Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives

Résumé

Ici, nous présentons la méthodologie permettant d’évaluer de manière concise les niveaux de marqueurs d’autophagosomes LC3-II dans les vésicules extracellulaires (VE) par immunoblottage. L’analyse des niveaux de LC3-II dans les VE, la formation d’autolysosomes et la formation d’omégasomes suggère le nouveau rôle de STX6 dans la libération de VE LC3-II positifs lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

Résumé

La (macro)autophagie représente une voie fondamentale de dégradation cellulaire. Dans ce processus, des vésicules à double membrane appelées autophagosomes engloutissent le contenu cytoplasmique, fusionnant ensuite avec les lysosomes pour la dégradation. Au-delà du rôle canonique, les gènes liés à l’autophagie modulent également une voie sécrétoire impliquant la libération de molécules inflammatoires, de facteurs de réparation tissulaire et de vésicules extracellulaires (VE). Notamment, le processus de dissémination de protéines pathologiques entre les cellules, en particulier dans les maladies neurodégénératives affectant le cerveau et la moelle épinière, souligne l’importance de comprendre ce phénomène. Des recherches récentes suggèrent que la protéine de liaison à l’ADN 43 kDa (TDP-43), un acteur clé de la sclérose latérale amyotrophique et de la dégénérescence lobaire frontotemporale, est libérée de manière dépendante de l’autophagie via les VE enrichies en protéines 1A/1B associées aux microtubules, marqueur de l’autophagosome, chaîne légère 3B-II (LC3-II), en particulier lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

Pour élucider le mécanisme sous-jacent à la formation et à la libération des VEs LC3-II-positives, il est impératif d’établir une méthode accessible et reproductible pour évaluer les vésicules LC3-II positives intracellulaires et extracellulaires. Cette étude présente un protocole détaillé pour évaluer les niveaux de LC3-II par immunoblot dans les fractions cellulaires et EV obtenues par centrifugation différentielle. La bafilomycine A1 (Baf), un inhibiteur de la fusion autophagosome-lysosome, sert de contrôle positif pour augmenter les niveaux de vésicules intracellulaires et extracellulaires LC3-II positives. Le gène de susceptibilité tumorale 101 (TSG101) est utilisé comme marqueur pour les corps multivésiculaires. En appliquant ce protocole, il est démontré que l’inhibition de la syntaxine-6 (STX6) par siRNA, un facteur de risque génétique de la maladie de Creutzfeldt-Jakob sporadique, augmente les niveaux de LC3-II dans la fraction EV des cellules traitées avec Baf sans montrer d’effet significatif sur les niveaux de TSG101. Ces résultats suggèrent que STX6 peut réguler négativement la libération extracellulaire de LC3-II via les VE, en particulier dans des conditions où la fusion autophagosome-lysosome est altérée. Combiné à des méthodes établies d’évaluation de l’autophagie, ce protocole fournit des informations précieuses sur le rôle de molécules spécifiques dans la formation et la libération de VE CL3-II positives.

Introduction

La protéine de liaison à l’ADN 43 (TDP-43) est une ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène largement exprimée impliquée dans la régulation de l’épissage des exons, la transcription des gènes et la stabilité de l’ARNm, toutes essentielles à la survie cellulaire ^1,2. Dans les maladies neurodégénératives comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la dégénérescence lobaire frontotemporale (FTLD), une protéine nucléaire TDP-43 s’accumule anormalement dans le cytoplasme. Ce décalage entraîne une perte de fonction de TDP-43 dans le noyau et un gain de fonction toxique dans le cytoplasme. L’accumulation pathologique de TDP-43 commence dans des régions spécifiques du cerveau et de la moelle épinière, se propageant à travers ces zones à la manière d’un prion, un processus étroitement associé à la progression de la maladie³. Cependant, le mécanisme exact par lequel la pathologie TDP-43 se propage dans le cerveau et la moelle épinière reste inconnu.

La TDP-43 est sécrétée par les vésicules extracellulaires (VE), et des niveaux élevés de TDP-43 sont détectés dans le plasma et le liquide céphalo-rachidien (LCR) des patients atteints de SLA et de FTLD-TDP ^4,5,6. Le LCR de patients diagnostiqués avec la SLA et la FTLD induit une mauvaise localisation intracellulaire et l’agrégation de TDP-43 endogène dans les cellules de gliome humain⁷. Ainsi, la TDP-43 libérée extracellulaire via les VE peut médier la propagation de cellule à cellule de la pathologie TDP-43.

