Article de méthode

Ingénierie de cellules tueuses naturelles à récepteur antigénique chimérique ciblant les infections fongiques à l’aide du système de transposon non viral de la Belle au bois dormant

DOI :

10.3791/67424

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4 octobre 2024

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1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons un protocole de transfection pour produire des cellules tueuses naturelles à récepteur antigénique chimérique (CAR-NK) ciblant les agents pathogènes fongiques à l’aide du système de transposon non viral de la Belle au bois dormant. Pour évaluer l’activation spécifique de l’antigène, nous avons co-cultivé les cellules modifiées avec des tubes germinaux d’Aspergillus fumigatus et mesuré la sécrétion d’IFN-γ.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les thérapies cellulaires basées sur les récepteurs antigéniques chimériques (CAR) ont montré une efficacité impressionnante dans le traitement des hémopathies malignes. Récemment, ces thérapies ont été développées pour les maladies infectieuses, mais les études ciblant les infections fongiques restent rares. Afin d’identifier les cibles optimales et d’optimiser les produits cellulaires, nous avons développé une méthode pour concevoir des cellules car-NK (Chimeric Antigen receptor-natural killer) et évalué leur réponse à la stimulation par des champignons. Cet article décrit une méthode simple et robuste pour générer des cellules CAR-NK adaptées à des cibles fongiques à l’aide du système de transposon non viral de la Belle au bois dormant. Les cellules NK-92 sont transfectées avec la transposase hyperactive SB100X vectorisée sous forme d’ADN mini-cercle (MC) avec un transposon CAR codé par plasmide. L’efficacité de la transfection est évaluée 1 semaine plus tard à l’aide d’une analyse par cytométrie en flux. Avant les tests fonctionnels, les cellules exprimant le transgène sont enrichies à l’aide d’un tri cellulaire activé par magnétisme et cultivées pendant 1 semaine supplémentaire. Pour évaluer l’activation spécifique de l’antigène, les cellules modifiées sont co-cultivées avec des tubes germinaux d’Aspergillus fumigatus pendant au moins 6 h. Par la suite, la concentration de l’interféron gamma sécrété (IFN-γ) est mesurée à l’aide d’un dosage immuno-enzymatique.

Introduction

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Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) est un champignon omniprésent, une personne moyenne inhalant entre 100 et 1 000 conidies parjour1. Chez les patients atteints d’immunodéficiences acquises ou congénitales, tels que ceux qui suivent une chimiothérapie ou qui souffrent de leucémie, A. fumigatus peut entraîner une apsergillose invasive sévère. Chaque année, plus de 200 000 personnes dans le monde contractent l’aspergillose. Malgré l’utilisation d’antimycosiques pour la prévention et le traitement avec des dérivés azolés, le taux de mortalité reste entre 30 % et 95 %2,3. De plus, le traitement a des effets secondaires importants, et 7 % des cultures d’A. fumigatus sont déjà résistantes aux azoles4.

La thérapie avec des lymphocytes T modifiés par le récepteur antigénique chimérique (CAR) a montré un succès clinique dans le traitement des maladies malignes et a obtenu des résultats précliniques prometteurs dans la lutte contre les maladies infectieuses telles que l’aspergillose invasive 5,6,7,8. Nos cellules Af-CAR-T précédemment décrites ciblant une protéine dans la paroi cellulaire des hyphes d’A. fumigatus ont montré des résultats prometteurs dans des modèles précliniques6.

Le risque réduit de maladie du greffon contre l’hôte, de syndrome de libération de cytokines et de neurotoxicité fait des cellules CAR-NK une alternative précieuse aux cellules CAR-T en tant que traitement « prêt à l’emploi » pour les infections aiguës9. De plus, il a été démontré que les cellules NK jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire antifongique. Lorsqu’elles sont stimulées par A. fumigatus, les cellules NK sécrètent des cytokines telles que l’IFN-ɣ et des chimiokines comme CCL-3 et CCL-4 et libèrent des granules cytotoxiques10,11.

La lignée cellulaire NK-92 est une source populaire de cellules NK pour le génie génétique, offrant l’avantage d’une prolifération et d’une expansion rapides dans des conditions de culture relativement simples12. Plusieurs études précliniques ont démontré le potentiel thérapeutique des cellules NK-92 transduites par les cellules CAR-92 dans le traitement des tumeurs hématologiques et solides. De nombreux essais cliniques sont en cours pour étudier leur innocuité, leur efficacité et leur utilisation potentielle en tant que thérapie cellulaire « prête à l’emploi »13.

