Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Procédé d’étude du métabolisme dans des cellules lymphoïdes à l’aide de la chimie pour mesurer l’incorporation de la puromycine par cytométrie en flux

978 vues

⸱

DOI :

10.3791/67377

⸱

15 août 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Le protocole montre une méthode basée sur la cytométrie en flux utilisant la chimie pour étudier le métabolisme énergétique dans les cellules.

Résumé

Lors de la stimulation de l’antigène, les lymphocytes T naïfs subissent une prolifération et une expansion rapides jusqu’aux lymphocytes T effecteurs. Le métabolisme joue un rôle important dans la génération de la biomasse nécessaire à la prolifération rapide de ces cellules et à la génération de molécules nécessaires à la différenciation et à la fonction des lymphocytes T effecteurs, qui influencent le résultat de la réponse immunitaire adaptative dans les infections ou les cancers. Les lymphocytes T naïfs reprogramment leur métabolisme lors d’une stimulation antigénique pour augmenter la génération d’ATP, qui est nécessaire pour soutenir leur croissance, leur biosynthèse et leurs fonctions effectrices. L’ATP peut être généré dans une cellule soit par la voie de phosphorylation mitochondriale-oxydative (OXPHOS), soit par la voie glycolytique. Étant donné que la majeure partie de l’ATP générée dans une cellule en division et en croissance est utilisée pour la synthèse des protéines, la synthèse des protéines a été utilisée comme substitut des niveaux d’ATP. La synthèse des protéines peut être mesurée par l’incorporation de puromycine, qui imite l’adénosine 3' d’un ARNt chargé d’une tyrosine modifiée et conduit à la terminaison spontanée de la traduction des protéines. Des inhibiteurs métaboliques tels que le 2-désoxyglucose (2DG), qui bloque la voie glycolytique, et l’oligomycine (O), qui bloque le complexe 5 de la chaîne de transport d’électrons (ETC), peuvent être utilisés pour étudier les dépendances de la génération d’ATP cellulaire sur ces deux voies en conjonction avec l’évaluation de la synthèse des protéines dans une méthode appelée SCENITH. Nous décrivons ici une variante de cette méthode qui détecte l’incorporation de puromycine par cytométrie en flux par chimie. Cette méthode d’étude du métabolisme est relativement simple et peut être utilisée pour évaluer des populations de cellules rares, ainsi que des échantillons de patients, par cytométrie en flux.

Introduction

Au cours des dernières années, on a constaté une prise de conscience croissante du rôle important du métabolisme dans la régulation des lymphocytes T. Le métabolisme cellulaire régule de nombreuses fonctions critiques dans les lymphocytes, y compris l’expansion clonale des lymphocytes T spécifiques aux agents pathogènes et leur différenciation en sous-ensembles de cellules effectrices, qui synthétisent une variété de molécules effectrices, y compris les cytokines inflammatoires et les granzymes cytolytiques nécessaires pour tuer les agents pathogènes1. L’étude du métabolisme des lymphocytes T est donc importante à la fois pour évaluer le fonctionnement normal des lymphocytes T et pour le développement de thérapies potentielles.

Les lymphocytes T naïfs sont métaboliquement quiescents et dépendent du métabolisme catabolique et de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour leurs besoins énergétiques 1,2. Lors de l’activation du récepteur des lymphocytes T (TCR), les lymphocytes T subissent une reprogrammation métabolique rapide en partie due à la régulation positive des transporteurs de nutriments à la surface des cellules, ce qui augmente l’absorption du glucose et de plusieurs acides aminés, y compris la glutamine, de l’environnement. Ces éléments nutritifs sont ensuite utilisés dans les voies anaboliques pour fabriquer des macromolécules qui contribuent à la croissance cellulaire et soutiennent les demandes énergétiques accrues associées à l’augmentation de la croissance cellulaire et de la division 1,2,3. La reprogrammation métabolique dans les lymphocytes T activés rend les cellules plus dépendantes de la glycolyse aérobie et de la glutaminolyse pour leurs besoins énergétiques 1,2,3. Lors de la stimulation TCR, l’absorption des nutriments joue également un rôle essentiel dans l’activation des voies moléculaires en aval3. Par exemple, l’absorption d’acides aminés et l’augmentation de la concentration locale d’acides aminés activent la signalisation mTORC14. À l’inverse, la réduction de la disponibilité des acides aminés intracellulaires diminue la voie de signalisation mTORC1 2,3,5,6,7. Ainsi, le métabolisme et la fonction cellulaire sont étroitement liés dans une cellule T effectrice.

