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Méthodologie d’imagerie par spectroscopie optique corrélative et spectrométrie de masse pour visualiser la distribution du médicament dans une coupe de tissu mou

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DOI :

10.3791/67383

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20 juin 2025

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1Chemical & Biological Sciences Department, National Physical Laboratory, 2Department of Life Sciences, University of Bath, 3Haleon CH SARL, 4School of Chemistry & Chemical Engineering, University of Surrey

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente une méthode d’imagerie corrélative des médicaments dans les tissus mous à l’aide de la spectroscopie optique non linéaire et de l’imagerie par spectrométrie de masse. La combinaison de l’imagerie cutanée à haute résolution et de la détection sensible des médicaments offre une approche précieuse pour étudier la distribution des médicaments dans la peau, ce qui est essentiel pour le développement de produits topiques de qualité supérieure.

Résumé

Une nouvelle méthodologie d’imagerie corrélative combinant une résolution spatiale submicronique avec une détection sensible des médicaments par spectroscopie optique et imagerie par spectrométrie de masse a été développée pour visualiser la distribution chimique lors de l’application du médicament dans les tissus mous. Dans cet exemple, la méthode a été testée sur du tissu cutané excisé après l’application topique in vitro d’un médicament anti-inflammatoire non stéroïdien commercial pendant 16 heures. Des méthodes spectroscopiques optiques non destructives, notamment la diffusion Raman stimulée, la génération de secondes harmoniques et la microscopie à fluorescence à deux photons, ont d’abord été utilisées pour cartographier la structure et la morphologie de la peau. Par la suite, les mêmes échantillons de tissus cutanés ont été analysés par spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol (ToF-SIMS), ce qui a permis d’améliorer la sensibilité pour la détection du diclofénac dans les couches les plus externes de la peau - épiderme et derme. Des méthodes de recalage d’images ont été conçues pour intégrer les données optiques et de spectrométrie de masse. Cette approche combine une visualisation haute résolution sans marquage de la structure tissulaire avec une détection chimique sensible, et représente un outil précieux pour étudier la distribution des médicaments dans la peau et, potentiellement, dans d’autres tissus biologiques mous.

Introduction

Il est essentiel de comprendre le taux, l’étendue et les facteurs de la distribution des ingrédients pharmaceutiques actifs dans les tissus biologiques mous après leur application topique ou systémique pour élucider les mécanismes sous-jacents à l’absorption, au métabolisme et à la clairance des médicaments spécifiques aux tissus (c’est-à-dire une compréhension plus approfondie de la pharmacocinétique des médicaments). Ici, nous présentons une nouvelle méthode d’imagerie corrélative intégrant des spectroscopies optiques non linéaires et une imagerie par spectroscopie de masse pour une visualisation sans marquage de la structure tissulaire et de la distribution des médicaments topiques dans le même échantillon de tissu1.

La spectroscopie Raman (RS) est apparue comme un outil précieux pour cartographier la distribution des médicaments dans les cellules et les tissus avec une résolution spatiale et une spécificité moléculaire élevées2. La RS repose sur la diffusion inélastique de la lumière3 par un échantillon d’intérêt, ce qui permet une caractérisation chimique détaillée via les modes vibratoires caractéristiques des molécules qu’elle contient, sans avoir besoin de marqueurs externes. Cependant, les longs délais d’acquisition pour produire des images à haute résolution peuvent potentiellement compromettre l’intégrité des échantillons biologiques sensibles. De plus, lors de l’exploration des couches tissulaires plus profondes, la diffusion et l’absorption de la lumière par le tissu peuvent atténuer le signal Raman, limitant ainsi sa sensibilité. La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) représente une avancée significative par rapport à la RS conventionnelle, en exploitant l’excitation laser pulsée et la détection du signal Raman stimulé4. La microscopie SRS permet l’acquisition rapide d’images 2D et 3D avec une résolution spatiale élevée et, lorsqu’elle est réalisée en tandem avec la microscopie à génération de seconde harmonique (SHG) et la microscopie à fluorescence excitée par deux photons (TPEF), peut fournir une image complète des tissus conjonctifs, du collagène et de l’élastine 1,5,6,7,8,9 . La microscopie SHG est une technique optique non linéaire qui repose sur l’interaction de la lumière avec des structures non centrosymétriques dans un échantillon, générant un signal à la moitié de la longueur d’onde de la lumière incidente. Il est particulièrement utile pour l’imagerie de structures ordonnées comme le collagène dans les tissus biologiques. TPEF est une autre technique de microscopie non linéaire où deux photons de plus faible énergie excitent simultanément un fluorophore, ce qui lui fait émettre une fluorescence. Le TPEF permet l’imagerie des tissus profonds avec moins de photodommages, car la lumière d’excitation se situe dans le proche infrarouge, ce qui pénètre plus profondément dans les échantillons biologiques.

