Article de méthode

Progrès dans les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique dérivé de cellules souches pluripotentes humaines induites

DOI :

10.3791/67438

⸱

14 février 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons une méthode pour différencier et étendre les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) humain dérivé de l’iPSC avec une meilleure destruction contre diverses tumeurs malignes. Ce protocole démontre la différenciation et l’expansion des cellules CAR-NK dérivées d’iPSC optimisées pour les tueurs naturels (NK) et la mesure de l’activité antitumorale contre diverses lignées cellulaires tumorales.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des cellules immunitaires innées qui jouent un rôle crucial dans la défense de l’organisme contre les tumeurs et les infections virales. La génération de cellules NK exprimant des cellules NK dérivées de cellules souches pluripotentes pluripotentes induites humaines (iPSC) est apparue comme une voie prometteuse pour l’immunothérapie anticancéreuse « prête à l’emploi ». Ici, nous avons utilisé une construction CAR optimisée pour les cellules NK qui comprend le domaine transmembranaire de NKG2D, le domaine co-stimulateur 2B4 et le domaine de signalisation CD3ζ, dont il a été démontré qu’il stimule une activité antitumorale robuste médiée par les cellules NK spécifiques de l’antigène. L’utilisation d’iPSC pour la génération de cellules CAR NK offre plusieurs avantages, notamment l’expression homogène des CAR, l’évolutivité, la reproductibilité et le potentiel d’application clinique. Ce protocole détaillé, étape par étape, de l’ingénierie cellulaire à la différenciation, permet de générer des cellules NK optimisées pour les cellules NK, dérivées d’iPSC et exprimant des cellules NK, fournissant une immunothérapie anticancéreuse standardisée et ciblée avec une activité antitumorale améliorée et mettant en évidence leur potentiel en tant qu’option de traitement prometteuse pour diverses tumeurs malignes.

Introduction

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Les cellules NK, un type de lymphocyte au sein du système immunitaire inné, sont essentielles à la défense précoce contre les tumeurs et les cellules infectées par le virus 1,2,3. Contrairement aux lymphocytes T, les lymphocytes NK n’ont pas besoin de présenter l’antigène via les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Au lieu de cela, les cellules NK ont un répertoire de récepteurs activateurs et inhibiteurs qui régulent leur activité3. L’activité cytotoxique médiée par les cellules NK utilise divers mécanismes, notamment la libération de perforine et de granzymes, l’engagement des récepteurs de mort et la production de cytokines pro-inflammatoires telles que l’IFN-γ et le TNF-α. Ce mode d’action unique positionne les cellules NK comme un candidat attrayant pour l’immunothérapie du cancer, en particulier dans le traitement des cancers solides où l’évasion immunitaire est un obstacle important 1,2,3,4.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l’une des formes les plus courantes et les plus mortelles de cancer du foie dans le monde5. Les approches thérapeutiques traditionnelles, y compris la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, offrent généralement un bénéfice clinique limité et entraînent des taux de récidive élevés 6,7. Les progrès récents de l’immunothérapie et de la thérapie ciblée ont eu un impact significatif sur le traitement du CHC 8,9. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires, comme le nivolumab et le pembrolizumab, ont montré des résultats prometteurs en améliorant la réponse des cellules immunitaires contre les cellules cancéreuses10,11. Ces thérapies ont permis d’améliorer les taux de survie et la qualité de vie de certains patients. Cependant, ils peuvent également provoquer des effets indésirables liés au système immunitaire, ce qui peut limiter leur utilisation chez certains patients12. Les traitements ciblés, tels que le sorafénib et le lenvatinib, inhibent spécifiquement les voies qui favorisent la croissance des cellules cancéreuses et l’angiogenèse13. Ces traitements ont une efficacité connue pour contrôler la progression de la maladie et prolonger la survie 8,14. Néanmoins, une résistance aux thérapies ciblées se développe généralement et les effets secondaires du traitement sont fréquents15,16. Parmi les pistes prometteuses dans les stratégies immunothérapeutiques du cancer, l’avènement des cellules CAR-T à récepteur antigénique chimérique (CAR) a révolutionné le traitement du cancer, en particulier dans le traitement des hémopathies malignes telles que le lymphome et le myélome multiple 17,18,19.

Les cellules NK exprimant des CAR, combinant l’activité cytotoxique innée des cellules NK avec le ciblage précis de la technologie CAR, représentent une approche innovante et potentiellement transformatrice pour les tumeurs solides telles que le CHC 20,21,22,23,24. Les cellules modifiées par le CAR peuvent reconnaître et tuer spécifiquement les cellules tumorales exprimant l’antigène cible tout en épargnant les tissus normaux, réduisant ainsi le risque d’effets hors cible associés aux thérapies conventionnelles 25,26,27. Les cellules CAR-NK produites à partir de cellules NK isolées du sang périphérique ou du sang de cordon sont généralement produites par la transduction de cellules NK avec des constructions CAR composées d’un domaine de reconnaissance d’antigène extracellulaire, d’un domaine transmembranaire et de domaines de signalisation intracellulaires nécessaires à l’activation et à la prolifération 28,29,30.