Il est difficile d’obtenir des efficacités de transfection élevées et une expression stable des transgènes dans les cellules NK. Bien que les méthodes virales promettent des efficacités élevées, elles comportent le risque de mutations d’insertion avec oncogenèse ultérieure 9,14. La dernière génération de vecteurs transposons de la Belle au bois dormant (SB) offre un système sûr, puissant et économiquement viable pour un transfert de gènes stable, surmontant les limites des méthodes d’administration de gènes viraux et transitoires non viraux15.

Par conséquent, ce protocole décrit une nouvelle méthodologie pour la génération de cellules Af-CAR-NK-92, qui peuvent potentiellement servir d’option thérapeutique « prête à l’emploi » pour les patients atteints d’aspergillose invasive potentiellement mortelle. L’efficacité de cette approche est illustrée par l’augmentation de la production d’IFN-ɣ lors de la stimulation avec des hyphes d’A. fumigatus .

Protocole

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Toutes les expériences décrites ici doivent être menées dans des conditions stériles. Dans ce protocole, nous montrons deux conditions : (I) une transfection simulée sans ADN qui servira de contrôle et (II) une transfection CAR à l’aide de l’Af-CAR6 décrit précédemment. Le plasmide Af-CAR contient une séquence tronquée du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFRt) en aval du CAR, qui sera utilisée comme marqueur de transfection (figure supplémentaire S1). Pour chaque condition, 4 × 106 cellules NK-92 sont nécessaires.

1. Culture des cellules NK-92

  1. Un ou deux jours avant la transfection, préparez un milieu de culture cellulaire frais avec la composition suivante : 75 % (v/v) de milieu alpha-MEM (avec nucléosides) + 12,5 % (v/v) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS) + 12,5 % (v/v) de sérum de cheval inactivé par la chaleur + 2 mM de L-glutamine.
  2. Remettre en suspension au moins 107 cellules NK-92 à une densité cellulaire de 5 × 105 cellules/mL.
  3. Ajouter l’IL-2 à la suspension cellulaire à une concentration de 150 UI/mL.
  4. Cultivez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
    REMARQUE : L’IL-2 peut être utilisée à une concentration finale de 5 ng/mL.

2. Transfection non virale

  1. Vérifiez la qualité des cellules au microscope. Une suspension d’amas de cellules et un fond clair indiquent une culture cellulaire saine.
  2. Dans une plaque à 6 puits, ajouter 2 mL de milieu de culture cellulaire par puits pour chaque condition. Placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
    REMARQUE : Les antibiotiques peuvent réduire la viabilité cellulaire après la transfection. Gardez le milieu sans antibiotiques.
  3. Comptez les cellules et vérifiez la viabilité cellulaire à l’aide (p. ex., coloration au bleu de trypan).
  4. Transférer 8 × 106 cellules NK-92 dans un tube à fond conique de 15 ml. Centrifugeuse à 200 × g pendant 5 min avec une accélération et une décélération de 3. Utilisez ce programme pour toutes les étapes de centrifugation suivantes.
  5. Pendant la centrifugation, préparez deux tubes de réaction de 1,5 ml. Pipeter l’ADN d’Af-CAR (8 μg d’ADN plasmidique et 4 μg de SB100X Mini Circle, tableau 1) dans l’un des tubes. Gardez le second sans ADN pour être un contrôle fictif.
  6. Lorsque la centrifugeuse est prête, jetez délicatement le surnageant et remplissez le tube contenant les cellules avec jusqu’à 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée.
  7. Centrifugeuse (étape 2.4).
  8. Pendant la centrifugation, préparer un tube du système de transfection pour chaque condition en ajoutant 3 mL de tampon électrolytique dans chaque tube. Placez le premier tube dans la station de pipette.
  9. Lorsque la centrifugeuse est prête, jetez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon de remise en suspension (100 μL/4 × 106 cellules).
    REMARQUE : Évitez de laisser les cellules en suspension tampon pendant plus de 15 à 30 minutes, car cela réduit la viabilité des cellules et l’efficacité de la transfection.
  10. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire dans chacun des deux tubes de réaction. Mélangez délicatement.
    REMARQUE : Évitez les bulles d’air pendant le pipetage, car les bulles d’air provoquent des arcs électriques, ce qui entraîne la mort cellulaire.
  11. Pipetez le mélange ADN-cellule du premier tube de réaction à l’aide de la pipette du système de transfection et insérez la pipette verticalement dans le tube placé dans la station de pipette.
    REMARQUE : Assurez-vous que l’embout est bien ajusté.
  12. Réglez la première impulsion sur 1 650 V et la durée d’impulsion sur 20 ms , puis appuyez sur Démarrer.
  13. Une fois l’opération terminée, réglez la deuxième impulsion sur 500 V et le temps d’impulsion sur 100 ms. Appuyez sur Démarrer.
  14. Une fois l’opération terminée, retirer lentement la pipette de la station de pipette et transférer immédiatement les cellules dans un puits de la plaque de culture préparée contenant 2 ml de milieu de culture cellulaire préchauffé (voir l’étape 2.2). Déplacez doucement la plaque dans le sens du cercle pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties.
  15. Pour l’échantillon fictif, prélever 100 μL de suspension cellulaire dans le tube de réaction sans ADN (voir l’étape 2.9) et répéter la même procédure de l’étape 2.11 à l’étape 2.14, en utilisant un nouveau tube et une nouvelle pointe de pipette.
  16. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2.
  17. Après 30 min d’incubation, ajouter l’IL-2 à une concentration finale de 150 UI/mL.

