Article de méthode

La glycoprotéomique guidée par Glycomics facilite le profilage complet du glycoprotéome dans les microenvironnements tumoraux complexes

DOI :

10.3791/67405

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7 février 2025

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1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole détaille la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique, une technologie omique intégrée qui offre des informations complètes sur le glycoprotéome hétérogène dans les microenvironnements tumoraux complexes nécessaires pour mieux comprendre la glycobiologie des cancers.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La glycosylation est une modification protéique courante et structurellement diversifiée qui affecte un large éventail de processus tumorigènes. La glycomique et la glycoprotéomique pilotées par spectrométrie de masse sont apparues comme des approches puissantes pour analyser les glycanes libérés et les glycopeptides intacts, respectivement, offrant une compréhension plus approfondie du glycoprotéome hétérogène dans le microenvironnement tumoral (TME). Ce protocole détaille la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique, une technologie omique intégrée, qui utilise d’abord des glycomiques poreuses à base de carbone graphitisé-LC-MS/MS pour élucider les structures glycanes et leur distribution quantitative dans le glycome des tissus tumoraux, des populations cellulaires ou des fluides corporels étudiés. Cela permet une analyse glycomique comparative pour identifier la glycosylation altérée entre les groupes de patients, les stades de la maladie ou les conditions et, surtout, sert à améliorer l’analyse glycoprotéomique en aval du ou des mêmes échantillons en créant une bibliothèque de structures de glycanes connues, réduisant ainsi le temps de recherche de données et le taux d’identification erronée des glycoprotéines. En se concentrant sur le profilage N-glycoprotéome, les étapes de préparation des échantillons pour la méthode glycoprotéomique guidée par la glycomique sont détaillées dans ce protocole, et les aspects clés de la collecte et de l’analyse des données sont discutés. La méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique fournit des informations quantitatives sur les glycoprotéines présentes dans le TME et leurs sites de glycosylation, l’occupation du site et les structures glycanes spécifiques au site. Des résultats représentatifs sont présentés à partir de tissus tumoraux fixés au formol et inclus dans de la paraffine provenant de patients atteints de cancer colorectal, démontrant que la méthode est sensible et compatible avec les coupes de tissus que l’on trouve couramment dans les biobanques. La glycoprotéomique guidée par Glycomics offre donc une vue complète de l’hétérogénéité et de la dynamique du glycoprotéome dans les EUT complexes, générant des données biochimiques robustes nécessaires pour mieux comprendre la glycobiologie des cancers.

Introduction

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La glycosylation des protéines est un type répandu et complexe de modification co- et post-traductionnelle des protéines produites par les espèces à travers l’arbre phylogénétique de lavie1,2,3. Les glycanes liés aux protéines sont connus pour avoir un impact sur un large éventail de processus biologiques importants pour la santé humaine, y compris la médiation et la régulation des interactions cellulaires et des événements de communication 4,5. On a pensé que la glycosylation aberrante des protéines était une cause de transformation maligne, de progression tumorale et de propagation 6,7,8. Cela implique les glycanes dans des processus tumorigènes clés dans le microenvironnement tumoral (TME) et offre un potentiel considérable et largement inexploité pour la découverte de biomarqueurs à base de glycanes et d’applications thérapeutiques. La glycobiologie fait donc l’objet d’une attention croissante dans la recherche sur le cancer et dans les sciences de la vie9.

S’appuyant sur les développements clés de la glycoanalytique et de l’informatique au cours de la dernière décennie 10,11,12,13,14,15,16,17, la glycomique et la glycoprotéomique pilotées par chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) ont été établies comme des outils puissants pour le profilage à l’échelle du système de glycanes libérés et de glycopeptides intacts à partir de mélanges complexes de glycoprotéines extraites directement de leurs origines d’échantillons biologiques, telles que divers types d’échantillons de patients cancéreux (par exemple, tissus tumoraux, populations cellulaires, fluides corporels)3,13,18,19,20.

La glycomique fournit des informations sur la structure et la quantité du répertoire de glycanes (le glycome), qui est produit dynamiquement par les cellules, les tissus et même des organismes entiers. D’autre part, la glycoprotéomique fournit des informations quantitatives sur les transporteurs de protéines et leur(s) site(s) de glycosylation, les taux d’occupation du site (macro-hétérogénéité), les compositions de glycanes spécifiques au site et leur modèle de distribution de site (micro-hétérogénéité) avec des informations structurelles limitées sur les glycanes (souvent limitées à la composition des glycanes)15,16,21. Par conséquent, la glycomique et la glycoprotéomique sont des approches complémentaires pour étudier les détails biochimiques du glycoprotéome22.

Une myriade de modèles méthodologiques et de stratégies analytiques pour la glycomique et la glycoprotéomique ont été élaborés et appliqués dans tous les laboratoires en fonction du glycoanalyte d’intérêt (p. ex., lié à N-/O-/C, glycane/glycopeptide/glycoprotéine, étiqueté/non marqué), de la nature de l’échantillon (p. ex., cellules, tissus, fluides corporels), de la quantité (niveaux de protéines nanogrammes/microgrammes/milligrammes) et de l’instrument d’analyse disponible23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Malgré les avantages reconnus de leur utilisation parallèle, la glycomique et la glycoprotéomique ne sont pas couramment appliquées ensemble, mais plutôt en tant qu’approches autonomes dans les études de recherche sur la glycobiologie et le cancer en raison de leur forte demande d’expertise analytique et d’instrumentation spécialisée.