L’autophagie est un mécanisme de dégradation cellulaire bien préservé qui implique l’enfermement de substances indésirables dans des vésicules à double membrane, appelées autophagosomes, qui sont marquées par LC3. Ces autophagosomes fusionnent avec les lysosomes positifs à la protéine membranaire associée aux lysosomes 1 (LAMP1) pour former des autolysosomes (LC3⁺/LAMP1⁺), entraînant la dégradation de leur contenu⁸. Les analyses histologiques indiquent que les autophagosomes engloutissant les inclusions s’accumulent dans les neurones des patients sporadiques atteints de SLA⁹. Certains gènes causaux de la SLA familiale et de la FTLD-TDP sont liés à la régulation de l’autophagie 10,11,12. Ces résultats suggèrent que l’autophagie est supprimée chez les patients atteints de SLA et de FTLD-TDP.

L’étude précédente a indiqué que TDP-43 est sécrété par des VE positifs pour le marqueur autophagosome LC3-II lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée¹³. La dérégulation de la voie autophagie-lysosome pourrait provoquer non seulement l’accumulation intracellulaire de TDP-43, mais également la libération extracellulaire de TDP-43 via les VE¹⁴. Cependant, on ne sait toujours pas comment les VE positives à LC3-II sont libérées et quelle est leur importance dans la propagation de la pathologie TDP-43.

Les VE sont classées en grandes VE (100 à 1000 nm de diamètre), qui sont produites à partir du bourgeonnement de la surface cellulaire, et en petites VE (50 à 150 nm de diamètre), qui sont produites à partir du bourgeonnement des membranes endosomiques vers l’intérieur de l’endosome (appelées exosomes) et de l’appareil de Golgi. Pour collecter séparément les grands et les petits VE, nous effectuons une centrifugation séquentielle et collectons les granulés par centrifugation à 20 000 × g et 110 000 × g, respectivement. La fraction P1 EV (20 000 × g de granulés) est préparée pour collecter de gros VE, et la fraction P2 EV (110 000 × g de granulés) est préparée pour collecter de petits^VE15. La méthodologie d’évaluation des niveaux de CL3-II dans les VE de grande et de petite taille dérivée de la centrifugation séquentielle par immunobuvardage est stable et reproductible¹⁶. En plus d’analyser les niveaux de LC3-II dans les VE, l’analyse de la formation des autolysosomes et des omégasomes permet de mieux comprendre comment la dérégulation de l’autophagie conduit à la libération de VE positifs LC3-II. Ici, la présente étude montre le rôle suppressif de la syntaxine 6 (STX6), une protéine SNARE, qui favorise le mouvement des vésicules de transport vers les membranes cibles¹⁷, dans la libération d’VE positives LC3-II lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