3. Vérification de l’efficacité de la transfection par cytométrie en flux

  1. Après 1 semaine de culture et de division des cellules tous les deux jours, prenez 1 à 5 × 105 cellules de chaque condition dans un tube à fond rond en polystyrène.
  2. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de tampon (PBS + 0,5 % (v/v) FBS + 2 mM EDTA) ; centrifuger et jeter le surnageant.
  3. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 50 μL de tampon. Ajouter 1 μL de 7-AAD pour détecter les cellules mortes.
  4. Ajoutez 5 μL d’anticorps anti-tEGFR-Alexa fluor 647 pour colorer les cellules transfectées.
  5. Incuber pendant 20 min à 4 °C.
  6. Lavez les cellules (voir étape 3.2).
  7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de tampon.
  8. Mesurez les échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux.
    REMARQUE : Si l’efficacité de la transfection n’est pas satisfaisante, procédez à l’enrichissement des cellules exprimant le transgène.

4. Enrichissement des cellules exprimant des transgènes par tri cellulaire activé magnétiquement (MACS)

REMARQUE : Pour des résultats optimaux, commencez le protocole avec 8-10 × 106 cellules. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 4 °C.

  1. Préparez la mémoire tampon comme décrit à l’étape 3.2. Diluer les cellules à une concentration de 1-2 × 106/100 μL avec le tampon dans un tube à fond conique de 15 ml.
  2. Ajoutez 1 μL d’anti-EGFRt-biotine par 1-2 × 106 cellules, et agitez doucement le tube pour assurer une solution uniformément répartie.
  3. Incuber pendant 25 min à 4 °C, puis remplir le tube avec jusqu’à 10 mL de tampon.
  4. Centrifugeuse. Jetez le surnageant.
  5. Ajouter 8 μL/1 × 106 cellules de tampon froid.
  6. Ajouter 2 μL de billes magnétiques anti-biotine par 1 × 106 cellules.
  7. Incuber pendant 15 min à 4 °C.
  8. Laver en remplissant jusqu’à 10 ml de tampon.
  9. Centrifugeuse. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 500 μL de tampon.
  10. Placez une colonne LS dans l’aimant MACS et lavez-la avec 3 ml de tampon.
  11. Dès que le tampon a complètement migré à travers la colonne, ajoutez la suspension de cellule.
  12. Laver la colonne 3 fois, chacune avec 3 ml de tampon.
  13. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube à fond conique propre de 15 ml.
  14. Ajouter 5 mL de tampon dans la colonne. À l’aide du piston, rincez les cellules EGFR-positives le plus rapidement possible.
  15. Cultivez les cellules pendant quelques jours ; Ensuite, vérifiez l’efficacité par cytométrie en flux.