L’imagerie par spectrométrie de masse (MSI) est une technique analytique puissante qui combine les capacités de la spectrométrie de masse avec des informations spatiales, permettant l’identification sans marquage d’un large éventail de molécules 10,11,12. La spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol (ToF-SIMS) fonctionne en bombardant la surface de l’échantillon avec des ions primaires de haute énergie, provoquant l’éjection d’ions secondaires de la surface. Ces ions secondaires sont ensuite accélérés vers un analyseur de temps de vol, où leurs rapports masse/charge sont déterminés. Cette analyse permet d’identifier des fragments moléculaires et des variations isotopiques avec une sensibilité et une résolution élevées. Des applications précieuses de ToF-SIMS ont été démontrées dans la recherche biologique et pharmaceutique pour l’étude des produits chimiques et des biomolécules dans les cellules13, les tissus14,15 et les organes15.

La SRS et la ToF-SIMS ont été utilisées indépendamment pour étudier la distribution des médicaments dans différents modèles de peau. Cependant, il est très intéressant d’utiliser ces techniques en combinaison pour bénéficier de leur complémentarité. Dans cette étude, nous décrivons un flux de travail permettant de combiner les microscopies optiques (SRS, TPEF et SHG) avec ToF-SIMS pour obtenir des images de la morphologie de la peau avec une résolution spatiale submicronique (fournie par les méthodes optiques) superposées au signal du médicament détecté avec une sensibilité supérieure (fournie par le ToF-SIMS). L’approche a été utilisée pour répondre à l’exemple difficile de la visualisation de la distribution du diclofénac dans les tissus cutanés excisés traités avec une formulation topique commerciale (gel Voltaren). Les critères de succès comprenaient une sensibilité chimique élevée pour détecter le diclofénac à sa concentration thérapeutique et une résolution spatiale suffisante pour résoudre la structure de la peau. Bien que la teneur en diclofénac dans différentes couches de la peau puisse être quantifiée après un traitement topique par des méthodes laborieuses et techniquement exigeantes telles que le décapage de bande suivi d’une quantification16, ou par microperfusion à flux ouvert17, ces approches ne peuvent pas élucider la partition, la pénétration, la rétention et la distribution en profondeur du diclofénac dépendant de l’excipient dans les couches individuelles de la peau, qui sont des facteurs essentiels aidant la phase de développement du produit.

Avant la méthodologie de mesure décrite ci-dessous, le gel Voltaren Forte (contenant 2,32 % de diclofénac diéthylammonium) ou un gel placebo correspondant (fourni par Haleon CH SARL) a été appliqué à la surface de la peau pendant différentes périodes (4, 12, 16 ou 24 h). Après l’élimination de toute formulation résiduelle, des mesures SRS et ToF-SIMS sur les mêmes échantillons de peau ont été effectuées ; Tous les détails de la méthodologie sont décrits dans le manuscrit original1.

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Protocole

Énoncé éthique : Des échantillons de peau humaine ont été obtenus auprès de Tissue Solutions Ltd, Glasgow, Royaume-Uni, par Charles River Laboratories (CRL) à Édimbourg, Royaume-Uni. Tous les échantillons anonymes ont été acquis conformément aux normes juridiques et éthiques du pays de collecte, avec l’approbation éthique et le consentement éclairé des donneurs ou de leurs parents les plus proches.

1. Section de la peau

Un cryostat a été utilisé pour produire des coupes des tissus cutanés.

  1. Sortez les disques de peau traités du congélateur à -20 °C et coupez un petit morceau (~1,0 cm x 1,0 cm) au centre du disque.
  2. Montez l’échantillon sur le mandrin dans le cryostat au-dessus d’une gouttelette d’eau gelée. N’utilisez pas de composé à température de coupe optimale (OCT) ou d’autres supports d’enrobage.
  3. Réglez la température de la lame et de l’échantillon à - 20 °C et - 16 °C, respectivement.
  4. Section de 30 μm d’épaisseur sur une lamelle en verre (#1.5, Fisher Scientific).
  5. Effectuez immédiatement la SRS et le ToF-SIMS ou l’échantillon peut être emballé sous vide pour être stocké à -80 °C.
  6. Dessécher pendant 20 min avant utilisation.