Protocole

1. Préparation de la cellule, de la fraction P1 et de la fraction P2 EV à partir du milieu cultivé de cellules HeLa

1. Préparation de la fraction P1 et P2 EV à partir du milieu cultivé de cellules HeLa
   1. Jour 1
      1. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁶ cellules sur une plaque de 6 cm contenant un milieu de culture composé de DMEM High Glucose, de 10 % de FBS et de 1 % de pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
   2. Jour 2 (facultatif)
      1. Préparez une solution de siRNA de 20 μM.
      2. Mélangez 100 μL de milieu sérique réduit et 3 μL d’ARNi dans un tube à faible rétention pour préparer la solution A.
      3. Mélanger 100 μL de milieu sérique réduit et 5 μL de réactif de transfection dans un tube à faible rétention pour préparer la solution B.
      4. Mélangez la solution A et la solution B, puis incubez le mélange à température ambiante (RT) pendant 5 min.
      5. Ajouter le mélange des solutions A et B au milieu utilisé pour la culture des cellules HeLa. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
   3. Jour 3
      1. Lavez les cellules avec du PBS et exposez-les à 500 μL de trypsine à 0,25 % et à une solution d’EDTA 1 mM à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 5 min.
      2. Ajoutez 2,5 ml du milieu de culture dans les cellules et utilisez une pipette de transfert Pasteur avec une pointe de pipette de 200 μL pour préparer une suspension unicellulaire.
      3. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁶ cellules sur une plaque de 10 cm. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
         REMARQUE : Il est nécessaire de préparer au moins 1 × 10^{cellules 6} pour collecter les VE du milieu de culture requis pour l’analyse par immunobuvardage.
   4. Jour 4
      1. Préparez un milieu de culture (voir l’étape 1.1.1.1) contenant soit un véhicule (DMSO), soit 100 nM de bafilomycine A1 (Baf).
      2. Exposez les cellules au milieu contenant soit du véhicule, soit du Baf de 100 nM et incubez-les à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
   5. Jour 5
      1. Prélevez tout le milieu de culture de la plaque de 10 cm, transférez-le dans un tube de 15 ml et centrifugez-le à 3 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.
         REMARQUE : Les cellules restantes de la plaque de 10 cm seront utilisées à la section 1.2.1.
      2. Pour l’isolement de la fraction P1 EV, transvaser le surnageant après centrifugation à 3 000 × g dans un tube de centrifugation, puis le centrifuger à 20 000 × g à 4 °C pendant 1 h.
      3. Pour l’isolement de la fraction P2 EV, transvaser le surnageant après centrifugation à 20 000 × g dans un tube d’ultracentrifugation, puis le centrifuger à 110 000 × g à 4 °C pendant 1 h.
      4. Après avoir essuyé l’excès d’humidité à l’intérieur du tube avec une lingette de laboratoire, mettez à nouveau en suspension les granulés restants dans le tube de centrifugation dans 50 μL de tampon d’échantillon 2x [2,5 % SDS, 125 mM tampon Tris-HCl (pH 6,8), 30 % de glycérol, 10 % de 2-mercaptoéthanol, 0,4 % de bleu de bromophénol] pour préparer la fraction P1 EV.
      5. Retirez le surnageant par décantation, essuyez l’excès d’humidité à l’intérieur du tube avec une lingette de laboratoire, puis mettez à nouveau en suspension les pastilles restantes dans le tube d’ultracentrifugation dans 50 μL de tampon d’échantillon 2x pour préparer la fraction P2 EV.
      6. Incuber les fractions P1 et P2 EV à 100 °C sur un bloc chauffant pendant 10 min.
         REMARQUE : Ne secouez pas les tubes après la centrifugation à 20 000 × g et 110 000 × g pour éviter de jeter accidentellement les granulés restants. Après avoir incliné le tube pour transférer le surnageant, maintenez la position du tube pour éviter que la pastille ne soit à nouveau immergée dans le surnageant restant.
2. Préparation de la fraction cellulaire à partir de cellules HeLa cultivées
   1. Jour 5
      1. Après le transfert du milieu de culture de la plaque de 10 cm dans un tube de 15 mL, laver les cellules dans la boîte de 10 cm avec du PBS et les exposer à 2 mL de trypsine à 0,25 % et à 1 mM de solution d’EDTA à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 5 min.
      2. Ajouter 8 mL de milieu de culture dans les cellules, puis utiliser une pipette de transfert Pasteur avec une pointe de pipette de 200 μL pour pipeter les cellules et préparer une suspension unicellulaire.
      3. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifugez-la à 1 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
      4. Retirer le surnageant à l’aide d’un aspirateur, ajouter du PBS à la pastille de cellule, puis centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
      5. Retirer le PBS à l’aide d’un aspirateur et sonicer la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon A68 [10 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M de NaCl, 1 mM d’éthylène glycol bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N,N-acide tétraacétique (EGTA)] contenant 1 % de sarkosyl.
      6. Mesurez la concentration protéique du lysat cellulaire à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA.
      7. Mélangez 300 μL de lysat cellulaire avec 100 μL de tampon d’échantillon 4x et incubez le mélange à 100 °C sur un bloc chauffant pendant 10 min pour préparer la fraction cellulaire.

2. Analyse par immunobuvardage

1. Séparer les quantités équivalentes de protéines dans les échantillons par SDS-PAGE¹⁸.
2. Transférez les protéines séparées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF).
3. Après le transfert, bloquez les membranes avec l’agent bloquant pendant 20 min.
4. Incuber la membrane bloquée pendant la nuit avec l’anticorps primaire indiqué dans le tampon Tris contenant 10 % (v/v) de sérum de veau à RT.
5. Laver la membrane avec un tampon Tris pendant 5 s, puis l’incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la biotine à RT pendant 2 h.
6. Laver la membrane avec le tampon Tris pendant 5 s, puis l’incuber avec le tampon Tris contenant 0,4 % (v/v) des solutions A et B du kit à RT pendant 1 h.
7. Lavez la membrane avec du PBS, puis incubez-la avec du PBS contenant 0,04 % (p/v) de diaminobenzidine, 0,8 % (p/v) de NiCl₂·6H₂O et 0,3 % (v/v) de H₂O₂ pour la détection colorimétrique des bandes.
   REMARQUE : Pour la détection de signaux, une méthode de chimiluminescence est également acceptable.
8. Numériser l’image de la membrane à l’aide d’un scanner et la soumettre à une analyse densitométrique à l’aide des Fidji.
   1. Ouvrez l’image numérisée à l’aide de Fidji et convertissez l’image couleur RVB en image 8 bits en cliquant sur Image | Type | 8 bits.
   2. Cliquez sur l’outil rectangle et ajustez la taille du rectangle en le faisant glisser pour entourer les bandes. Identifiez la bande à analyser en cliquant sur Analyser | Gels | Sélectionnez Première voie.
   3. Positionnez le rectangle sur la deuxième bande et les suivantes, puis identifiez les bandes à analyser en cliquant sur Analyser | Gels | Sélectionnez Voie suivante.
   4. Après avoir reconnu la bande finale, mesurez la densitométrie sur le rectangle en cliquant sur Analyser | Gels | Voies de l’intrigue.
   5. Entourez la zone du signal de la bande d’une ligne droite, cliquez sur l’outil baguette, puis cliquez dans la zone pour calculer l’intensité du signal de la bande.