La forte augmentation de la biomasse nécessaire à la division rapide des lymphocytes T nécessite la régulation positive de la synthèse/traduction des protéines8. La synthèse des protéines peut être quantifiée dans une cellule en étudiant l’incorporation de la puromycine9, un mimique de l’ARNt tyrosyle qui bloque la traduction en incorporant, marquant et libérant des chaînes polypeptidiques allongées à partir des ribosomes9 en translation. La traduction des protéines est un processus fortement dépendant de l’énergie. en effet, la majeure partie de l’ATP généré dans les cellules en division et en croissance est utilisée pour la synthèse des protéines. Ainsi, la synthèse des protéines a été utilisée comme mesure de substitution pour l’ATP10 cellulaire. Pour générer de l’ATP, les cellules s’appuient généralement sur la glycolyse et/ou la voie mitochondriale OXPHOS11. La glycolyse génère deux molécules d’ATP par molécule de glucose. La voie OXPHOS génère 36 ATP par glucose12,13, mais la glycolyse peut générer de l’ATP14 plus rapidement. Ainsi, les lymphocytes T activés qui se divisent rapidement, comme les cellules cancéreuses, dépendent fortement de la voie glycolytique pour la génération d’ATP.

La dépendance d’une cellule à chaque voie métabolique peut être étudiée par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. L’inhibiteur de la voie glycolytique 2-désoxyglucose (2-DG), qui est un analogue du glucose, agit comme un inhibiteur compétitif de l’enzyme glycolytique hexokinase15. La 2-DG est phosphorylée en 2DG-phosphate (2DG-P) par l’hexokinase. La 2DG-P ne peut pas être métabolisée par la phosphohexose isomérase, qui convertit normalement le glucose-6-phosphate (G-6-P) en fructose-6-phosphate16. La 2DG-P est donc piégée et s’accumule dans les cellules, entraînant l’inhibition de la glycolyse et l’épuisement de l’ATP cellulaire, bloquant ainsi la synthèse des protéines17. De la même manière, la dépendance des cellules à l’égard de la voie mitochondriale OXPHOS peut être étudiée à l’aide de l’oligomycine, qui se lie au canal proton de l’ATP synthase de la chaîne de transport d’électrons (ETC)18, bloquant ainsi la synthèse mitochondriale de l’ATP (Figure 1). L’utilisation de ces inhibiteurs en conjonction avec une évaluation de la synthèse des protéines peut fournir une image de l’état métabolique des cellules et a été utilisée dans une puissante méthode unicellulaire connue sous le nom de SCENITH qui évalue l’incorporation de la puromycine à l’aide de la cytométrie en flux10. Cependant, la disponibilité des réactifs SCENITH peut être limitante. D’autres techniques couramment utilisées pour évaluer la glycolyse et l’OXPHOS comprennent les analyses de flux extracellulaires Seahorse, qui nécessitent un plus grand nombre de cellules, ce qui peut ne pas être réalisable expérimentalement. Dans cet article, nous décrivons une méthode alternative pour évaluer l’incorporation de la puromycine à l’aide d’un réactif chimique Click-it disponible dans le commerce. La facilité de cette méthode permet une évaluation rapide de l’état métabolique des lymphocytes, y compris des populations de cellules rares et des échantillons de patients.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

L’élevage et les expériences ont été effectués conformément au protocole approuvé G98-3 par le Comité d’utilisation et de soins aux animaux de l’Institut national de recherche sur le génome humain, NIH, et au protocole approuvé LISB 22E par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, NIH. Des souris C57Bl/6J mâles âgées de 6 à 12 semaines, élevées et hébergées dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS), ont été utilisées pour la présente étude. Des résultats similaires ont été obtenus avec des souris femelles. Le sang total humain a été obtenu de la banque de sang des NIH selon le protocole 99-CC-0168 approuvé par l’IRB du NIH Clinical Center, Collecte et distribution de composants sanguins provenant de donneurs sains pour une utilisation dans la recherche in vitro. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les sujets, conformément à la Déclaration d’Helsinki.