5. Tests fonctionnels

REMARQUE : Pour l’expérience à venir, préparez et utilisez le support suivant : RPMI + 20 % FBS.

  1. Jour 1 - Ensemencement des conidies d’Aspergillus fumigatus
    1. Préparez une suspension de conidies d’A. fumigatus à une concentration de 2,5 × 105 conidium/mL dans le milieu.
    2. Dans une plaque de culture de 96 puits, pipeter 100 μL de suspension de conidies par puits et incuber à 25 °C pendant 16 h.
      REMARQUE : Après la période d’incubation, les conidies germeront (figure 1).
  2. Jour 2 - Co-culture avec des cellules CAR NK-92
    1. Lavez les cellules Mock et Af-CAR NK-92 2x avec le fluide.
    2. Co-culture avec le champignon à un rapport effecteur-cible de 2:1 en ajoutant 5 × 104 cellules dans 100 μL de milieu par puits (figure 2).
    3. Pour un contrôle positif, ajouter 1 ng de PMA et 100 ng d’ionomycine par puits dans 100 μL de milieu. N’utilisez les cellules dans le milieu que comme contrôle négatif.
    4. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur de CO2 humidifié pendant au moins 6 h.
    5. Centrifuger la plaque à 300 × g pendant 5 min.
    6. Récolter 100 μL de chaque puits ; Évitez de toucher le fond. Transférez les surnageants dans des tubes à réaction.
      REMARQUE : Assurez-vous que seul le surnageant est pipeté et non le champignon cultivé. En cas de doute, ajoutez une autre étape de centrifugation.
    7. Effectuer l’ELISA IFN-ɣ en suivant les instructions du fabricant ou conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à l’utilisation.

Résultats

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L’ensemble du processus de génération des cellules Af-CAR NK-92, y compris la transfection, la récupération, l’enrichissement et l’expansion, prend environ 14 jours. Après la transfection, les cellules sont cultivées et divisées tous les deux jours. La viabilité cellulaire peut diminuer au cours de la première division deux jours après la transfection. En règle générale, les cellules récupèrent 4 jours après la transfection et commencent à proliférer, avec un temps de doublement de 48 h.

Après la récupération, les efficacités de transfection sont mesurées et devraient atteindre 10 à 20 % (résultats représentatifs illustrés à la figure 3). L’enrichissement des cellules EGFR-positives via MACS augmente le pourcentage de cellules Af-CAR NK-92 à plus de 95 % (résultats représentatifs illustrés à la figure 4).

Des cultures contenant plus de 95 % de cellules Af-CAR ont été utilisées pour des tests fonctionnels. Ici, nous avons co-cultivé les cellules avec des tubes germinaux d’A. fumigatus pendant 6 h et mesuré la sécrétion d’IFN-ɣ comme marqueur d’activation. Comme le montre la figure 5, les cellules Af-CAR ont montré une sécrétion significative de cytokines (moyenne = 340,6 ± 86,5 pg/mL) par rapport aux cellules Mock NK-92 (moyenne = 75,6 ± 19,5 pg/mL), ce qui indique une activation nettement plus élevée des cellules Af-CAR (valeur p = 0,03).