3. Analyse du nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes

1. Jour 1
   1. Comptez le nombre de cellules HeLa à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁵ cellules HeLa exprimant LAMP1-GFP et mCherry-LC3 sur une boîte de 3,5 cm. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
2. Jour 2 (facultatif)
   1. Effectuez les étapes décrites à la section 1.1.2 dans des plats de 3,5 cm.
3. Jour 3
   1. Jeter le milieu de culture des plats de 3,5 cm.
   2. Laver les cellules avec du PBS, les exposer à 400 μL de solution de trypsine à 0,25 % et d’EDTA à 1 mM, et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 5 min.
   3. Ajoutez 1,6 mL du milieu de croissance dans les cellules et pipetez-les avec une pipette de transfert Pasteur pour préparer une suspension unicellulaire.
   4. Comptez le nombre de cellules à l’aide du compteur de cellules et amorcez 1 × 10⁴ cellules sur une lamelle à 8 chambres. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
      REMARQUE : Deux puits de lamelle à chambre sont préparés pour les cellules de contrôle et de neutralisation STX6, respectivement, après un traitement au DMSO ou au Baf, tel que décrit à la section 3.4.2.
4. Jour 4
   1. Préparez le milieu de culture sans rouge de phénol (DMEM sans rouge de phénol, 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine), contenant soit un véhicule (DMSO), soit 100 nM de Baf dissous dans du DMSO.
   2. Remplacer le milieu de culture par un milieu sans rouge de phénol, contenant soit du véhicule, soit du Baf de 100 nM, et incuber pendant 4 h.
      REMARQUE : Pour évaluer l’effet de Baf sur le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes, préparer des cellules traitées comme témoins.
   3. Teindre les noyaux avec 0,33 μg/mL de Hoechst 33342 pendant 30 min avant l’observation.
   4. Effectuez l’imagerie de cellules vivantes à l’aide d’un objectif 60x sur un microscope laser confocal et capturez dix images différentes.
      1. Ouvrez l’image fusionnée RVB aux Fidji et divisez-la en composants d’image respectifs rouge, vert et bleu en cliquant sur Image | Couleur | Diviser les chaînes.
      2. Définissez un seuil constant pour les signaux rouge et vert dans chaque image en cliquant sur Image | Ajuster | Seuil pour chaque expérience.
      3. Comptez le nombre de zones positives pour les signaux rouges ou verts en cliquant sur Analyser | Analysez les particules. Cochez la case Résumer , puis cliquez sur OK. Enregistrez les valeurs du dénombrement pour identifier les vésicules associées aux autophagosomes et aux lysosomes.
      4. Pour superposer l’image verte sur l’image rouge, réglez le mode de transfert sur ET en cliquant sur Modifier | Contrôle de collage. Copiez l’image verte, puis collez-la sur l’image rouge pour les fusionner, en mettant en évidence les zones positives pour les signaux rouges et verts.
      5. Pour identifier le nombre d’autolysosomes, comptez le nombre de zones positives pour les signaux rouges et verts en cliquant sur Analyser | Analysez les particules. Cochez la case Résumer , cliquez sur OK et enregistrez les valeurs dans la section Nombre pour identifier les vésicules associées aux autophagosomes et aux lysosomes.
   5. Divisez le nombre total d’autolysosomes et d’autophagosomes par le nombre total de cellules pour calculer le nombre d’autolysosomes et d’autophagosomes par cellule.
      REMARQUE : Comptez au moins 35 cellules dans chacune des trois expériences indépendantes.