Reconnaissant cette lacune technologique, il y a plus de dix ans, nous avons introduit la méthode de glycoprotéomique assistée par glycomique, qui est capable d’intégrer les données glycomiques et glycoprotéomiques obtenues à partir d’échantillons biologiques complexes33. En bref, la technologie glycoprotéomique assistée par glycomique (ou guidée par la glycomique comme dans ce protocole) établit le profil des N- et/ou O-glycanes à travers une méthode LC-MS/MS à carbone graphitisé poreux (PGC) ÉTABLIE34,35, qui sont ensuite utilisées pour l’analyse des données intactes de N- et/ou O-glycopeptide acquises à partir du ou des mêmes échantillons en définissant les limites de l’espace de recherche des glycanes36. PGC-LC-MS/MS est une méthode glycomique particulièrement puissante car elle fournit un aperçu quantitatif du glycome avec une sensibilité et une résolution structurelle élevées, fournissant des informations sur la topologie (séquence monosaccharidique et motif de ramification) et les liaisons glycosidiques des glycanes, même au sein de mélanges complexes 35,37,38. Le flux de travail glycoprotéomique implique la génération de peptides, le marquage facultatif des peptides, le multiplexage et la préfractionnement, ainsi que l’enrichissement avant l’analyse LC-MS/MS en phase inverse qui utilise idéalement différentes méthodes de fragmentation, notamment la dissociation collisionnelle par paliers, y compris la dissociation collisionnelle à énergie de collision/haute énergie (sceHCD, pour les N-glycopeptides) et le transfert d’électrons/dissociation collisionnelle à haute énergie (EThcD, pour les O-glycopeptides) pour l’identification des analytes. Pour l’analyse du N-glycoprotéome, la dé-N-glycoprotéomique parallèle peut guider l’analyse des données de N-glycopeptide intact en définissant l’espace de recherche protéine/peptide et en fournissant plus de détails sur les sites de N-glycosylation occupés et leur taux d’occupation du site, tandis que l’analyse parallèle des peptides non modifiés révèle tout changement de niveau de protéine entre les conditions étudiées.

Cet article fournit un protocole étape par étape détaillé et facile à suivre pour la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique (voir la figure 1 pour une vue d’ensemble du flux de travail). Le protocole fournit des détails expérimentaux sur les étapes de préparation des échantillons et les expériences de glycomique et de glycoprotéomique basées sur LC-MS/MS et présente des résultats représentatifs démontrant l’application de la méthode à des coupes de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) de tumeurs réséquées chez des patients atteints de cancer colorectal (CRC), permettant d’obtenir des informations sur la glycobiologie du TME dans un type d’échantillon précieux qui est archivé dans des biobanques de cancer du monde entier. L’analyse et l’intégration des données glycomiques et glycoprotéomiques sont également brièvement abordées.

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Figure 1 : Vue d’ensemble de la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique. La vue d’ensemble présente les étapes expérimentales détaillées des flux de travail glycomiques (à gauche) et glycoprotéomique (à droite), avec une vue d’ensemble des informations obtenues (en gras) et de la manière dont les deux approches sont intégrées grâce à une analyse et une interprétation améliorées des données. Insertion : Micro-colonnes SPE faites maison utilisées pour les flux de travail (i) glycomiques et (ii-iii) glycoprotéomiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

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L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche humaine (sciences médicales) de l’Université Macquarie, à Sydney, en Australie (Protocole 5201800073).

REMARQUE : La méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique peut être appliquée à un ensemble diversifié d’échantillons biologiques allant d’une complexité de glycoprotéine faible à extrême. Pour les approches glycoprotéomiques sans marquage (dans lesquelles le regroupement des échantillons n’est pas effectué), environ 100 à 200 μg de protéines totales provenant de mélanges complexes sont nécessaires comme matériau de départ pour assurer une couverture élevée du glycoprotéome après enrichissement pour les glycopeptides qui peuvent ne constituer que 1 à 10 % de la population peptidique. En raison de contraintes d’espace, l’extraction initiale des protéines à partir de cellules ou de tissus est laissée de côté, et les lecteurs sont renvoyés vers d’autres ressources15. Glycomics consomme de manière conservatrice ~10-20 μg de protéines par analyse pour le profilage profond des glycomes, laissant la majorité de l’extrait de protéine pour la glycoprotéomique. Sauf indication contraire, les concentrations finales ont été mentionnées et les produits chimiques doivent être dissous dans de l’eau de très haute qualité pour former des solutions aqueuses dans le protocole ci-dessous.

1. Préparation protéinée

  1. Déterminer la concentration en protéines des extraits à l’aide d’une méthode établie (p. ex., dosage de l’acide bicinchoninique ou des protéines de Bradford). Ajuster la concentration en protéines à 10 μg/μL dans 50 mM de TEAB (pH 8,5).
  2. Réduire les liaisons disulfure en incubant les échantillons avec 10 mM de DTT pendant 45 min à 56 °C. Les thiols libres d’alkylate se groupent ensuite en incubant des échantillons avec 40 mM d’IAA dans l’obscurité pendant 30 min à 20-25 °C. Tremper la réaction d’alkylation avec un excès de DTT (~40 mM).
  3. Divisez chaque échantillon de protéines. Prévoyez environ 10 à 20 μg de protéines totales pour la glycomique et 100 à 200 μg de protéines totales pour le flux de travail de glycoprotéomique.
    REMARQUE : En plus de l’échantillon de protéines d’intérêt, inclure une glycoprotéine modèle connue (p. ex., fœtuine bovine) ou un mélange de protéines (p. ex., lysat de lignée cellulaire, plasma) afin d’évaluer l’efficacité et la reproductibilité des procédures et de surveiller le rendement de la LC-MS/MS.