figure-results-1
Figure 1 : Tubes germinatifs d’Aspergillus fumigatus. Image microscopique d’A. fumigatus après 16 h d’incubation. Des tubes germinaux/petits hyphes sont observés et répartis de manière homogène autour du puits. Barre d’échelle = 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Co-culture de tubes germinaux d’Aspergillus fumigatus avec des cellules NK-92. Image microscopique de la co-culture. Les cellules NK-92 forment des grappes et sont en contact avec les tubes germinaux d’A. fumigatus. Barre d’échelle = 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Efficacité de transfection évaluée par coloration pour le marqueur de transfection EGFR. Le jour 5, après l’électroporation, les cellules NK-92 ont été colorées avec du 7-AAD et de l’anti-EGFR. Les résultats sont présentés pour une expérience représentative pour (A) les cellules Mock et (B) les cellules Af-CAR NK-92. La colonne de gauche montre des diagrammes à points de la taille des cellules en fonction de la granularité des cellules ; la porte est placée sur les cellules NK-92. Les cellules mortes sont éliminées à l’aide de l’étiquetage 7-AAD (deuxième colonne). Le pourcentage de cellules EGFR+ vivantes est indiqué dans la troisième colonne. Abréviations : EGFR = récepteur du facteur de croissance épidermique ; 7-AAD = 7-aminoactinomycine D ; CAR = récepteur antigénique chimérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Résultats de la coloration de la surface cellulaire après enrichissement des cellules NK-92 exprimant le transgène. Sur la gauche, les cellules Mock sont affichées. Sur la droite, les cellules Af-CAR-NK sont représentées. Les histogrammes rouges représentent les cellules non colorées. Les histogrammes bleus représentent les cellules colorées correspondantes. La porte est placée sur les cellules EGFR+ ; Les chiffres indiquent le pourcentage de cellules positives. Abréviations : EGFR = récepteur du facteur de croissance épidermique ; CAR = récepteur antigénique chimérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Sécrétion de cytokines par les cellules NK activées par les tubes germinaux d’Aspergillus fumigatus. Les diagrammes présentent les résultats de la sécrétion d’IFN-ɣ de cellules Af-CAR et Mock en co-culture avec des champignons mesurés par ELISA après 6 h de co-culture. Les données présentées sont la moyenne ± l’écart-type de trois expériences réalisées indépendamment (n = 3). Valeur p calculée par le test t de Welch à l’aide de GraphPad Prism 10, * p < 0,05. Abréviations : NK = tueur naturel ; IFN-ɣ = interféron gamma ; CAR = récepteur antigénique chimérique ; ELISA = dosage immuno-enzymatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

NomCompagnieConcentration des stocksRéférence
TransposaseSB100X Mini CerclePlasmidFactory1 μg/μL19
TransposonPlasmide Af-CARProduit en interne1 μg/μL6

Tableau 1 : ADN utilisé dans ce protocole.

Figure supplémentaire S1 : Carte plasmidique du transposon Af-CAR : Schéma du vecteur plasmidique et conception du transposon CAR. Abréviations : EF1 = facteur d’allongement-1 alpha promoteur ; ORI = origine bactérienne de la réplication ; LIR = répétition inversée à gauche ; RIR : répétition inversée à droite ; Cyto = cytoplasmique ; Tm = Transmembranaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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Le protocole fourni offre une méthode simple et fiable pour créer des cellules CAR-NK qui ciblent les agents pathogènes fongiques à l’aide du système de transposon non viral de la Belle au bois dormant. Cette méthode permet l’insertion stable et permanente de grands transgènes, ce qui permet l’expansion des cellules pour obtenir les quantités nécessaires à une analyse plus approfondie14,16.

Plusieurs facteurs clés peuvent avoir un impact sur le succès de la transfection, notamment le nombre et la viabilité des cellules, l’intensité et la durée de l’impulsion, ainsi que la qualité et la quantité d’ADN17. Il est crucial d’évaluer la santé des cellules avant de commencer, en veillant à ce qu’elles soient viables à au moins 90 %. Il a été démontré qu’une force d’impulsion élevée peut améliorer l’efficacité de transfection d’une population cellulaire. Cependant, cette approche peut également entraîner une réduction significative de la viabilité cellulaire. Dans les cas où il y a un excès de cellules et une quantité ou une qualité limitée d’ADN, le nombre de cellules qui absorbent avec succès le plasmide peut être insuffisant17. Néanmoins, il a été démontré que de fortes concentrations d’ADN sont toxiques et réduisent la viabilité cellulaire18.

Des études antérieures ont permis d’obtenir des efficacités de transfection plus élevées, mais se sont concentrées uniquement sur l’expression transitoire des protéines17. En revanche, notre protocole assure une insertion stable du transgène. Pour remédier à la faible efficacité de la transfection, nous avons mis en œuvre l’enrichissement des cellules transfectées positivement et avons atteint environ 95 % de cellules exprimant des CAR. Cependant, cela a augmenté le temps de production à ~1 semaine. Si des temps de production plus courts sont souhaités, l’ADN du transposon pourrait être livré sous forme de minicercle, ce qui peut améliorer l’efficacité de la transfection et éliminer la nécessité de l’étaped’enrichissement 19. Néanmoins, le temps de production ne peut pas être réduit à <1 semaine pour permettre la récupération et la prolifération cellulaires.