1. Isolement et culture de lymphocytes T CD4+ naïfs de souris

  1. Purifier les lymphocytes T CD4+ naïfs par sélection négative à partir de suspensions unicellulaires groupées de rate ou de ganglions lymphatiques de souris mâles âgées de 6 à 12 semaines à l’aide d’un système de séparation cellulaire magnétique selon le protocole du fabricant.
  2. Cellules de culture (comme décrit ci-dessous) dans un milieu IMDM contenant du dipeptide de L-alanyl-L-glutamine et complétées par 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 U/mL de pénicilline, 100 U/mL de streptomycine et 0,05 mM de 2-β-mercaptoéthanol.
  3. Co-culture de lymphocytes T CD4 naïfs dans un rapport de 1:8 avec des splénocytes T appauvris en mitomycine C (décrits ci-dessous) sous forme de CPA dans des plaques de 48 puits sous des conditions non polarisées (1 μg/mL d’anti-CD3 [clone 2C11] et 3 μg/mL d’anti-CD28 [clone 37.51]) et Th0 (1 μg/mL d’anti-CD3, 3 μg/mL d’anti-CD28, 10 μg/mL d’anti-IFNg [clone XMG1.2], anti-IL-12 [clone C17.8] et anti-IL-4 [clone 11B11]) pendant 72 h à 37 °C. Mettre en place des cultures à l’aide de 1 x 106 APC et de 0,13 x 106 lymphocytes T CD4 naïfs par puits d’une plaque de 48 puits (Table des matériaux)
  4. Génération de splénocytes T appauvris en T traités à la mitomycine C en tant qu’APC : En bref, colorer une suspension unicellulaire de rate de souris avec des anticorps CD4 et CD8 conjugués à la FITC. Par la suite, étiquetez magnétiquement les cellules avec des microbilles anti-FITC (voir tableau des matériaux). Ensuite, à l’aide d’un système de séparation magnétique des cellules selon le protocole du fabricant, sélectionnez négativement les APC des cellules T. Ensuite, traitez les APC avec 50 μg/mL de mitomycine C pendant 40 min dans un incubateur à 37 °C, puis lavez-les 3 fois avec 1 PBS.

2. Isolement et culture des PBMC humains

  1. Isolez les PBMC du sang total à l’aide d’un milieu de séparation des lymphocytes et conformément au protocole du fabricant (voir la table des matières).
  2. Culture de PBMC dans un milieu RPMI complété par 2 mM de L-glutamine, 0,01 M HEPES, 1 mM de pyruvate de sodium, 1 % d’acides aminés non essentiels, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine, 0,05 mM de 2-β-mercaptoéthanol et 5 % de sérum humain.
  3. Cultiver 1 x 106 PBMC par puits d’une plaque à fond en U de 96 puits avec 5 μg/mL de phytohémagglutinine-L (PHA-L) pendant 18 à 24 h à 37 °C.

3. Dosage métabolique

REMARQUE : Il est important de maintenir toutes les cellules, les inhibiteurs [oligomycine (O), 2-désoxyglucose (2-DG), DMSO (Co)] et le réactif O-propargyl-puromycine (OPP) aussi près que possible de 37 °C. Disposez les cellules, les inhibiteurs et le réactif OPP sur des plaques à fond en U 96 et laissez les plaques dans un incubateur à 37 °C autant que possible. Les inhibiteurs de l’aliquote 2-DG et O en plus petits volumes pour éviter les gels-dégels multiples.