2. Flux de travail N-glycomique

  1. Immobilisation de protéines sur une membrane PVDF
    1. À l’aide d’un poinçonneur monotrou, coupez la membrane PVDF avec le nombre d’échantillons de protéines à repérer.
    2. Mouillez les membranes excisées avec de l’éthanol ou du méthanol, puis transférez les membranes sur une plaque à fond plat à 96 puits.
    3. Une fois que les membranes sont presque sèches, déposer les échantillons de protéines dans un volume maximal de 2,5 μL par point afin de minimiser la surface de l’échantillon de protéines déposé. Repérez à nouveau les échantillons si nécessaire de sorte que la quantité totale de protéines immobilisées sur place soit de ~10-20 μg. Pour ce faire, laissez la tache sécher à l’air libre avant de répéter la procédure de détachage.
      REMARQUE : Pendant le repérage, il peut être nécessaire de réhumidifier la membrane avec de l’éthanol ou du méthanol pour empêcher les membranes de sécher jusqu’à la fin.
    4. Faites sécher les membranes à l’air libre à 20-25 °C pendant au moins 3 h, de préférence toute la nuit. Évitez toute contamination des membranes pendant le séchage.
      REMARQUE : En tant qu’étape facultative de contrôle de la qualité, les protéines repérées sur les membranes peuvent être visualisées par coloration avec la solution Direct Blue 71 comme décrit précédemment34.
  2. Libération de N-glycanes liés aux protéines
    1. Ajouter 100 μL de PVP40 à 1 % (p/v) dans du méthanol dans chaque puits contenant les membranes tachetées. Assurez-vous que le côté de la membrane sur lequel l’échantillon de protéine a été repéré est orienté vers le haut tout au long de la préparation de l’échantillon.
    2. Agitez la plaque dans la solution PVP40 pendant 5 min à 20-25 °C, puis jetez la solution PVP40.
      REMARQUE : La solution PVP40 bloque les membranes PVDF et les puits pour empêcher la liaison non spécifique de la PNGase F (et de toutes les exoglycosidases qui peuvent être appliquées pour obtenir des informations spécifiques à la liaison dans des expériences parallèles ; voir la discussion ci-dessous) dans les étapes suivantes.
    3. Lavez chaque puits contenant les taches protéiques bloquées avec 100 μL d’eau ultrapure et secouez la plaque pendant 5 min. Répétez cette étape 3 fois. Assurez-vous que l’eau est complètement jetée après chaque lavage.
    4. Ajouter 15 μL de solution de PNGase F (0,5 U/μL, diluée dans de l’eau ultrapure à partir de la solution mère de 10 U/μL) dans chaque puits, en supposant que 15 μg de protéines par échantillon ont été déposés.
    5. Ajoutez de l’eau dans les puits vides environnants pour éviter la déshydratation de l’échantillon pendant les étapes ultérieures de l’incubation, et utilisez un film transparent pour sceller soigneusement la plaque. Incuber la plaque pendant au moins 8 h à 37 °C.
    6. Sonicez la plaque pendant 5 minutes pour aider les gouttelettes évaporées sur le côté des puits à s’accumuler au fond de la plaque.
    7. Transférez soigneusement les échantillons de N-glycanes libérés dans des tubes de microcentrifugation individuels (1,5 mL). Lavez les puits d’échantillonnage 2 fois avec 20 μL d’eau ultrapure, distribuez-les et aspirez-les plusieurs fois. Combinez tout échantillon restant de chaque puits dans les tubes de microcentrifugation contenant les échantillons de N-glycanes.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser des tubes à faible liaison pour la préparation des échantillons N-glycomiques, car les glycanes hydrophiles peuvent se lier de manière irréversible aux tubes revêtus.
    8. Ajouter 10 μL d’acétate d’ammonium 100 mM pH 5,0 et incuber les échantillons pendant 1 h à 20-25 °C.
      REMARQUE : Cette étape hydroxyle les résidus de N-acétylglucosamine aminés à l’extrémité réductrice des N-glycanes libérés, permettant une réduction exhaustive dans l’étape suivante. Ajuster 100 mM d’acétate d’ammonium à un pH de 5,0, car les taux élevés de conversion de la glycosylamine en hydroxyle à l’extrémité réductrice des N-glycanes détachés dépendent de la faible acidité de la solution.
    9. Sécher les échantillons de N-glycanes dans un système de concentration sous vide.
  3. Réduction des N-glycanes libérés
    1. Ajoutez 20 μL de 1 M NaBH4 dans 50 mM KOH fraîchement préparés aux échantillons de N-glycanes séchés et mélangez soigneusement.
      REMARQUE : Le NaBH4 doit être fraîchement préparé dans KOH le jour de son utilisation.
    2. Fermez hermétiquement les couvercles de chaque tube et incubez les échantillons pendant 3 h à 50 °C.
      REMARQUE : Les N-glycanes subissent une réduction, qui convertit les α et β-anomères de l’extrémité réductrice en une seule forme d’alditol, conduisant à un seul pic chromatographique dans l’analyse PGC-LC-MS/MS.
    3. Après l’incubation, faites tourner les tubes d’échantillon dans une microcentrifugeuse pour amener le liquide au fond des tubes.
    4. Ajouter 100 μL d’eau ultrapure à chaque échantillon. Ajouter 2 μL d’acide acétique glacial pour neutraliser les échantillons de N-glycanes alcalins. Faites tourner les tubes d’échantillon dans une microcentrifugeuse pour amener les échantillons au fond des tubes.
      REMARQUE : L’acide acétique glacial neutralise les échantillons alcalins, ce qui conduit à la formation d’hydrogène gazeux (H2) et à l’effervescence ultérieure pendant la réaction.
  4. Dessalage des N-glycanes à l’aide du PGC-C18-SPE
    1. Préparez des micro-colonnes PGC-C18-SPE faites maison comme décrit ci-dessous.
      1. À l’aide d’une seringue appropriée, branchez et transférez les disques C18 vers les pointes de pipette appropriées (10 μL).
        REMARQUE : Ici, des micro-colonnes C18-SPE commerciales peuvent également être utilisées.
      2. Pipette de 10 μL de résine PGC en suspension dans du méthanol à 50 % (v/v) dans les micro-colonnes C18-SPE. Placez les micro-colonnes dans des tubes de 2 mL équipés d’adaptateurs de microcentrifugeuse. Faites tourner les tubes pour créer des micro-colonnes PGC-C18-SPE d’une hauteur de colonne de ~0,5 cm (voir Figure 1i). Préparez une micro-colonne PGC-C18-SPE pour chaque échantillon.
        REMARQUE : L’utilisation d’adaptateurs garantit que les micro-colonnes sont suspendues au centre du tube.
