) Distribution du score de qualité sur toutes les séquences avant le découpage. (D) Même lecture que C) post-rognage. (E) Distribution du CG sur toutes les séquences avant le découpage. (F) Même lecture que E) post-rognage. Le score de qualité minimum à chaque position dans les lectures de séquençage (A, B) et la qualité moyenne minimale de la séquence (C, D) sont augmentés après le découpage de la qualité. De plus, cette étape peut réduire la différence entre la distribution théorique des nombres GC et le nombre réel de GC par base dans les lectures (E, F) en supprimant les paires de lectures qui ont un taux de non-correspondance de base élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Analyse de la distribution de la taille des inserts. Histogramme de la taille de l’insert pour (A) CTCF, (B) H3K27Ac et (C) l’ARN polymérase phosphorylée sérine 5 II (RNAPII-S5P). Les histogrammes montrent les différences relatives dans la distribution de la taille des inserts entre les échantillons. La ligne pointillée dans l’histogramme représente la fraction cumulée des lectures dont la taille d’insertion est supérieure ou égale à la valeur sur l’axe des x. N : nombre de lectures uniques cartographiées de manière concordante par échantillon après filtration. FR : fragments. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Vue d’ensemble des échantillons CUT&RUN. Les lectures cartographiées CUT&RUN accessibles au public normalisées par le comptage fractionnaire échelonné (SFRC) sans filtration supplémentaire (pistes noires), les échantillons CUT&RUN traités par le pipeline d’analyse CUTnRUN d’Easy Shells avec normalisation SFRC (pistes rouges) et les lectures mappées « Spike-in normalized Per Million mapped reads in the negative Control (SRPMC ; pistes vertes) » sont montrées dans la région du cluster des gènes d’histones, et (B-D) trois autres régions avec des pics CTCF, H3K27Ac et RNAPII-S5P appelés par tous les appelants de pic MACS2, MACS3 et SEACR. Les cases jaunes mettent en évidence l’emplacement des signaux de pointe filtrés pendant l’étape de filtration dans le pipeline d’analyse CUTnRUN d’Easy Shells. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Diagramme de Venn pour comparer les pics appelés par différents appelants de crête et les options d’appel de crête. (A) Comparaison entre les pics appelés par MACS2 et MACS3 avec et sans option d’entrée IgG pendant l’appel de pointe. (B-D) Comparaison entre les pics appelés par SEACR avec et sans l’option d’entrée IgG, les options 'strictes' et 'détendues', et avec l’option de normalisation à l’aide de fichiers de paires de lectures brutes (B), sans option de normalisation à l’aide de fichiers de comptage de lectures normalisés SFRC (C) ou de fichiers de comptage de lectures normalisés SRPMC (D). (E, F) Comparaison entre les pics appelés par MACS2, MACS3 avec l’option d’entrée IgG et SEACR avec l’option stricte (E) ou relâchée (F). (G,H) Comparaison entre les pics appelés par SEACR sans option d’entrée IgG et avec des options strictes (G) ou relâchées (H). avec IgG : pics appelés avec l’option d’entrée IgG. sans IgG : pics appelés sans l’option d’entrée IgG. norm : pics appelés avec l’option de normalisation. non : pics appelés sans option de normalisation. SFRC : pics appelés par des fichiers readcounts normalisés par la méthode du 'scaled fractional count (SFRC)'. SRPCM : pics appelés par des fichiers readcounts normalisés par la méthode SRPMC (Spike-in normalized Reads Per Million mapped reads in the negative Control). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Corrélation de Pearson, analyse en composantes principales et diagramme de Venn pour valider la similarité entre les répétitions. (A-C) Le regroupement des cartes thermiques avec les valeurs des coefficients de corrélation de Pearson affiche le degré de similitude entre les répétitions aux pics appelés par MACS2 (A), MACS3 (B) et SEACR (C). Le coefficient de corrélation de Pearson est dans une valeur comprise entre -1 et 1. Une valeur de coefficient de corrélation de Pearson absolue plus élevée indique une corrélation plus forte entre deux variables, et une valeur de coefficient de corrélation de Pearson positive indique une corrélation positive, où les deux variables se déplacent dans la même direction. Par conséquent, les échantillons présentant une similitude plus élevée présentent un pedigree plus proche dans le regroupement Heatmap et une valeur de coefficient de Pearson plus élevée. (D) L’analyse en composantes principales (ACP) montre un degré de similitude entre les répétitions et les échantillons à toutes les régions de pic CTCF, H3K27Ac et RNAPII-S5P qui sont appelées par MACS2 (à gauche), MACS3 (au centre) et SEACR (à droite). Les échantillons présentant une similitude plus élevée sont positionnés plus près les uns des autres dans le graphique ACP. (E-G) Analyse du diagramme de Venn pour comparer les pics trouvés dans chaque réplication par MACS2 (E), MACS3 (F) et SEACR (G). Le pipeline d’analyse CUT&RUN d’Easy-Shell a proposé d’appliquer les trois méthodes pour identifier les réplicats à forte similarité qui pourraient convenir à la fusion des pics appelés pour l’analyse en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 8 : Visualisation de la carte thermique et du métagraphique de la distribution du signal aux pics. La carte thermique et les métagraphiques affichent la distribution de l’enrichissement autour des centres de pic appelés à l’aide de différents appelants de pic. (A,B) Pics de couper-descendre CTCF appelés à partir d’une répétition (SRR8581589) par MACS3 (A) et SEACR (B). (C, D) H3K27Ac CUT&RUN pics appelés à partir d’une répétition (SRR8581607) à l’aide de MACS3 (C) et SEACR (D). (E, F) Pics RNAPII CUT&RUN appelés à partir d’une répétition (SRR8581589) par MACS3 (E) et SEACR (F). Les paires de lecture mappées accessibles au public (« Public » dans la figure 8) et les fragments mappés par le pipeline d’analyse CUTnRUN d’Easy Shells (« SFRC » dans la figure 8) sont comparés après la normalisation du « comptage fractionnel mis à l’échelle (SFRC) ». Les pics sont appelés par MACS3 avec l’option d’entrée IgG (« MACS3 w/ IgG » dans la figure 8) et SEACR sans entrée IgG et sans option de normalisation à l’aide de fichiers de comptage de lectures normalisés SFRC en mode strict (« SEACR w/o IgG non SFRC stringent » dans la figure 8). Deux versions des fichiers de coordonnées des pics appelés sont préparées : du début à la fin des pics appelés (« entier » dans la figure 8) et l’emplacement du bin avec le signal le plus élevé à l’intérieur des pics appelés (sommets dans MACS3 appelés pics ; « focalisé » dans la figure 8). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Informations pour les fichiers fastq CUT&RUN dans GSE126612. Tous les fichiers fastq CUT&RUN de lecture brute qui sont inclus dans GSE126612 et sont sélectionnés comme exemple de jeu de données pour le pipeline d’analyse CUTnRUN d’Easy Shells sont répertoriés sous forme de table. La colonne 'Nom de fichier' affiche les noms de fichiers des lectures brutes de CUT&RUN fastq qui seront affichés dans '~/Desktop/GSE126612/fastq' après l’exécution de 'Script_02_download-fastq.sh'. 'md5sum' partage MD5 (Message-Digest Algorithm 5) pour l’exemple de jeu de données qui peut être utilisé pour vérifier l’intégrité des fichiers après avoir téléchargé le jeu de données en exécutant 'Script_02_download-fastq.sh'. La dernière colonne décrit l’objectif de CUT&RUN pour chaque échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacité de cartographier l’occupation des protéines sur la chromatine est fondamentale pour mener des études mécanistes dans le domaine de la biologie de la chromatine. À mesure que les laboratoires adoptent de nouvelles techniques de laboratoire humide pour profiler la chromatine, la capacité d’analyser les données de séquençage de ces expériences de laboratoire humide devient un goulot d’étranglement courant pour les scientifiques de laboratoire humide. Par conséquent, nous décrivons un protocole d’introduction étape par étape pour permettre aux débutants en bioinformatique de surmonter le goulot d’étranglement de l’analyse et d’initier des contrôles d’analyse et de contrôle de la qualité de leurs propres données de séquençage CUT&RUN.