2. Imagerie SRS

La microscopie SRS, SHG et TPEF a été réalisée à l’aide d’un microscope Raman cohérent. Deux impulsions laser picosecondes ont été générées par un faisceau Stokes de 1031,2 nm, chevauchant spatialement et temporellement un faisceau de pompe accordable. Le faisceau de Stokes, modulé à 20 MHz, a facilité la détection des signaux de perte Raman stimulés par transmission. Un détecteur à base de silicium, couplé à un amplificateur de verrouillage, a été utilisé pour la détection du signal. Un autre canal a été utilisé pour collecter les signaux de seconde harmonique et de fluorescence émis, en utilisant un tube photomultiplicateur pour la détection.

  1. Installez des objectifs et des condenseurs appropriés pour l’imagerie tissulaire multiphotonique, dans ce cas, une lentille de grossissement 40x par immersion dans l’eau (1,1 NA) en conjonction avec une lentille de condenseur d’air à courte distance de travail (0,9 NA).
  2. Placez la section de tissu montée sur la platine d’échantillon du microscope SRS de sorte que le tissu se trouve sur la même face de la lame de microscope que la lentille du condenseur. Focalisez la lentille de l’objectif sur la section du tissu, puis optimisez la hauteur du condenseur.
  3. Réglez la puissance du laser sur des valeurs appropriées pour obtenir un bon rapport signal/bruit sans endommager les tissus. Dans cet exemple, environ 10 mW pour le faisceau de la pompe et 30 mW pour le faisceau de Stokes ont été appliqués à l’échantillon. Reportez-vous à Tsikritsis et al pour des considérations pratiques pour les mesures SRS4.
  4. Acquérez une image mosaïque de toute la section avec une résolution de 512 x 512 pixels correspondant à 290 μm x 290 μm au zoom X1 avec une vitesse d’imagerie de 400 Hz et une moyenne de ligne de 1 à 2850 cm-1 correspondant à l’étirement CH2 .
  5. Dans l’image en mosaïque de l’ensemble de la coupe, choisissez une région d’intérêt (ROI) avec les considérations suivantes : (i) elle est positionnée au centre, en évitant les 20 % les plus externes du périmètre de l’échantillon où il pourrait y avoir de la peau non dosée qui a été serrée dans l’appareil à cellules de Franz ; (ii) il est suffisamment plat pour être examiné à l’intérieur du même niveau de profondeur optique ; iii) il présente des caractéristiques structurelles distinctes qui faciliteraient son identification visuelle lorsque l’échantillon est transféré à ToF-SIMS.
  6. Appliquez des paramètres de gain cohérents dans l’ensemble de l’étude pour les détecteurs SRS et SHG/fluorescence, et acquérez des images dans (i) la région d’étirement C-H (à 2945 cm-1, 2850 cm-1 et 2650 cm-1 correspondant à CH3, CH2 et contrôle hors résonance, respectivement) ; (ii) la région de l’empreinte digitale (à 1666 cm-1 et 1723 cm-1 correspondant respectivement à l’amide I et au contrôle hors résonance) ; (iii) le numéro d’onde correspondant à la résonance activée et désactivée liée au médicament appliqué ; dans cet exemple, à 1586 cm-1 et 1530 cm-1 correspondant respectivement à C=C et à la contre-résonance.

Après l’imagerie SRS, transférez immédiatement l’échantillon vers la configuration ToF-SIMS pour analyse.

3. Imagerie ToF-SIMS

L’imagerie par spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol a été réalisée à l’aide d’un faisceau d’ions primaires Bi3+ de 30 keV avec un courant de 0,2 pA.

  1. Choisissez les paramètres d’acquisition appropriés ; Dans cet exemple, la polarité ionique négative a été utilisée, avec un temps de cycle de service de 100 ms, une plage de masse de m/z 0-900 et un diamètre de faisceau de 5 μm. Un canon à faisceau d’électrons de 20 eV à 5 μA a été utilisé pour la compensation de charge.
  2. Acquérez une image globale par le mode macro raster de la scène pour cartographier toute la section du tissu avec un champ de vision en fonction des dimensions du tissu (dans notre cas, nous avons utilisé 2,5 à 3,0 mm x 8,5 à 9,0 mm). Cette image globale est formée d’une mosaïque d’images plus petites. Dans cet exemple, chacun avait un champ de vision de 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 pixels) avec 1 faisceau d’ions par pixel, ce qui donnait une dose d’ions de 8,18 x 108 ions/cm2.
  3. Utiliser la même méthode pour capturer des images du retour sur investissement en sélectionnant un champ de vision approprié ; Dans ce cas, il s’agissait de 1,0 mm x 0,5 mm, avec 4 prises de vue par pixel par image et 10 images par patch, ce qui correspond à une dose d’ions de 1,31 x 1011 ions/cm2.
  4. Pour assurer le contrôle de la qualité, analysez les échantillons d’homogénat de tissus immédiatement avant et après l’examen de chaque section de peau. Utilisez un champ de vision de 0,5 mm x 0,5 mm (256 x 256 pixels) avec 1 prise de vue par pixel et 1 image par balayage, pour un total de 15 balayages. Cette configuration correspond à une densité de dose ionique de 3,27 x 1010 ions/cm2.
  5. Après l’acquisition, les spectres de masse résultants peuvent être étalonnés à l’aide d’ions H−, C−, C2− et C3−.
  6. L’acquisition et l’extraction des données ont été effectuées à l’aide du logiciel Surface Lab 7.1.