      3. Pour les étapes ultérieures de lavage et de chargement d’échantillons, réglez une centrifugeuse de paillasse à 6 000 tr/min (~2 000 x g) et essorez-la pendant 60 s pour faciliter le passage des phases mobiles à travers les micro-colonnes PGC-C18-SPE. Lavez et conditionnez chaque micro-colonne PGC-C18-SPE séquentiellement avec 50 μL 0,1 % (v/v) TFA dans ACN trois fois, puis 50 μL 0,1 % (v/v) TFA trois fois.
        REMARQUE : Les micro-colonnes PGC-SPE peuvent être préparées des heures à l’avance, mais doivent être stockées hydratées à température ambiante avant d’être utilisées.
    2. Appliquez les échantillons de N-glycanes sur les micro-colonnes PGC-C18-SPE dans un volume de charge allant jusqu’à 40 μL et essorez à 6 000 tr/min (~2 000 x g) pendant 60 s après chaque ajout. Répétez l’étape de chargement jusqu’à ce que l’ensemble de l’échantillon de N-glycane ait été appliqué sur la microcolonne.
      REMARQUE : Bien que les fractions à flux continu ne doivent pas contenir de glycanes, nous recommandons de conserver ces fractions jusqu’à ce que les données glycomiques aient été acquises avec succès en cas de rétention incomplète sur les micro-colonnes PGC-C18-SPE.
    3. Lavez les micro-colonnes PGC-C18-SPE avec 20 μL d’eau ultrapure. Transférez les micro-colonnes PGC-C18-SPE dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL en préparation de l’élution des N-glycanes.
    4. Éluer les N-glycanes en ajoutant 40 μL de TFA à 0,1 % dans 50 % (v/v) d’ACN à chaque micro-colonne PGC-C18-SPE, puis spinner. Répétez cette procédure et combinez l’éluat.
      REMARQUE : Il est important de surveiller les micro-colonnes après chaque essorage pour s’assurer que la solution a été complètement essorée, car cela facilitera une élution efficace.
    5. Faites sécher les N-glycanes dessalés dans un système de concentration sous vide.
  5. Acquisition PGC-LC-MS/MS
    1. Préparez les solvants LC comme décrit ci-dessous.
      1. Solvant A : Préparer 100 mL de 100 mM de solution mère de bicarbonate d’ammonium (NH4HCO3) dans de l’eau ultrapure. Filtrez la solution mère à travers un disque filtrant en nylon de 0,2 μm à l’aide d’une unité de filtration sous vide pour éliminer les particules. Ensuite, préparez 1 L de 10 mM de solution de NH4HCO3 (solvant A) en diluant 100 mL de 100 mM de solution mère de NH4HCO3 dans 900 mL d’eau ultrapure. Sonicate solvant A pendant 15 min pour dégazer la solution. Le solvant A peut être conservé pendant 1 semaine à 20-25 °C, tandis que la solution mère NH4HCO3 de 100 mM peut être conservée pendant 1 mois à 4 °C.
      2. Solvant B : Préparer 1 L de 10 mM de NH4HCO3 dans 70 % (v/v) d’ACN dans de l’eau ultrapure (solvant B) en ajoutant 100 mL de solution mère de 100 mM de NH4HCO3 (voir l’étape précédente 2.5.1.2) à 700 mL d’ACN et diluer jusqu’à un volume total de 1 L avec de l’eau ultrapure. Sonicate solvant B pendant 15 min pour dégazer. Le solvant B peut être stocké pendant 2 semaines à 20-25 °C.
    2. Remettre en suspension les N-glycanes dessalés dans 10 μL d’eau ultrapure et bien mélanger. Faites tourner les échantillons à 14 000 x g pendant 5 min, puis transférez soigneusement le surnageant dans des flacons d’échantillons MS, en laissant environ 0,5 μL derrière vous pour éviter de transférer des particules et des débris visibles ou invisibles qui endommageraient le système LC-MS/MS.
    3. Injectez et séparez les N-glycanes sur une colonne capillaire PGC-LC chauffée à 50 °C en utilisant un gradient linéaire de 60 minutes (ou autrement approprié) de 0 % à 70 % (v/v) de solvant B dans le solvant A sur un système HPLC. Assurez-vous que le système HPLC est connecté au spectromètre de masse et qu’il fonctionne avec un débit constant de 20 μL/min (ajustez le débit pour qu’il corresponde à la géométrie de la colonne PGC-LC).
    4. Détectez les N-glycanes séparés à l’aide d’un spectromètre de masse quadripolaire à piège à ions linéaires (ou d’un autre système MS approprié à basse ou haute résolution) installé avec une source d’ions par électronébulisation et fonctionnant en mode de polarité ionique négative.
    5. Réglez la plage de balayage d’acquisition MS1 sur m/z 150-2 000 avec une largeur de crête de balayage zoom de m/z 0,25 pleine largeur semi-maximale (FWHM) à m/z 200. Réglez la tension source sur 3,2 kV. Pour les balayages MS1, réglez le contrôle automatique du gain (AGC) sur 5 x 104 ions avec un temps d’accumulation maximal de 50 ms (ou d’autres paramètres appropriés).
      REMARQUE : Le m/z de départ faible doit inclure la détection des mono- et di-saccharides qui contribuent souvent au N- et O-glycome.
    6. Pour MS/MS, réglez la résolution sur m/z 0,25 FWHM à m/z 200, l’AGC sur 2 x 104 ions et le temps d’accumulation maximal sur 300 ms. Activez l’acquisition dépendante des données (DDA) et sélectionnez les cinq précurseurs les plus abondants dans chaque balayage complet MS1 pour la fragmentation à l’aide de l’activation par résonance (piège ionique) de la dissociation induite par collision (CID) à une énergie de collision normalisée (NCE) de 33 %. Désélectionnez l’exclusion dynamique pour éviter de manquer des isomères N-glycanes isobares à élution proche.
  6. Analyse des données glycomiques LC-MS/MS
    1. Parcourez les données brutes LC-MS/MS générées à l’aide d’un logiciel approprié pour garantir une qualité de données élevée après avoir confirmé la largeur étroite du pic LC, la séparation efficace des isomères N-glycanes, la précision MS, la résolution et le rapport signal/bruit élevés, ainsi que l’efficacité de fragmentation CID-MS/MS élevée.
    2. Identifiez manuellement les N-glycanes dans l’échantillon en fonction de leur masse de précurseurs monoisotopiques, de leur profil de fragmentation CID-MS/MS et de leur temps de rétention relatif et absolu du PGC-LC.
      REMARQUE : RawMeat v2.1, GlycoMod et GlycoWorkBench v2.1 peuvent faciliter le processus d’identification comme décrit26. Les contraintes biosynthétiques connues et la parenté structurelle entre les analytes observés peuvent également renforcer la confiance dans les N-glycanes26 identifiés. Alternativement, l’identification semi-automatique des glycanes et l’annotation spectrale peuvent être effectuées à l’aide d’un logiciel commercial.
    3. Pour la quantification relative des N-glycanes, générer une liste de transition contenant le précurseur monoisotopique m/z de tous les isomères de N-glycanes identifiés et utiliser un logiciel commercial pour déterminer les valeurs de l’aire sous la courbe (AUC) basée sur les chromatogrammes ioniques extraits (EIC) de tous les ions précurseurs de N-glycanes, comme décrit26.