  1. Préparez une solution mère 2 M (20x) de 2-DG et une solution mère 40 μM (40x) de O. Pour l’OPP, diluez 1 μL d’OPP dans 49 μL de milieu de sorte que la concentration soit de 400 μM - ce sera la solution mère 20x.
  2. Assurez-vous que tous les autres composants du kit de synthèse de protéines OPP (voir la table des matériaux) sont à température ambiante (RT) avant de commencer l’expérience.
  3. Préparez 1 tampon de réaction OPP en diluant une aliquote de la bouteille du composant C 1:10 avec de l’eau désionisée. Après utilisation, conservez toute solution 1x restante à une température de 2 à 8 °C.
  4. Ensemencer 0,1-2 x 106 cellules par puits de plaque à fond rond de 96 puits pour chaque condition (Co / DG / O / DGO) dans 100 μL d’IMDM complet (pour les lymphocytes T CD4 de souris) ou de RPMI complet (pour les PBMC humains) ou tout milieu complet de votre choix. Gardez l’assiette dans l’incubateur autant que possible.
  5. Ajouter 1x inhibiteurs à partir de solutions mères (5 μL de 20x DG, Co), (2,5 μL de 40x O) et incuber pendant 15 min à 37 °C, 5 % CO2. Les concentrations finales sur les cellules sont de 100 mM DG et 1 μM O. Mélangez soigneusement les inhibiteurs avec les cellules à l’aide d’une pipette. Pour plus de facilité, aliquote les inhibiteurs dans une plaque de 96 puits et ajoutez des cellules aux inhibiteurs et mélangez bien en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
  6. Dans l’échantillon DOG, ajoutez 1x de DG (5 μL), mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette et laissez incuber pendant 10 min à 37 °C, 5 % CO2. Ensuite, ajoutez 1x O (2,5 μL), pipetez plusieurs fois et incubez pendant 5 min à 37 °C, 5 % CO2.
  7. Sans laver les inhibiteurs, ajouter 5 μL d’OPP de la solution mère 20x (400 μM) à chaque échantillon de sorte que la concentration soit de 20 μM dans les cellules, pipeter de haut en bas plusieurs fois, et incuber 30 min à 37 °C, 5 % de CO2. Pour plus de facilité, aliquote l’OPP sur une plaque à 96 puits, ajoutez des cellules avec des inhibiteurs au réactif OPP et mélangez bien.
    REMARQUE : Pour les cellules moins métaboliquement actives et les cellules isolées directement ex vivo, augmenter le temps d’incubation après l’ajout d’OPP. Le temps d’incubation avec l’OPP doit être normalisé pour chaque type de cellule.
  8. Après l’incubation avec OPP, ajouter 100-150 μL de tampon FACS glacé (2 % FBS et 1 mM EDTA dans 1x PBS). Centrifugeuse à 750 x g pendant 2 min à 4°C. Jetez le surnageant et répétez l’étape de lavage.
  9. Cellules tachatives avec marqueurs de surface appropriés, anticorps anti-CD4 de souris (utilisé à une dilution de 1/200) ou anticorps anti-CD4 humain (utilisé à une dilution de 1/50), réactif vivant/mort (utilisé à une dilution de 1/600), en présence de bloc Fc (utilisé à une dilution de 1/200). Incuber pendant 25-30 min à 4 °C dans l’obscurité.
  10. Laver la plaque avec 150-200 μL de tampon FACS et centrifuger à 750 x g pendant 2 min à 4 °C. Retournez doucement la plaque pour jeter le surnageant, puis répétez l’étape de lavage. À ce stade, les cellules sont colorées à la surface.
  11. Remettre les cellules en suspension dans 1 % de PFA dans du PBS, bien mélanger et incuber pendant 10 à 15 min à 4 °C. Protéger de la lumière.
  12. Laver avec un tampon FACS et centrifuger à 750 x g pendant 2 min à 4 °C, puis répéter le lavage.
  13. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de perméabilisation de saponine froid (0,1 % (poids/vol) de saponine + 3 % de FBS dans 1 PBS). Incuber à RT, à l’abri de la lumière pendant 5 à 15 min. Les cellules sont fixes et perméabilisées à ce moment.
  14. Préparez 1 additif de tampon de réaction OPP (composant E) en diluant la solution 10 fois 1:10 dans de l’eau désionisée. Préparez cette solution fraîche et utilisez-la le même jour.
  15. Préparez le cocktail de réaction OPP conformément au tableau 1. Utilisez le cocktail réactionnel dans les 15 minutes suivant la préparation.
  16. Centrifuger les échantillons de l’étape 3.13 à 750 x g pendant 2 min. Jetez le surnageant. Lavez les cellules 2x avec 200 μL de 1x tampon de perméabilisation de saponine. Faites tourner et jetez le surnageant.
  17. Ajouter 50 à 100 μL de cocktail réactionnel OPP (préparé à l’étape 3.12) dans chaque puits et bien mélanger. Incuber pendant 30 min à RT, à l’abri de la lumière. Ensuite, faites tourner les plaques à 750 x g ou 2 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  18. Remettre la pastille en suspension dans 200 μL de 1x tampon de perméabilisation de saponine et centrifuger des échantillons à 750 x g pendant 2 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  19. Remettre en suspension dans 50 μL de tampon de rinçage réactif (composant F) par puits et centrifuger à 750 x g pendant 2 min à 4 °C. Remettre en suspension les cellules colorées dans 200 μL de tampon FACS.
  20. Analysez les échantillons par cytométrie en flux (voir figure supplémentaire 1) le même jour, ou stockez les cellules dans l’obscurité à 4 °C et analysez-les le lendemain.