Ce protocole d’analyse CUT&RUN décrit l’application de plusieurs étapes pour s’assurer que les signaux de bonne foi sont quantifiés. La suppression des lectures de mauvaise qualité et des séquences d’adaptateur des données de lecture brutes est l’une des premières étapes de contrôle qualité et l’une des étapes les plus critiques pour obtenir des résultats d’analyse précis. Par conséquent, ce pipeline d’analyse comprend des étapes de qualité et de coupe d’adaptateur faciles à appliquer à l’aide du programme Trim-galore²⁷. En raison de l’importance de ce processus, ce pipeline d’analyse comprend des étapes permettant de comparer la qualité des résultats avant (étape 4.3) et après (étape 5.3) le processus de découpage (étape 5.5). En plus de la qualité et du découpage de l’adaptateur, ce pipeline d’analyse supprime également les lectures chromosomiques non canoniques, les régions de répétition TA et les régions de liste noire, qui peuvent introduire un biais de contenu GC et des pics/pics appelés faux positifs. Ces étapes de filtration fournissent une introduction appropriée pour les débutants en bioinformatique afin de comprendre les étapes critiques du contrôle de la qualité pour l’analyse des données CUT&RUN.

Après l’étape de filtration, ce pipeline d’analyse CUT&RUN propose deux options de normalisation : « Scaled fractional readcount (SFRC)²² » et « Spike-in normalized Reads Per Million mapped reads in the negative Control (SRPMC)^24,25 pour créer des fichiers d’entrée pour l’appel de pic en aval et la visualisation. Si l’on s’attend à ce que l’ensemble de données CUT&RUN ne révèle des différences locales qu’en l’absence de différences de signal à l’échelle du génome entre les échantillons, le comptage fractionnel mis à l’échelle (la fraction des comptages multipliée par la taille du gnome de référence) peut suffire pour l’analyse en aval. Cependant, s’il est possible que des différences de signal à l’échelle globale soient présentes entre les échantillons CUT&RUN, les utilisateurs peuvent choisir la méthode SRPMC qui prend en compte le rapport des lectures entre le pic d’entrée et l’échantillon (à la fois CUT&RUN expérimental et échantillons de contrôle négatif) ainsi que la normalisation des lectures par million (RPM) pour les lectures de contrôle négatif afin de rendre les lectures de contrôle négatif comparables entre différents échantillons. Étant donné que le SRPMC fournit des lectures normalisées par rapport aux lectures de contrôle négatif normalisées, cette approche minimise le signal de contrôle négatif et permet la comparaison entre les ensembles de données créés dans différents lots et groupes.

Un facteur important dans l’appel de pics d’échantillons CUT&RUN est l’élimination des pics CUT&RUN faussement positifs lors de l’analyse in silico , en partie grâce à l’inclusion d’échantillons IgG. Plus précisément, ce pipeline d’analyse fournit des approches d’appel de pic pour différents appelants de pic afin d’éliminer les faux positifs CUT&RUN appelés pics. Pour les appelants de pointe MACS2/3, notre pipeline d’analyse applique des lectures fictives IgG comme échantillon d’entrée lors des appels de pointe. Pour le SEACR, ce pipeline d’analyse recommande d’appeler d’abord les pics pour les échantillons expérimentaux et les échantillons de contrôle négatif indépendamment, puis de supprimer les pics qui se chevauchent entre les échantillons expérimentaux et les échantillons de contrôle négatifs, car SEACR peut « perdre » la majorité des pics s’il est doté du contrôle négatif lors de l’appel de crête des échantillons expérimentaux. Les pics organisés présentent une similitude comparable entre les différents appelants et répliqués des pics (figure 5). Dans l’ensemble, la suppression des chromosomes non canoniques de mauvaise qualité, de la région de la liste noire et des répétitions TA, le découpage des séquences adaptatrices, la normalisation de l’ADN de pointe et la gestion appropriée du contrôle négatif pendant les étapes d’appel de pointe fournissent aux utilisateurs des fichiers de comptage de lectures appropriés qui conviennent aux analyses en aval. Avec des fichiers de lecture normalisés de haute qualité et des pics appelés organisés, les utilisateurs peuvent comparer la similarité entre les répétitions et créer des cartes thermiques et des méta-tracés avec un signal de fond ultra-propre pour valider l’appel de pointe efficace.