3. Flux de travail N-glycoprotéomique

  1. Digestion du mélange de protéines
    1. Digérer 100 à 200 μg de l’extrait protéique réduit et alkylé (de la partie 1) en ajoutant de la trypsine (rapport enzyme :protéine 1:50, p/p) et/ou d’autres protéases de votre choix à chaque échantillon.
      REMARQUE : Contrairement à la préparation d’échantillons glycomiques, utilisez, si possible, des tubes de microcentrifugation à faible liaison pour les étapes de préparation d’échantillons glycoprotéomiques pour une récupération maximale des peptides.
    2. Incuber les échantillons pendant 8 à 12 h à 37 °C. Assurez-vous que le pH est de ~8,5 car une solution légèrement alcaline améliore l’efficacité de la digestion de la trypsine.
      REMARQUE : Les protéases spécifiques qui produisent des motifs de clivage prévisibles et laissent la plupart des N-glycopeptides avec un seul séquon (site de glycosylation), comme la trypsine et le Lys-C, sont préférées. Évitez de trop incuber les échantillons pour réduire les clivages non spécifiques des protéines par la trypsine ou d’autres protéases.
    3. Stopper la digestion par acidification (pour éviter les clivages non spécifiques induits par une digestion prolongée) par l’ajout de 1 % (v/v) de TFA.
  2. Dessalage peptidique à l’aide d’Oligo R3-C18-SPE
    1. Préparez des micro-colonnes Oligo R3-C18-SPE faites maison comme décrit ci-dessous.
      1. À l’aide d’une seringue appropriée, branchez et transférez les disques C18 sur des pointes de pipette de 10 μL.
        REMARQUE : Ici, des micro-colonnes C18-SPE commerciales peuvent également être utilisées.
      2. Déposez une boue de résine Oligo R3 en suspension dans de l’ACN pur dans les micro-colonnes C18-SPE. Placez les micro-colonnes dans des tubes de 2 mL équipés d’adaptateurs de microcentrifugeuse pour vous assurer que les micro-colonnes sont suspendues au centre du tube et tournez-les pour créer des micro-colonnes Oligo R3-C18-SPE d’une hauteur de colonne de ~1 cm (voir Figure 1ii). Préparez une micro-colonne Oligo R3-C18-SPE pour chaque échantillon.
    2. Pour les étapes ultérieures de lavage et de chargement d’échantillons, réglez une centrifugeuse de paillasse à 6 000 tr/min (~2 000 x g) et essorez-la pendant 60 s pour permettre aux phases mobiles de passer à travers les micro-colonnes Oligo R3-C18-SPE. Lavez et conditionnez chaque micro-colonne Oligo R3-C18-SPE séquentiellement avec 50 μL d’ACN pur, 3x, puis 50 μL de TFA à 0,1 % (v/v), 3x.
      REMARQUE : Les micro-colonnes Oligo R3-C18-SPE peuvent être préparées à l’avance et stockées hydratées pendant des heures à température ambiante avant d’être utilisées.
    3. Placez les micro-colonnes Oligo R3-C18-SPE conditionnées dans des tubes neufs de 1,5 mL avec des adaptateurs de microcentrifugeuse. Appliquez les mélanges de peptides digérés par le tryptique sur les micro-colonnes Oligo R3-C18-SPE et tournez à 2 000 x g pendant 60 s. Plusieurs cycles de chargement peuvent être nécessaires pour des volumes d’échantillon supérieurs à 50 μL.
    4. Laver les micro-colonnes Oligo R3-C18-SPE avec 50 μL de TFA à 0,1 % (v/v), 3x. Transférez les micro-colonnes Oligo R3-C18-SPE dans de nouveaux tubes de 1,5 mL en préparation de l’élution des peptides dessalés.
    5. Éluer les peptides dessalés en appliquant 50 μL d’AGZ à 0,1 % dans de l’ACN à 50 % (les deux v/v), puis 50 μL d’AFT à 0,1 % dans l’ACN à 70 % (les deux v/v) sur chaque micro-colonne d’Oligo R3-C18-SPE. Faites tourner après chaque étape.
      REMARQUE : Il est important de surveiller les micro-colonnes après chaque essorage pour s’assurer que la solution a été complètement essorée, car cela facilitera une élution efficace.
    6. Collectez, combinez et séchez les peptides dessalés dans un système de concentration sous vide.
      REMARQUE : Si vous effectuez une protéomique et une dés-N-glycoprotéomique parallèles (voir Discussion), divisez les échantillons de peptides dessalés et réservez des fractions distinctes avant le séchage.
  3. Enrichissement du N-glycopeptide à l’aide de ZIC-HILIC-C8-SPE
    1. Préparez des micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE faites maison comme décrit ci-dessous.
      1. À l’aide d’une seringue appropriée, branchez et transférez les disques C8 sur des pointes de pipette de 10 μL.
      2. Déposer une suspension de résine ZIC-HILIC dans du méthanol dans les micro-colonnes C8-SPE. Placez les micro-colonnes dans des tubes de 2 mL équipés d’adaptateurs de microcentrifugeuse pour vous assurer que les micro-colonnes sont suspendues au centre du tube et tournez-les pour créer des micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE d’une hauteur de colonne de ~1 cm (voir Figure 1iii). Préparez une micro-colonne ZIC-HILIC-C8-SPE pour chaque échantillon.