Étant donné la nature aiguë de l’aspergillose invasive, des thérapies cellulaires « prêtes à l’emploi » seraient bénéfiques. Les défis et les coûts associés à l’isolement des cellules des patients et à l’expansion des cellules primaires ont accru la popularité du NK-92 en tant que lignée cellulaire pratique pour la production de cellules CAR-NK20. Les cellules NK-92 sont généralement robustes et prolifèrent rapidement en présence d’IL-2, ce qui facilite l’obtention de grandes quantités de cellules dans un laps de temps relativement court. À la lumière de ces avantages, nous avons développé un protocole d’ingénierie génétique des cellules NK-92, démontrant qu’il est possible de transfecter et de préparer en toute sécurité des produits cellulaires CAR-NK avec une grande pureté. Bien que ce protocole puisse être adapté pour préparer des cellules CAR-NK primaires, plusieurs modifications sont à envisager. Il s’agit notamment d’optimiser le nombre et l’intensité des impulsions, la quantité d’ADN utilisée et d’établir un protocole d’expansion approprié. Toute modification du protocole nécessiterait une enquête approfondie pour en assurer l’efficacité. Néanmoins, notre protocole fournit un modèle fondamental qui pourrait être adapté pour les cellules NK primaires dans de futures expériences.

En résumé, ce protocole de transfection innovant pour produire des cellules Af-CAR-NK stables est une méthode efficace et reproductible qui peut être utilisée pour cibler d’autres maladies. De plus, il pourrait être utilisé comme une méthode rentable pour dépister de nouveaux CAR ciblant une variété d’antigènes.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.H. : Inventeur sur des demandes de brevets et des brevets accordés liés à la technologie CAR, concédés sous licence en partie à l’industrie. Cofondateur et actionnaire de T-CURX GmbH, Würzburg. Honoraires des conférenciers : BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Soutien à la recherche : BMS. M. B. rapporte une aide au voyage de la société pharmaceutique « Eli Lilly and company », qui n’est pas liée à cette étude. Les autres auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

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Le financement et le soutien du projet ont été fournis par Wilhelm Sander Stiftung, le projet 2020.017.1 à M.H., et J.L. ; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Collaborative Research Center/Transregio 124 Champignons pathogènes et leur hôte humain : réseaux d’interaction-FungiNet ; projet A8 à M.H. et H.E.).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à fond conique de 15 MLGreiner Bio-One188271PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STÉRILE Tubes
fond conique de 50 MLGreiner Bio-One227270PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STÉRILE
6 et 96 puits- Plaque de culture cellulaireCorning Inc. LifeSciences83-3736/ 83-3474Plaques à puits multiples traitées TC, Fond plat, Traitées pour une fixation optimale des cellules, Stérilisées par irradiation gamma,
7-AAD apyrogène (7-aminoactinomycine D)BD Biosciences559925colorant d’acide nucléique facile à utiliser pour l’exclusion des cellules non viables dans les tests de cytométrie en flux
Alexa Fluor 647 anti-EGFR humain AnticorpsBiolegend352918Clone AY13
Microbilles anti-biotine UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637Microbilles UltraPure conjuguées à l’anti-biotine de souris monoclonale anticorps
Aspergillus fumigatusATCC46645
Embouts filtrants de la biosphère (20 et 100 &mu ; L)  ;Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco&prime ; s Saline tamponnée phosphate (PBS)Sigma-AldrichD8537  ; Modifié, sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium, liquide, filtré stérilement, adapté à la culture cellulaire, endotoxine, testé
ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-&gamma ;Biolegendd’acide
éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma-AldrichE7889pour la biologie moléculaire, 0,5  ; M dans H2O, DNase, RNase, NICKase et protéase, aucun détecté, 0,2 &mu ; m filtré.
FACS cleanBD Biosciences340345
FACS Fluide de gaine d’écoulementBD Biosciences342003
Solution de rinçage FACSBD Bioscience340346
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma-AldrichF7524filtré de manière stérile, adapté à la culture cellulaire, inactivé thermiquement avant utilisation
Gibco, MEM &alpha ;, nucléosidesThermofisher Scientific22571020Rouge de phénol, ribonucléosides, désoxyribonucléosides, bicarbonate de sodium
Sérum de chevalThermo Fisher Scientific16050122Stérile-filtré, inactivé à la chaleur avant utilisation
IL-2 IS humain, qualité rechercheMiltenyi Biotec130-097-742qualité recherche. L’ED50 est &le ; 0,3 ng/mL, correspondant à une activité de &ge ; 3 & fois ; 106 UI/mg.
IonomycineSigma-AldrichI0634-1MGde Streptomyces conglobatus, utilisée comme contrôle positif pour la sécrétion de cytokines  ;
L-GlutamineSigma-AldrichW368401Pour culture cellulaire
MACS LS ColonneMiltenyi Biotec130-042-401  ; Colonnes et pistons, stériles
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfektionssystem 100  ; &mu ; L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096Tampon de remise en suspension R, Tampon électrolytique E2, 100 &mu ; L Embouts néon, Tubes d’électroporation au néon
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGutilisé comme contrôle positif pour la sécrétion de cytokines  ;
Tube en polystyrène à fond rond, 5 mLBD BioscienceS-452400utilisé pour la cytométrie en flux
Tube de réaction, 1,5 MLGreiner Bio-One7,26,90,001PP, transparent, capuchon fixé, avec graduation injectée. Stérilisé avant utilisation.
RPMI 1640 Moyen, GlutaMAXThermo Fisher Scientific72400021GlutaMax I,  ; Rouge de phénol, HEPES, TipOne
1000 &mu ; L XL Pointe Filtrante GraduéeStarLabS1122-1730
fort
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2 Incubateur C60  ;Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX laveuse de microplaques  ;Tecan
NanoQuant Infinite M200 ProTecan Neon
Transfection SystemInvitrogen
Pipettes  ;Séparateur Eppendorf
Quadro MACS  ;Miltenyi Biotec
à 430104 Solution de sel disodique