Les appels de pointe avec des lectures de haute qualité marquent le début de l’élaboration d’interprétations biologiques à partir des données CUT&RUN. Ce protocole décrit l’obtention de signaux de crête focalisés dans des cartes thermiques et des métagraphiques en désignant les emplacements de signal les plus élevés ou les plus statistiquement significatifs comme centres de pointe. Certaines approches d’appel de pointe ne sélectionnent pas les signaux les plus élevés ou les signaux statistiquement significatifs à leur emplacement central. Par conséquent, la redéfinition du centre de chaque pic en tant que signal le plus élevé ou l’emplacement du signal le plus statistiquement significatif constitue une étape importante pour créer des sorties de données visuelles avec des signaux bien ciblés au centre des tracés. Les fichiers de lit des pics appelés d’origine sont conservés pour effectuer l’annotation des pics et l’analyse de pertinence fonctionnelle comme prochaines étapes après l’achèvement des étapes décrites dans ce protocole.

Bien que ce pipeline d’analyse CUT&RUN comprenne des étapes pour décrire l’installation des programmes requis, les débutants en bioinformatique peuvent rencontrer des difficultés lors de l’installation des outils d’analyse. Par conséquent, une page de problème Github associée a été créée pour fournir des descriptions plus détaillées, étape par étape, pour l’installation du programme et pour faciliter les communications afin de soutenir les utilisateurs lors de l’installation du programme dans leur propre système. Les prochaines étapes du pipeline d’analyse CUT&RUN au-delà du protocole décrit dans cet article comprennent l’annotation des pics, l’identification des chevauchements entre différents types de pics appelés et l’annotation fonctionnelle des pics appelés. L’achèvement des étapes de contrôle de la qualité et de l’appel de pic décrits dans ce protocole, combiné à l’annotation de pic en aval, permettra aux utilisateurs de tirer une signification biologique de leurs données CUT&RUN.

Ce pipeline d’analyse CUT&RUN a été conçu pour fournir des instructions générales d’introduction étape par étape pour l’analyse CUT&RUN en vrac. Ce pipeline présente certaines limites. Tout d’abord, bien que ce pipeline d’analyse tente de gérer l’effet de variation du contenu en GC en filtrant les lectures sur les régions de la liste noire (qui comprennent les « régions d’artefacts à signal élevé » et les « régions de répétition d’artefacts » et les régions de répétition TA), cette approche peut ne pas être suffisante pour certains organismes qui peuvent avoir un contenu GC distinctif sur leur génome. Par conséquent, si les utilisateurs sont préoccupés par les biais liés au contenu du GC, envisagez d’ajouter une autre étape pour corriger les lectures cartographiées. Pour les débutants en bioinformatique, 'computeGCBias' et 'correctGCBias' dans Deeptools peuvent être des options pour cet objectif. Deuxièmement, ce pipeline d’analyse gère à la fois les lectures d’insert de taille normale (100 pb-1 kb) et de petite taille d’insert (< 100 pb), qui peuvent être les lectures réelles de certaines protéines associées à la chromatine, dans le même fichier. Étant donné que ce pipeline d’analyse est écrit dans des scripts shell, les utilisateurs peuvent modifier « Script_08_bam-to-BEDPE-BED-bedGraph.sh » pour récupérer les lectures de taille d’insertion courtes séparément des lectures de taille de fragment normales lors de l’étape de génération du fichier de lit de lectures mappées. Par la suite, le fichier de lit de lectures de taille d’insert court peut être normalisé indépendamment des lectures mappées de taille d’insert standard afin de minimiser l’effet de réduction des effectifs. Troisièmement, pour réduire la complexité du pipeline d’analyse, Easy Shells CUTnRUN n’inclut pas d’étape de sous-échantillonnage pour correspondre à la profondeur de séquençage des échantillons CUT&RUN. Toutefois, les utilisateurs peuvent appliquer une étape de sous-échantillonnage après avoir filtré les fichiers bam à l’aide de samtools view²⁸ ou PositionBasedDownsampleSam (Picard)²⁹.