    2. Pour les étapes ultérieures de lavage et de chargement de l’échantillon, réglez une centrifugeuse de paillasse à 6 000 tr/min (~2 000 x g) et essorez-la pendant 60 s pour permettre aux phases mobiles de passer à travers les micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE. Lavez et conditionnez chaque micro-colonne ZIC-HILIC-C8-SPE séquentiellement avec 50 μL de méthanol, 3x, puis 50 μL d’eau ultrapure, 3x, et enfin 50 μL de TFA à 1 % dans 80 % (les deux v/v) ACN, 3x.
      REMARQUE : Les micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE peuvent être préparées des heures à l’avance, mais doivent être stockées hydratées à température ambiante avant d’être utilisées.
    3. Remettre en suspension les mélanges de peptides séchés destinés à l’enrichissement en N-glycopeptides dans 50 μL d’AGF à 1 % dans 80 % (v/v) d’ACN et bien mélanger.
      REMARQUE : Si les peptides sont difficiles à redissoudre dans le solvant de charge HILIC, les peptides peuvent d’abord être redissous dans un TFA à 10 % (v/v), puis rapidement dilués dans de l’ACN pour atteindre les concentrations du solvant de charge HILIC. Évitez de chauffer l’échantillon lorsqu’il est à forte concentration de TFA pour éviter d’induire une hydrolyse.
    4. Placez les micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE conditionnées dans des tubes neufs de 1,5 mL avec des adaptateurs de microcentrifugeuse. Appliquez les mélanges de peptides en suspension sur les micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE et tournez à 2 000 x g pendant 60 s. Plusieurs cycles de chargement peuvent être nécessaires pour des volumes d’échantillon supérieurs à 50 μL.
    5. Recueillir la ou les fractions de circulation et appliquer de nouveau la ou les fractions sur la même micro-colonne ZIC-HILIC-C8-SPE. Répétez l’application 2 fois et conservez les tubes à écoulement.
    6. Lavez les micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE 2x avec 50 μL de TFA à 1 % dans 80 % (v/v) ACN, essorez-les et combinez ce flux avec le flux continu de l’étape 3.3.4.
      REMARQUE : La fraction à flux continu combinée contient généralement ~90 % du matériel peptidique total, formant ainsi la fraction peptidique non modifiée qui, par conséquent, peut être utilisée pour une analyse en aval distincte (plutôt que de réaliser une expérience de type protéomique distincte).
    7. Transférez les micro-colonnes ZIC-HILIC-C8-SPE dans de nouveaux tubes de microcentrifugation à faible liaison de 1,5 ml. Éluer séquentiellement les N-glycopeptides retenus avec 50 μL d’AFT à 0,1 % (v/v), puis 50 μL de bicarbonate d’ammonium à 25 mM, puis 50 μL d’ACN à 50 % (v/v). Essorez à 2 000 x g pendant 60 s après chaque étape.
      REMARQUE : L’éluat contient généralement ~10 % du matériel peptidique total, dont la plupart devraient être des N-glycopeptides si une efficacité d’enrichissement élevée est atteinte. Il est important de surveiller les micro-colonnes après chaque essorage pour s’assurer que la solution a été complètement essorée, car cela facilitera une élution efficace.
    8. Collectez, combinez et séchez les N-glycopeptides enrichis et (si nécessaire) le flux de peptides non modifiés à travers les fractions dans un système de concentration sous vide.
  4. LC-MS/MS en phase inverse de N-glycopeptides intacts
    1. Préparez les solvants LC comme décrit ci-dessous.
      1. Solvant A : Préparez 1 L d’acide formique à 0,1 % (v/v) dans de l’eau ultrapure. Sonicate pendant 15 min pour dégazer le solvant. Le solvant A peut être stocké pendant un mois à 20-25 °C.
      2. Solvant B : Préparez 1 L d’acide formique à 0,1 % dans de l’ACN à 99,9 % (les deux v/v). Sonicate pendant 15 min pour dégazer. Le solvant B peut être stocké pendant un mois à 20-25 °C.
    2. Remettre en suspension les fractions peptidiques séchées dans de l’acide formique à 0,1 % (v/v) à une concentration d’environ 0,2 à 0,5 μg de peptide/μL et bien mélanger. Faites tourner les échantillons à 14 000 x g pendant 5 min, puis transférez soigneusement le surnageant dans des flacons d’échantillons MS, en laissant environ 0,5 μL derrière vous pour éviter de transférer des particules et des débris indésirables.
    3. Pour chaque échantillon, injecter ~0,5-1 μg de peptide total sur une colonne piège en C18-LC et séparer les peptides sur une colonne analytique en C18-LC à un débit constant de 250 nL/min à l’aide d’un système UPHLC connecté au spectromètre de masse avec un gradient de 2 % à 30 % de solvant B sur 100 min, 30 % à 50 % B sur 18 min, 50 % à 95 % B pendant 1 min, et 9 min à 95 % (tous v/v) B dans le solvant A (ou une configuration autrement appropriée).
    4. Détectez les peptides à l’aide d’un spectromètre de masse à haute résolution couplé au système nanoLC équipé d’une source d’ions nano-électronébuleuse et fonctionnant en mode de polarité ionique positive.
    5. Pour MS1, utilisez une plage de balayage d’acquisition de m/z 350-1 800, une haute résolution de 60 000 à 120 000 FWHM de m/z 200 et une tension source de ~2,5 kV. Réglez l’AGC sur 3 x 106 ions avec un temps d’accumulation maximal de 50 ms (ou d’autres paramètres appropriés).