4. Recalage d’images et analyse de données à l’aide de MATLAB

  1. Réduisez les images SIMS et SRS à 3 dimensions chacune à l’aide d’une factorisation matricielle non négative pour être visualisées sous forme de canaux de couleur rouge, vert et bleu.
  2. Choisissez les caractéristiques correspondantes entre ces deux images de factorisation non matricielle en sélectionnant l’outil de sélection de points de contrôle Matlab « cpselect » (Matlab, Mathworks, 2019b et Image Processing Toolbox).
  3. Utilisez les fonctions « cp2tform » et « imtransform » pour effectuer l’enregistrement, en appliquant une transformation affine avec les données SIMS comme images fixes et les données de spectroscopie optique comme images animées.
  4. Lorsque plusieurs pics sont détectés dans les données ToF-SIMS pour le médicament d’intérêt, additionnez les intensités de ces pics pour créer une intensité ionique médicamenteuse combinée.
  5. Extrayez le nombre total moyen d’ions des deux ensembles de données d’homogénat (avant et après) pour chaque échantillon de tissu cutané correspondant. À l’aide de cette valeur correspondante, normalisez les intensités dans les données ToF-SIMS de l’ion médicament dans chaque image de peau.
  6. Après l’enregistrement, créez une superposition des données de spectroscopie optique et SIMS en attribuant les images respectives aux canaux RVB : rouge (image SRS pour CH2), vert (image SHG pour le collagène) et bleu (image SIMS pour le diclofénac, y compris les signaux de divers ions à m/z 214.04, 216.04, 250.02, 252.02, 294.01 et 296.01).

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Résultats

La figure 1 présente les résultats de l’alignement des images basé sur les caractéristiques, en affichant les images de superposition enregistrées de SRS, SHG et SIMS pour deux échantillons de peau, l’un traité avec un placebo (figure 1a) et l’autre avec du gel Voltaren pendant 4 heures (figure 1b) et 16 heures (figure 1c). Dans cette image, la somme du signal d’intensit...

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Discussion

Cette méthode permet une imagerie corrélative avec la spectroscopie optique non linéaire et l’imagerie par spectrométrie de masse pour détecter la distribution des médicaments dans les tissus mous avec une résolution spatiale inférieure au micron et une sensibilité élevée. Il est important de noter que l’imagerie est réalisée sans l’utilisation de marqueurs potentiellement interférents qui seraient nécessaires pour les microscopies à fluorescence. Une validation supplémentaire du flux de...

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Déclarations de divulgation

MBB est un employé de Haleon CH SARL, l’institution qui finance l’étude.

Remerciements

Cette étude a été financée par Haleon CH SARL. Les contributions de la NAB et du RHG ont été partiellement soutenues par la Food and Drug Administration (FDA) du département de la Santé et des Services sociaux (HHS) des États-Unis par le biais d’une subvention d’aide financière (1-U01-FD006533). Ce travail a été financé par le ministère britannique des Affaires, de l’Énergie et de la Stratégie industrielle par le biais des projets NMS/ID74 et NMS/ST18 du National Measurement System du Royaume-Uni. Le contenu de cet article est celui de leurs auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de la FDA/HHS ou du gouvernement américain, ni une approbation de leur part. La NAB est reconnaissante du soutien de la Communauté pour la science de la mesure analytique pour la bourse CAMS 2020 financée par le Fonds fiduciaire pour la chimie analytique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope Raman cohérent  ;Leica Microsystemshttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/
Échantillons de peau humainenbsp ;Tissue Solutions Ltd, Glasgow
Cryostat Leica CM 1850Leica Biosystemshttps://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/Discontinué
PicoEmerald-S système laserAPE Berlinhttps://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
ToF SIMS 5IONToF GmbHhttps://spectral.se/products/tof-sims-5

Références

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Mots-clés

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