Toutes les étapes d’analyse de ce protocole sont écrites en scripts shell pour permettre aux débutants en bioinformatique d’apprendre les bases de l’analyse CUT&RUN en révisant les scripts. Nous nous attendons à ce que les utilisateurs puissent pratiquer l’analyse bio-informatique étape par étape en exécutant chaque script shell séquentiellement dans le terminal. De plus, la simplicité des scripts shell fournis dans ce pipeline d’analyse CUT&RUN permet aux utilisateurs de réviser et de personnaliser ces scripts pour appliquer ce pipeline d’analyse à leurs propres données CUT&RUN. En fin de compte, nous nous attendons à ce que ce pipeline d’analyse CUT&RUN puisse réduire les goulets d’étranglement courants dans le processus d’analyse des données CUT&RUN afin de permettre aux chercheurs en laboratoire humide et aux débutants en bioinformatique de tirer des conclusions biologiques à partir de leurs propres données de séquençage CUT&RUN.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucune divulgation.

Remerciements

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Toutes les figurines illustrées ont été créées avec BioRender.com. Le CAI reconnaît le soutien fourni par le biais d’une bourse de chercheur en début de carrière de l’Alliance de recherche sur le cancer de l’ovaire, d’une subvention d’accélération de la Fondation Forbeck et du prix national de recherche sur la détection précoce de l’Alliance du cancer de l’ovaire du Minnestoa.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Logiciel pour compresser et convertir les readcounts bedGraph en bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ l’Université de l’Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Logiciel pour traiter les fichiers bam/bed/bedGraph
bowtie2 2.5.4	Université	Johns Hopkinshttps://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Logiciel pour construire l’indice de nœud papillon et effectuer l’alignement
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Logiciel pour effectuer l’analyse de la distribution de la taille des inserts
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Logiciel pour effectuer le découpage de l’adaptateur
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Logiciel pour effectuer l’analyse de corrélation du coefficient de Pearson, l’analyse en composantes principales et l’analyse de la carte thermique/du tracé moyen
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Logiciel pour vérifier la qualité du fichier fastq
Intervenezv0.6.1	Biologie computationnelle & Régulation des gènes - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Logiciel pour effectuer l’analyse du diagramme de Venn à l’aide de fichiers de pics
MACSv2.2.9.1	Initiative de Chan Zuckerberg	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Logiciel pour appeler les pics
MACSv3.0.2	Initiative de Chan Zuckerberg	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Logiciel pour appeler les pics
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Logiciel pour traiter les fichiers sam/bam
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Logiciel pour appeler les pics
SRA Toolkit Version 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Logiciel pour télécharger SRR à partir de GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Logiciel pour effectuer un parage de qualité et d’aptitude

Références

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Mots-clés

CUT RUN interactions prot ine ADN occupation de la chromatine validation des donn es de s quen age appel de pics peak calling cartographie Bowtie annotation des pics analyse en composantes principales graphique de corr lation profilage pig n tique

Analyse introductive et validation des données de séquençage CUT&RUN

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