    6. Pour la spectrométrie MS/MS, sélectionnez les 20 ions précurseurs les plus abondants de chaque balayage complet MS1 pour la fragmentation à l’aide du mode DDA en utilisant HCD-MS/MS avec un NCE fixe de 35 % ou sceHCD avec un NCE de 25 %, 35 % et 45 %. Il est important de fixer la valeur inférieure m /z à 110 (par exemple, plage de balayage m/z 110 - 1 800) pour observer tous les ions oxonium de faible masse dans chaque spectre de fragments.
    7. Sélectionnez les précurseurs qui portent plus de 2 charges (Z ≥ 2) pour la fragmentation. Acquisition de spectres (sce)HCD-MS/MS à une résolution de 30 000 à 45 000 FWHM à m/z 200 avec un AGC de 1 x 105 ions et un temps d’accumulation de 90 ms en utilisant une fenêtre d’isolement de précurseur de ± 1,0 Th. Activez l’exclusion dynamique de 30 s après l’isolement et la fragmentation uniques d’un ion précurseur donné.
      REMARQUE : Si l’ETD est disponible, envisagez également d’acquérir EThcD-MS/MS d’échantillons de N-glycopeptide intacts en utilisant le déclenchement ionique dépendant du produit. Effectuez cette étape lorsque les ions glycanes oxonium diagnostiques (par exemple, m/z 138.0545, 204.0867 et 366.1396) font partie des 20 principaux ions fragmentaires de chaque spectre HCD-MS/MS 39. Détectez les fragments EThcD-MS/MS à une résolution de 30 000 à 45 000 FWHM à m/z 200 avec une AGC de 4 x 105 ions, un temps d’injection de 250 ms, un HCD NCE de 15 % et une largeur d’isolement de précurseur de 1,6 Th.
  5. Analyse des données de glycoprotéomique LC-MS/MS
    1. Confirmer l’enrichissement des données brutes LC-MS/MS avec des N-glycopeptides en vérifiant que la plupart des spectres HCD-MS/MS contiennent des ions glycane-oxonium (par exemple, m/z 138.0545, 204.0867 et 366.1396) et (pour les stratégies de marquage) présentent une séparation de base des ions rapporteurs TMT de faible masse, une efficacité de fragmentation élevée dans les spectres MS/MS et une largeur de pic LC étroite, et une précision MS élevée, résolution et signal sur bruit.
    2. À l’aide d’un moteur de recherche (il en existe plusieurs ; voir ci-dessous), recherchez dans les données MS/MS des N-glycopeptides intacts dans une base de données de protéines/peptides appropriée ciblée sur l’échantillon étudié (par exemple, obtenue à partir d’une expérience de dés-N-glycoprotéomique) ou par rapport à toutes les protéines humaines UniProtKB examinées. Adaptez la recherche contre la N-glycosylation des peptides en recherchant des peptides avec une Asn localisée en séquons. Il est important de sélectionner une base de données N-glycanes basée sur la glycomique, c’est-à-dire les glycanes identifiés à partir des données glycomiques à l’étape 2, afin de restreindre l’espace de recherche aux glycanes dont l’existence est connue dans le ou les échantillons.
      REMARQUE : Des recherches parallèles à l’aide d’une large base de données prédéfinie de N-glycanes peuvent être envisagées pour exclure l’existence de compositions supplémentaires de N-glycanes dans les données.
    3. Adaptez les variables de recherche restantes en fonction de l’échantillon étudié, des procédures spécifiques de manipulation des échantillons effectuées, des paramètres MS utilisés et de l’instrumentation utilisée. Les paramètres de recherche courants pour la recherche de données N-glycoprotéomique sont les suivants :
      Tolérance de masse des précurseurs et du produit : 10 ppm et 20 ppm
      Spécificité de la protéase : Entièrement spécifique et/ou semi-spécifique (N-ragged)
      Décolletés manqués autorisés : 2
      Modifications corrigées : carbamidométhylation Cys (+57.021 Da)
      Modifications variables : Oxydation résiduelle (+15,994 Da) (commun 1)
      Modifications variables autorisées par peptide : 1 ou 2
      Modifications des glycanes : base de données de glycanes informée par Glycomics (rare 1)
      Base de données sur les leurres et les contaminants protéiques : Activé
    4. Filtrez toutes les recherches jusqu’à <1 % de taux de fausses découvertes (FDR) au niveau des protéines et des peptides. Ne tenir compte que des N-glycopeptides identifiés avec un niveau de confiance élevé (p. ex., scores PEP 2D < 0,001) et effectuer l’annotation/conservation manuelle de la sortie filtrée pour réduire davantage le taux d’identification incorrecte des N-glycopeptides, comme nous l’avons vu36, 40, 41.
      REMARQUE : Les glycopeptides avec des N-glycanes sialylés et multi-fucosylés et des glycopeptides portant d’autres modifications variables en plus des glycanes (c’est-à-dire l’oxydation Met et la désamidation Asn/Gln) sont particulièrement sujets à une mauvaise interprétation par les moteurs de recherche41. Une attention particulière devrait être accordée à la validation de ces candidats avant de faire rapport.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des résultats représentatifs de la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique appliquée à une lame de tissu FFPE provenant d’un patient souffrant de CCR au stade II sont fournis dans cette section.