4. Analyse du dosage métabolique

  1. Mesurer l’incorporation de la puromycine (OPP) comme substitut de la synthèse des protéines dans les conditions suivantes : 1) condition de contrôle (Co) ; 2) dans les cellules où la voie glycolytique est bloquée par la 2-DG ; 3) dans les cellules où la voie mitochondriale OXPHOS est bloquée par O ; et 4) dans les cellules où les voies glycolytique et mitochondriale sont bloquées par des inhibiteurs (DGO), en évaluant l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) de l’OPP (Figure 2).
  2. Analysez la dépendance des cellules vis-à-vis d’une voie particulière en examinant l’IMF de l’OPP dans chaque condition. Évaluer directement l’IFM en tant que mesure de la synthèse des protéines. Calculez la dépendance au glucose, la capacité glycolytique, la capacité d’oxydation des acides gras (FAO) et d’oxydation des acides aminés (AAO), ainsi que la dépendance mitochondriale selon10.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Des lymphocytes T CD4+ naïfs ont été isolés de la rate et des ganglions lymphatiques de souris et différenciés en lignées Th0 ou non polarisées (NP) pendant 72 h. Les cellules ont été récoltées après 0 h, 48 h et 72 h de culture, et l’incorporation de l’OPP a été mesurée en examinant l’IMF de l’OPP. Les lymphocytes T CD4+ naïfs étaient moins synthétiques que les lymphocytes T activés, comme le montre l’IMF de l’OPP (Figure 3). Les cellules naïves étaient partiellement d...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Cet article propose une méthode pour étudier le métabolisme dans les cellules lymphoïdes par cytométrie en flux, basée sur la technologie SCENITH, mais en utilisant le marquage chimique de la puromycine incorporée. Bien que nous nous soyons concentrés sur les lymphocytes, ce protocole peut être ajusté pour étudier le métabolisme dans n’importe quel type de cellule. Cette méthode est également avantageuse pour étudier le métabolisme dans de rares populations de cellules et d’échantillons ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Qin Xu et le Dr Avik Dutta d’avoir fourni des échantillons PBMC et de précieuses suggestions expérimentales. Cette recherche a été financée en partie par la Division de la recherche intra-muros du NIAID, NIH.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MercaptoethanolThermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 anti-Puromycine AnticorpsBiolegend381506Dilution utilisée : 1/100
Alexa Fluor 647 Anti-human CD4 AntibodyBiolegend357422Dilution utilisée :  ; 1/50
BD Horizon BUV737 Rat Anti-Souris CD4BD Biosciences612761Dilution utilisée :  ; 1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 Kit de dosage de synthèse des protéinesThermo FisherC10456
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
Sérum HumainMillipore SigmaH4522
IMDM, Supplément GlutaMAX, 500 mlThermo Fisher31980030
InVivoMAb anti-souris CD28, Clone :  ; 37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb anti-souris CD3&epsilon ;, Clone :  ; 145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb anti-souris IFN&gamma ;, Clone :  ; XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb anti-souris IL-12 p40, Clone :  ; C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb anti-souris IL-4, Clone :  ; 11B11BioXcellBE0045
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher25030081
LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes Aqua fixable, pour excitation 405 nmThermo FisherL34966Dilution utilisée :  ; 1/600
LSM Milieu de séparation des lymphocytesMP Biomedicals50494X
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)Thermo Fisher11140050
Mitomycine C de Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
Naive CD4 Kit d’isolement, sourisMiltenyi Biotec130-104-453
Paraformaldéhyde 16 % Solution aqueuse Microscopie électronique deSciences 15710
PBS (1X), pH 7,4, 500 mLProduits biologiques de qualité114-058-101
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL). 100 mLThermo Fisher15140122
Phytohémagglutinine-L (PHA-L)Millipore Sigma11249738001
Sérum de veau fœtal de qualité supérieure (FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 Moyen, sans glutamineThermo Fisher21870076
SaponinThermo FisherA18820.22
Pyruvate de sodium (100 mM)Thermo Fisher11360070
qualité EM