4. Analyse de la formation des omégasomes

1. Jour 1
   1. Comptez le nombre de cellules HeLa à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁵ cellules sur une parabole de 3,5 cm. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
2. Jour 2 (facultatif)
   1. Effectuez les étapes décrites à la section 1.1.2.
3. Jour 3
   1. Préparez une suspension à cellule unique comme décrit aux étapes 3.3.1 à 3.3.2.
   2. Comptez les cellules à l’aide du compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁵ cellules sur une parabole de 3,5 cm. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
4. Jour 4
   1. Mélangez 1 μg de pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL de réactif de transfection de l’ADN et 100 μL de milieu sérique réduit dans un tube à faible rétention. Incuber le mélange pendant 20 min, puis l’ajouter au milieu de culture.
   2. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
5. Jour 5
   1. Trypsinisez les cellules comme décrit aux étapes 3.3.1-3.3.2.
   2. Ajouter 2,5 ml du milieu de croissance aux cellules. Pipeter le mélange à l’aide d’une pipette de transfert Pasteur pour préparer une suspension unicellulaire.
   3. Comptez les cellules à l’aide du compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁴ cellules sur une lamelle à 8 chambres. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
6. Jour 6
   1. Suivez les étapes 3.4.1 à 3.4.4 pour effectuer l’imagerie des cellules vivantes à partir de l’étape 4.5.3 à l’aide d’un microscope laser confocal. Capturez dix images différentes.
      1. Suivez les étapes 3.4.4.1 à 3.4.4.3 pour diviser les images fusionnées RVB en composantes d’image rouge, verte et bleue respectives, définir un seuil constant pour les signaux verts dans chaque image et déterminer l’intensité du signal GFP. Enregistrez les valeurs de la section Surface totale pour déterminer l’intensité du signal GFP-ATG13.
      2. Divisez l’intensité totale du signal par le nombre de cellules examinées pour calculer l’intensité du signal par cellule.
         REMARQUE : Comptez au moins 34 cellules dans chacune des trois expériences indépendantes.

Résultats

Comme l’ont montré des études antérieures, le traitement par Baf a augmenté les niveaux de TSG101 (P1 : P < 0,01, P2 : P = 0,012, tels que déterminés par l’ANOVA à deux facteurs dans EZR¹⁹) et LC3-II (P1 : P < 0,01, P2 : P < 0,01, tels que déterminés par l’ANOVA à deux facteurs dans EZR¹⁹) dans la fraction riche en VE. Notamment, le traitement Baf a également augmenté les niveaux de STX6 (P1 : P < 0,01, P2 : P < 0,01, tels que déterminés par l’ANOVA à deux facteurs dans EZR¹⁹) dans la fraction EV (Figure 1A), ce qui suggère que STX6 pourrait être un composant des VE. L’antigène nucléaire de cellule proliférante (PCNA) n’a pas été observé dans la fraction EV. L’immunotransfert de STX6 dans la fraction cellulaire a révélé que les niveaux de STX6 ont diminué de moitié avec son inactivation de siRNA (Figure 1B). L’inactivation de STX6 n’a pas affecté les niveaux de TSG101 dans les fractions de cellule et de VE dans des conditions traitées avec véhicule et avec Baf (Figure 1C). Cependant, l’inactivation de STX6 a augmenté les niveaux de LC3-II dans la fraction cellulaire sous la condition traitée par véhicule, mais pas dans la condition traitée par Baf. L’inactivation de STX6 a également augmenté les niveaux de LC3-II dans la fraction EV sous la condition traitée par Baf (Figure 1D). Ces résultats suggèrent que les méthodes utilisées pour détecter la LC3-II dans les VE par immunobuvardage sont suffisamment sensibles, même si l’efficacité de knockdown n’est pas substantielle. De plus, ces résultats indiquent que l’inactivation de STX6 augmente le nombre d’autophagosomes intracellulaires et améliore la libération extracellulaire des vésicules associées aux autophagosomes sous traitement Baf.

Pour déterminer plus en détail si l’inactivation de STX6 influence le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes intracellulaires, les autophagosomes et les lysosomes ont été visualisés à l’aide du marqueur d’autophagosome mCherry-LC3 et du marqueur de lysosome LAMP1-GFP. L’imagerie confocale de cellules vivantes a révélé des vésicules GFP et mCherry-positives dans les cellules HeLa exprimant LAMP1-GFP et mCherry-LC3 (Figure 2A). Les autolysosomes ont été identifiés comme des vésicules GFP et mCherry positives, tandis que les autophagosomes ont été identifiés comme des vésicules GFP négatives et mCherry-positive. L’inactivation de STX6 a augmenté le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes dans la condition traitée par véhicule (Figure 2B,C). Cependant, l’inactivation de STX6 n’a pas affecté le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes dans les conditions traitées par Baf (Figure 2B,C).

Pour déterminer si l’augmentation du nombre d’autophagosomes intracellulaires due à l’inactivation de STX6 résultait d’une formation accrue d’autophagosomes, la formation d’omégasomes, un processus requis pour la formation d’autophagosomes, a été examinée à l’aide de l’intensité du signal GFP-ATG13, marqueur omégasome. L’imagerie confocale de cellules vivantes a fourni une image assemblée de GFP-ATG13, indiquant la formation d’omégasomes (Figure 3A). L’inactivation de STX6 a diminué l’intensité du signal GFP-ATG13 (P = 0,023, déterminée par l’ANOVA à deux voies dans EZR¹⁹). Bien que l’inactivation de STX6 n’ait pas influencé de manière significative l’intensité du signal GFP-ATG13 dans des conditions traitées par un véhicule, elle a significativement diminué le signal dans des conditions traitées par Baf (Figure 3B). Collectivement, ces résultats indiquent que l’inactivation de STX6 augmente la libération de vésicules positives LC3-II liées à l’accumulation de vésicules associées aux autophagosomes.