Afin d’obtenir suffisamment de matériel de départ protéique pour le protocole, des extraits de protéines provenant de deux lames (piles z) ont été combinés à partir du même bloc de tissu FFPE conformément à un protocole publié et une approche de marquage TMT a été appliquée pour augmenter ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Étapes critiques du protocole
Dans cet article de protocole, nous avons décrit étape par étape la méthode de glycoprotéomique guidée par la glycomique, qui fournit une vue complète de l’hétérogénéité et de la dynamique du glycoprotéome dans le complexe TME.

Une étape critique du protocole consiste à assurer une protéolyse complète sans surdigérer le mélange de protéines. Les clivages non spécifiques des protéines augmentent intrinsèquement ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le THC est soutenu par une bourse du Programme international de formation en recherche financée par le gouvernement australien. Le Nouveau-Brunswick est soutenu par des bourses internationales d’excellence en recherche de l’Université Macquarie financées par l’Université Macquarie. AC est soutenu par une bourse du programme de formation à la recherche financée par le gouvernement australien. RK a été soutenu par le Cancer Institute of New South Wales (ECF181259). MTA est récipiendaire d’une bourse Future Fellowship (FT210100455) du Conseil australien de la recherche.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chemicals
Ammonium acétate  ;Sigma AldrichA1542Alternatives disponibles
Bicarbonate d’ammonium, pureté &ge ; 99.0 %Sigma AldrichA6141Alternatives disponibles
Acétonitrile anhydre (ACN), grade LC-MSSigma Aldrich34851Alternatives disponibles
Fétiine bovineSigma AldrichF3004Alternatives disponibles
Dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632Alternatives disponibles
EthanolSigma AldrichE7023Alternatives disponibles
Acide formique, grade LC-MSSigma Aldrich00940Alternatives disponibles
Acide acétique glaciaireSigma AldrichA6283Alternatives disponibles
Iodoacétamide (IAA)Sigma AldrichI1149Alternatives disponibles
MéthanolSigma AldrichM1775Alternatives disponibles
Peptide-N-glycosidase F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/&mu ; L) exprimée de manière recombinante chez Escherichia coli
Polyvinylpyrrolidone 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40Alternatives disponibles
Hydroxyde de potassium (KOH)Sigma Aldrich484016Alternatives disponibles
Trypsine porcine de qualité séquençage  ;PromegaV5113Alternatives disponibles
Borohydrure de sodium (NaBH4)Sigma Aldrich213462Alternatives disponibles
Bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), grade LC-MSSigma AldrichT7408Alternatives disponibles
Acide trifluoroacétique (TFA), grade LC-MSSigma AldrichT6508Alternatives disponibles
Tools/Materials
C18 disquesEmpore66883-U
Disques C8Empore66882-U
Plaque à fond plat en polypropylène 96 puits  ;Corning3364
Immobilon-PSQ membrane en polydifluorure de vinylidène (PVDF)MilliporeIPVH20200Taille des pores : 0,45 &mu ; m  ;
MicrocentrifugeuseEppendorf5452000069Alternatives disponibles
Adaptateurs de microcentrifugeuse  ;Le collier de colonne Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin, est livré avec des colonnes Microspin
Oligo R3 résine Thermo1133903taille de particule 30 &mu ; m
ParafilmParafilmM PM996
Tubes Protein LoBind 1,5 mLEppendorf0030108450
Tubes Protein LoBind 2,0 mLEppendorf0030108442
Tubes Safe-lock 1,5 mLEppendorf0030120086
Tubes Safe-lock 2,0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066Alternatives disponibles
Perforateur monotrouSwingline74005
Concentrateur SpeedVacMartin ChristRVC 2-25 CDplusAlternatives disponibles
Supelclean ENVI-Carb SPE résineSupelco57088Granulométrie 120-400 mesh. La résine peut être extraite manuellement des cartouches et peut être stockée à long terme dans du méthanol à 50 % (v/v) dans de l’eau MilliQ
Seringue 5 mLSigma AldrichZ116866Alternatives disponibles
Incubateur à température contrôléeThermolineE7.30Alternatives disponibles
Bain à ultrasonsUnisonicsFXPAlternatives disponibles
Résine ZIC-HILICMerck150455Taille des particules/pores, 5 &mu ; m/200 Å ;. La résine peut être extraite manuellement de la colonne LC et peut être stockée à long terme dans du méthanol à 50 % (v/v) dans de l’eau MilliQ
Micro-colonnes d’extraction en phase solide (SPE) ZipTip C18  ;MilliporeZTC18S096Alternativement, des micro-colonnes C18-SPE faites maison peuvent remplacer le produit commercial
LC-MS/MS Analysis
1260 Système HPLC capillaire Infinity  ;AgilentAlternatives disponibles
Colonne LC analytique pré-emballée avec la résine ReproSil-Pur C18 AQDr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Allemagner13.aq.s2570Taille des particules/pores : 3 &mu ; m/120 &�nbsp ;, longueur/diamètre intérieur : 25 cm/75 &mu ;m. Des colonnes nano-LC C18 commerciales sont également disponibles.
Système Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC  ;ThermoAlternatives disponibles
HyperCarb KAPPA PGC colonne LCThermoDiscontinuedTaille des particules/pores, 3 &mu ; m/250 Å ;; longueur de la colonne, 30 mm ; diamètre intérieur, 0,180 mm. Des géométries plus grandes des colonnes HyperCarb PGC-LC, produisant des données de qualité similaire, sont disponibles dans le commerce (par exemple, Thermo #35003-031030). Colonne SupelTMCarb LC de Merck avec une taille de particule/pore de 2,7 & m/200 et avec différentes longueurs de colonne et diamètres intérieurs sont également disponibles (par exemple, Merck #59994-U).  ;
LiChrosolvde qualité LCMS100029 alternatives disponibles
Spectromètre de masse à piège linéaire quadripolaire (LTQ) Spectromètre de masse à piège à ions Velos Pro (glycomique)  ;Alternatives thermiquesdisponibles
Spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (glycoprotéomique)ThermoD’autres systèmes MS haute résolution avec ou sans ETD (uniquement requis pour l’O-glycoprotéomique) sont également disponibles (par exemple, Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker ou spectromètres de masse haute performance similaires d’autres fournisseurs)
Total Recovery Flacons à vis en verre transparent 0,9 mLThermoTHC11093563Alternatives disponibles
Récupération totale Flacons à vis en verre transparent Bouchons assortisThermoTHC09150869Alternatives disponibles
Piège LC Colonne emballée en interne avec de la résine ReproSil-Pur C18 AQ  ;Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Allemagner15.aq.s0202Taille des particules/pores : 5 &mu ; m/120 Å ;, longueur/diamètre intérieur : 2 cm/100 &mu ;m. Des colonnes LC de piège C18 commerciales sont également disponibles.  ;
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 ou supérieurMoteur de recherche commercial de glycopeptides et de PTM, acceptant les données brutes LC-MS/MS de la plupart des fournisseurs de MS Byos
Protein Metrics Incv3.9-7 ou supérieurLogiciel commercial pour l’inspection manuelle des candidats glycopeptides et l’annotation automatique des spectres MS/MS de glycanes
GlycoModExpasyLogiciel en libre accès, aide à l’annotation des données glycomiques (https://web.expasy.org/glycomod/)
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1Logiciel en libre accès, aide à l’annotation des données glycomiques et au dessin de dessins animés de glycanes
RawMeatVAST Scientificv2.1Logiciel en libre accès, extraction m/z d’ions précurseurs de glycanes à partir de données spectrales brutes
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 ou supérieurLogiciel en libre accès pour la quantification relative des glycanes
XcaliburThermov2.2 ou supérieurPour la navigation dans les données brutes LC-MS/MS
capillaireAcétonitrile

Références

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Microenvironnement tumoralSpectrom trie de masseStructures des glycanesProfilage du N glycoprot omeCarbone graphit poreuxLC MS MSEnrichissement en glycopeptidesGlycosylation site sp cifiqueTissu canc reux colorectal

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