Références

  1. Saravia, J., Raynor, J. L., Chapman, N. M., Lim, S. A., Chi, H. Signaling networks in immunometabolism. Cell Res. 30, 328-342 (2020).
  2. Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 20, 55-70 (2020).
  3. Raynor, J. L., Chi, H. Nutrients: Signal 4 in T cell immunity. J Exp Med. (221), e20221839(2024).
  4. Shimobayashi, M., Hall, M. N. Multiple amino acid sensing inputs to mTORC1. Cell Res. 26, 7-20 (2016).
  5. Huang, H., et al. In vivo CRISPR screening reveals nutrient signaling processes underpinning CD8(+) T cell fate decisions. Cell. 184, 1245-1261.e21 (2021).
  6. Pollizzi, K. N., et al. Asymmetric inheritance of mTORC1 kinase activity during division dictates CD8(+) T cell differentiation. Nat Immunol. 17, 704-711 (2016).
  7. Verbist, K. C., et al. Metabolic maintenance of cell asymmetry following division in activated T lymphocytes. Nature. 532, 389-393 (2016).
  8. Marchingo, J. M., Cantrell, D. A. Protein synthesis, degradation, and energy metabolism in T cell immunity. Cell Mol Immunol. 19, 303-315 (2022).
  9. Enam, S. U., et al. Puromycin reactivity does not accurately localize translation at the subcellular level. Elife. 9, e60303(2020).
  10. Argüello, R. J., et al. SCENITH: A Flow Cytometry-Based Method to Functionally Profile Energy Metabolism with Single-Cell Resolution. Cell Metab. 32, 1063-1075.e7 (2020).
  11. Dunn, J., Grider, M. H. Physiology, Adenosine Triphosphate. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  12. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9, 18699(2019).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  14. Pfeiffer, T., Schuster, S., Bonhoeffer, S. Cooperation and competition in the evolution of ATP-producing pathways. Science. 292, 504-507 (2001).
  15. Brown, J. Effects of 2-deoxyglucose on carbohydrate metabolism: review of the literature and studies in the rat. Metabolism. 11, 1098-1112 (1962).
  16. Weindruch, R., et al. Caloric restriction mimetics: metabolic interventions. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 56 Spec No1, 20-33 (2001).
  17. Gronostajski, R. M., Pardee, A. B., Goldberg, A. L. The ATP dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts. J Biol Chem. 260, 3344-3349 (1985).
  18. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicol In Vitro. 67, 104907(2020).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

M tabolisme des cellules lympho desProlif ration des lymphocytes TSynth se prot iqueReprogrammation m taboliqueVoie glycolytiquePhosphorylation oxydativeInhibiteurs m taboliquesM thode SCENITH
Vidéo bientôt disponible
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.