Figure 1 : Résultats de l’immunotransfert des fractions cellulaires, P1 et P2 des cellules HeLa transfectées avec un témoin ou un siRNA STX6 sous traitement par véhicule ou Baf. Les cellules HeLa ont été traitées avec un véhicule (DMSO) ou 100 nM Baf pendant 24 h après transfection avec un témoin ou un siRNA STX6. Les fractions cellulaires, P1 (20 000 × g de granules) et P2 (110 000 × g de granules) ont été isolées. (A) Images immunobuvantes représentatives de chaque fraction montrant STX6, TSG101, LC3 et PCNA. (B-D) Une analyse densitométrique pour (B) STX6, (C) TSG101 et (D) LC3-II a été effectuée à partir des images immunoblot. Les intensités du signal ont été normalisées en fonction du contrôle ou des cellules transfectées par le siRNA STX6 traitées avec un véhicule ou un Baf. Les graphiques à barres représentent les valeurs moyennes ± S.E.M. (N = 3). * indique P < 0,05 par un test t non apparié bilatéral dans Excel. Abréviations : STX6 = syntaxine 6 ; Baf = bafilomycine A1 ; DMSO = sulfoxyde de diméthyle ; TSG101 = gène de susceptibilité tumorale 101 ; LC3 = protéines associées aux microtubules 1A/1B chaîne légère 3B ; PCNA = antigène nucléaire de cellule proliférante ; S.E.M. = erreur-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse d’images confocales de cellules HeLa co-exprimant Lamp1-GFP et mCherry-LC3 transfectées avec le témoin ou le siRNA STX6 dans les conditions traitées par véhicule et Baf. (A) Des images confocales de cellules HeLa exprimant de manière stable LAMP1-GFP et mCherry-LC3 ont été transfectées avec un siRNA témoin ou STX6 pendant 48 h, suivies d’une exposition au DMSO ou à 400 nM Baf pendant 4 h. Barre d’échelle = 20 μm. (B,C) La qunatification des autophagosomes (points négatifs LAMP1-GFP et positifs mCherry-LC3) et des autolysosomes (points doublement positifs LAMP1-GFP et mCherry-LC3) a été réalisée à l’aide du logiciel Fiji. Les données des graphiques à barres sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± S.E.M. (N = 3). * indique P < 0,05, basé sur un test t non apparié à deux queues dans Excel. Abréviations : Lamp1 = protéine membranaire associée aux lysosomes 1 ; LC3 = protéines associées aux microtubules 1A/1B chaîne légère 3B ; STX6 = syntaxine 6 ; Baf = bafilomycine A1 ; GFP = protéine fluorescente verte ; S.E.M. = erreur-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Imagerie confocale de cellules HeLa exprimant GFP-ATG13, transfectées avec un siRNA témoin ou STX6, et soumises à un traitement Vehicle ou Baf. (A) Les cellules HeLa ont été transfectées avec un témoin ou un siRNA STX6, suivies d’une transfection pEGFP-C1-hAtg13, et traitées avec du DMSO ou 400 nM Baf pendant 4 h. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Les intensités relatives du signal ont été déterminées en normalisant le signal dans chaque condition à celui des cellules témoins transfectées par siRNA traitées avec Baf. Le graphique à barres montre les données en moyennes ± S.E.M. (N = 3). * indique P < 0,05 par le test t bilatéral non apparié dans Excel. Abréviations : hAtg13 = gène 13 lié à l’autophagie humaine ; STX6 = syntaxine 6 ; Baf = bafilomycine A1 ; DMSO = sulfoxyde de diméthyle ; S.E.M. = erreur-type de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Analyse par immunotransfert des fractions cellulaires, P1 et P2 des cellules HeLa transfectées avec un siRNA témoin et traitées avec Baf. Les cellules HeLa ont été transfectées avec des siRNA témoins et exposées à 100 nM Baf pendant 24 h. Des fractions ont ensuite été préparées : cellule, P1 (20 000 × g de granulés) et P2 (110 000 × g de granulés). Images immunoblot représentatives d’ULK1 et de PCNA, montrant leurs niveaux dans chaque fraction à des fins de comparaison. Abréviations : Baf = bafilomycine A1 ; ULK1 = unc-51 comme l’autophagie activant la kinase 1 ; PCNA = antigène nucléaire de cellule proliférante. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’étude d’immunoblot a révélé des niveaux de LC3-II et de TSG101 dans la fraction cellulaire, la fraction P1 EV riche en microvésicules et la fraction P2 EV riche en exosomes. L’imagerie de cellules vivantes a été utilisée pour examiner les autophagosomes, les autolysosomes et les omégasomes, ce qui a permis de déterminer si l’inactivation de STX6 influence l’autophagie. Ces résultats combinés suggèrent que l’inactivation de STX6 affecte la libération de VE positives pour LC3-II, potentiellement liée à une dérégulation de la voie de l’autophagie. L’un des principaux avantages de cette méthode est sa capacité à faire la distinction entre les grands et les petits VE provenant de différentes sources. L’analyse par cytométrie en flux à l’aide de marqueurs spécifiques pour les microvésicules, les exosomes ou l’appareil de Golgi pourrait clarifier davantage comment l’inactivation de STX6 influence la libération de vésicules LC3-II positives.