Références

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  1. Fang, W., Latgé, J. -P. Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen. Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).
  2. Brown, G. D., et al. Hidden killers: Human fungal infections. Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).
  3. Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan. PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).
  4. Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).
  5. Seif, M., Einsele, H., Löffler, J. CAR T cells beyond cancer: Hope for immunomodulatory therapy of infectious diseases. Front Immunol. 10, 2711(2019).
  6. Seif, M., et al. CAR T cells targeting Aspergillus fumigatus are effective at treating invasive pulmonary aspergillosis in preclinical models. Sci Transl Med. 14 (664), eabh1209(2022).
  7. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  8. Kumaresan, P. R., et al. A novel lentiviral vector-based approach to generate chimeric antigen receptor T cells targeting Aspergillus fumigatus. mBio. 15 (4), e0341323(2024).
  9. Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies. Front Oncol. 11, 720501(2021).
  10. Robertson, M. J., Ritz, J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 76 (12), 2421-2438 (1990).
  11. Ziegler, S., et al. CD56 is a pathogen recognition receptor on human natural killer cells. Sci Rep. 7 (1), 6138(2017).
  12. Esmaeilzadeh, A., Hadiloo, K., Jabbari, M., Elahi, R. Current progress of chimeric antigen receptor (car) t versus car nk cell for immunotherapy of solid tumors. Life Sci. 337, 122381(2024).
  13. Zhang, J., Zheng, H., Diao, Y. Natural killer cells and current applications of chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells in tumor immunotherapy. Int J Mol Sci. 20 (2), 317(2019).
  14. Hu, Y., Tian, Z. G., Zhang, C. Chimeric antigen receptor (CAR)-transduced natural killer cells in tumor immunotherapy. Acta Pharmacol Sin. 39 (2), 167-176 (2018).
  15. Hudecek, M., et al. Going non-viral: The Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side. Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).
  16. Amberger, M., Ivics, Z. Latest advances for the Sleeping Beauty transposon system: 23 years of insomnia but prettier than ever. BioEssays. 42 (11), 2000136(2020).
  17. Ingegnere, T., et al. Human car nk cells: A new non-viral method allowing high efficient transfection and strong tumor cell killing. Front Immunol. 10, 957(2019).
  18. Stacey, K. J., Ross, I. L., Hume, D. A. Electroporation and DNA-dependent cell death in murine macrophages. Immunol Cell Biol. 71 (Pt 2), 75-85 (1993).
  19. Monjezi, R., et al. Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors. Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).
  20. Moscarelli, J., Zahavi, D., Maynard, R., Weiner, L. M. The next generation of cellular immunotherapy: Chimeric antigen receptor-natural killer cells. Transplant Cell Ther. 28 (10), 650-656 (2022).

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