Cependant, l’une des limites de l’étude d’immunotransfert est qu’il n’est pas clair si l’augmentation observée des niveaux de LC3-II dans la fraction EV après l’inactivation de STX6 sous traitement par Baf est due à une augmentation du nombre de vésicules LC3-II positives libérées ou à une augmentation des niveaux de LC3-II par VE. Pour distinguer ces possibilités, le comptage des vésicules à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules ou de l’analyse par cytométrie en flux pourrait aider à déterminer si le nombre de vésicules positives LC3-II est augmenté ou si les niveaux de LC3-II par vésicule sont élevés.

Une étape critique du protocole est le fractionnement du milieu de culture pour préparer la fraction EV. Les VE sont observés sous forme de minuscules granulés dans le tube de centrifugation. Pour préparer une fraction EV comparable, il est important de transférer ou d’éliminer soigneusement le surnageant après centrifugation afin d’éviter de diluer la concentration en protéines des pastilles EV. Pour examiner la contamination de la fraction cellulaire dans la fraction EV, les niveaux d’une protéine cytoplasmique, la kinase activatrice de l’autophagie de type unc-51 1 (ULK1), et d’une protéine nucléaire, PCNA, ont été comparés entre les fractions de cette étude (figure supplémentaire S1). La concentration en protéines dans la fraction cellulaire reflète généralement le nombre de cellules, mais la concentration en protéines cellulaires est influencée par les stades du cycle cellulaire²⁰ ou les perturbations de la protéostasie²¹. L’autophagie est cruciale pour le maintien de la protéostasie²². La dérégulation de l’autophagie par l’inactivation de STX6 ou le traitement par Baf pourrait modifier la concentration en protéines, quel que soit le nombre de cellules.

L’inactivation de STX6 est obtenue par la transfection de siRNA, et la surexpression de GFP-ATG13 est réalisée par transfection de l’ADN. L’efficacité de la transfection est influencée par le type de cellule, la densité et le nombre. L’alignement efficace des séquences de siRNA pourrait également affecter l’efficacité du knockdown. Des ajustements sont nécessaires lorsque l’efficacité de transfection est faible.

Les résultats actuels indiquent que l’inactivation de STX6 a augmenté les niveaux du marqueur autophagosome LC3-II dans la fraction EV dans des conditions traitées par Baf, mais n’a pas affecté les niveaux de TSG101. Cela suggère que STX6 supprime la libération de vésicules dérivées des autophagosomes, mais pas des MVB, lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

L’inactivation de STX6 a également augmenté les niveaux cellulaires de LC3-II dans des conditions de croissance, ce qui suggère que STX6 régule l’autophagie. En effet, l’inactivation de STX6 a augmenté le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes, alors qu’elle n’a pas amélioré la formation d’omégasomes. La maturation des autolysosomes provoque une reformation autophagique des lysosomes²³. Il est possible que STX6 intervienne dans le processus de maturation des autolysosomes, et sa perte de fonction pourrait augmenter le nombre d’autolysosomes immatures, entraînant une dérégulation de la fusion autophagosome-lysosome en raison de la suppression de la reformation des lysosomes autophagiques.

Le traitement Baf a augmenté les niveaux de STX6 dans la fraction EV, même lorsque son expression était régulée à la baisse. Des études antérieures ont suggéré que les vésicules associées aux autophagosomes sont libérées sous forme de VE lorsque la fonction lysosomale est inhibée^13,14. STX6 est connu pour se localiser dans les vésicules associées aux autophagosomes, telles que les vacuoles de type autophagosome contenant des streptocoques du groupe A (GAS)²⁴. Par conséquent, STX6 pourrait être localisé dans les vésicules associées aux autophagosomes qui sont libérées sous forme de VE lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

La propagation de la pathologie TDP-43 est étroitement liée à la progression de la SLA et de la FTLD-TDP³. Bien que l’on ne sache toujours pas comment la pathologie TDP-43 se propage dans le cerveau et la moelle épinière, la voie EV peut médier sa propagation. Des études antérieures ont indiqué que la dérégulation de la voie autophagie-lysosome entraîne la libération de VE positives LC3-II contenant TDP-43¹³. La présente étude suggère un rôle de STX6 dans la régulation de la libération d’VE lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée. La méthodologie d’évaluation des niveaux de LC3-II dans les fractions cellulaires et EV par immunobuvardage devrait s’avérer utile dans les études futures.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % Trypsine EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
Antenne parabolique 10 cm	Thermo Fisher Scientific	150464
Tube de 15 mL Thermo	Fisher Scientific	339650
200 &mu ; L Pointe de pipette	Nippon Genetics	FG-301	pipetage
2-Mercaptoéthanol	Nacalai Tesque	21417-52	un matériau pour solution tampon d’échantillon
3,3'-diaminobenzidine tétrachlorhydrate	Nacalai Tesque	11009-41	un matériau pour solution DAB
3,5 cm Plat  ;	Thermo Fisher Scientific	150460
Plat 6 cm  ;	TrueLine	TR4001
Bloc d’aluminium Bains thermostatiques (bains thermaux secs)	EYELA	273860
Aspirateur	SANSYO	SAP-102	d’inhalation
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycine A1	Adipogen	BVT-0252
Chèvre conjuguée à la biotine Vecteur d’anticorps IgG anti-lapin	Laboratoires  ;	BA-1000	2ème anticorps pour l’immunobuvardage
Cheval conjugué à la biotine Anticorps IgG	Vector Laboratories  ;	BA-2000	2e anticorps pour l’immunobuvardage
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	un matériau pour l’immunobuvard
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	un matériau pour solution tampon d’échantillon
Sérum de veau	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Scanner
CSLIDE220 CanonCentrifugeuse 5702 R	eppendolf	5703000039
Lames de comptage Double Chambre	Bio-Rad	1450015J	comptage de cellules
Sonificateur numérique 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	véhicule
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	milieu de culture
DMEM sans rouge de phénol	Nacalai Tesque	08489-45	milieu de culture
EGTA	Dojindo  ;	348-01311	un matériau pour solution A68
Excel	Microsoft	version 16.16.27	analyse satistique
EZR	Référence n° 24	version 1.68	analyse satistique
FBS	Sigma	173012	Milieu de culture
Fidji	NIH		Outil d’analyse d’image
Glycérol	Nacalai Tesque	09886-05	un matériau pour solution tampon d’échantillon
Hoehst33342	Dojindo  ;	H342
Peroxyde d’hydrogène	Fujifilm Wako	080-0186	un matériau pour solution DAB
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	lingette nettoyante
Tube à faible rétention	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	transfection d’ARNi et d’ADN
LSM780 Microscope laser confocal	Carl Zeiss
Souris monoclonale Anti-LC3 Anticorps	MBL	M186-3	1er anticorps pour immunobuvard
Chlorure de nickel(II) hexahydraté	Fujifilm Wako	149-01041	un matériau pour solution DAB
N-Lauroylsarcosine Sodium Salt	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Sérum réduit Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	transfection de siRNA et d’ADN
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Pénicilline/Streptomycine	Nacalai Tesque	26253-84	Milieu de culture
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Anticorps anti-PCNA de lapin polyclonal	BioAcademia	70-080	1er anticorps pour immunobuvard
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxine 6	Anticorps ProteinTech	10841-1-AP	1er anticorps pour immunobuvard
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Anticorps	ProteinTech	28283-1-AP	1er anticorps pour immunobuvard
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Anticorps	ProteinTech	20986-1-AP	1er anticorps pour immunobuvard
Difluorure de polyvinylidène Membrane	Milliore	IPVH00010	un matériau pour l’immunobuvardage
R	R development core team	version 4.4.1	analyse satistique
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA réactif de transfection
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA pour transfection
Sodium Chloride	Nacalai Tesque	31320-05	un matériau pour tampon Tris et solution A68
Dodécylsulfate de sodium	Fujifilm Wako	192-13981	un matériau pour solution tampon d’échantillon
SPARK Lecteur de microplaques	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	transfection de siRNA
Saccharose	Fujifilm Wako	193-00025	un matériau pour solution A68
Compteur de cellules automatisé TC20 avec imprimante thermique	Bio-Rad	1450109J1	comptage de cellules
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubation
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	Réactif de transfection d’ADN
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	réactif
de transfection d’ADNTris(hydroxyméthyl)aminométhane	Nacalai Tesque	35406-75	un matériau pour tampon Tris, tampon d’échantillon et solution A68
Trypan Blue Dye 0,40 %	Bio-Rad	1450021	comptage de cellules
Tube à couvercle ouvert ultra-transparent, 16 x 96 mm  ;	Beckman Coulter	361706	collecte pour la fraction P1 EV
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	collecte pour la fraction P2 EV
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories  ;	PK-4000
Bouteille de lavage	comme une membrane	lavage	1-4640-02
&mu ;-Slide 8 Bien élevé	ibidi	80806