Le défi de la conception d’une population stable et homogène de cellules NK fonctionnellement modifiées pour le traitement clinique peut être relevé en utilisant des cellules souches pluripotentes induites (iPSC)31,32. L’ingénierie d’iPSC humaines avec des CARs optimisés pour les cellules NK fournit un signal d’activation et de prolifération amélioré des cellules NK et fournit une population inépuisable et homogène de cellules NK exprimant des CAR en tant que « thérapie standardisée prête à l’emploi »20,33. Dans ce protocole, la modification génétique des iPSC pour générer des cellules NK dérivées d’iPSC exprimant des CAR implique l’intégration d’une construction CAR optimisée pour les cellules NK qui comprend des domaines transmembranaires et de signalisation dérivés des cellules NK (NKG2D-2B4-CD3ζ) et un scFv anti-glypican-3 (GPC3) comme décrit dans nos études précédentes23. Les iPSC génétiquement modifiées sont ensuite différenciées et développées à l’aide d’un protocole de différenciation des cellules NK développé précédemment34. Ces cellules NK dérivées d’iPSC exprimant des cellules CAR-modifiées ont la capacité de reconnaître et d’éliminer le CHC et d’autres cellules tumorales exprimant des antigènes spécifiques associés à la tumeur, tels que Glypican 3 (GPC3), qui est surexprimé dans le CHC et d’autres tumeurs malignes 35,36,37,38.

L’application de cellules CAR-NK dérivées d’iPSC pour le traitement de divers cancers est très prometteuse 30,39,40 ; bon nombre de ces cellules CAR-NK dérivées d’iPSC font actuellement l’objet d’essais cliniques 41,42,43. Pour faciliter les progrès dans ce domaine, ce protocole permet une production efficace de cellules CAR-NK dérivées d’iPSC modifiées, de l’ingénierie cellulaire à la différenciation en cellules NK matures et à l’expansion in vitro.

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Protocole

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1. Méthode de culture sans nourrisseur d’iPSC humaines

REMARQUE : Décongelez les iPSC humaines indifférenciées congelées et cultivez-les à l’aide de mTeSR 1-plus sur des plaques pré-enduites de Matrigel (ci-après appelées matrice de membrane basale [BMM]), comme décrit précédemment23,34. Il est très important de s’assurer que les iPSC ne sont pas différenciés avant et après l’ingénierie. Les iPSC fraîchement décongelées doivent être cultivées pendant environ 2 à 3 passages pour présenter une morphologie de pluripotence compatible avec les cellules souches pluripotentes humaines. Les instructions suivantes sont utilisées pour faire passer les cellules à partir d’un puits d’une plaque à 6 puits.

  1. Avant de passer les iPSC, enduire la nouvelle plaque à 6 puits avec 1x BMM (1 mL/puits) et incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 2 à 4 h avant utilisation.
  2. Préparez 1x BMM solubilisé.
    1. Décongeler une fiole de 5 mL de BMM à 4 °C pendant la nuit.
    2. Aliquote rapide du BMM à l’aide de pointes pré-refroidies dans des tubes de microcentrifugation pré-refroidis.
    3. Conserver à -80 °C jusqu’à 6 mois.
    4. Pour préparer 1x solution de travail BMM, remettre en suspension une aliquote BMM à rapport 1:100 dans un milieu DMEM/F12 froid. La solution de travail 1x BMM peut être conservée à -4 °C pendant 2 semaines.
    5. Enduire la plaque d’un volume suffisant pour couvrir la surface (p. ex., utiliser 1 mL par puits de plaque à 6 puits).
    6. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 2 à 4 h avant utilisation.
  3. Décongeler un flacon de CSPi congelés (généralement 1 × 106 cellules/flacon) dans un bain-marie à 37 °C.
  4. Ajouter graduellement les CSPi décongelées dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu mTeSR Plus préchauffé, en laissant les cellules s’acclimater en les ajoutant goutte à goutte pour minimiser le choc cellulaire.
  5. Centrifuger les cellules à 300 × g pendant 5 min.
  6. Aspirez le surnageant et lavez les cellules une fois avec 5 mL de PBS.
  7. Remettez les cellules en suspension dans le milieu mTeSR Plus et plaquez-les à une densité d’environ 200 000 cellules/3 mL/puits dans la plaque à 6 puits pré-enduite BMM.
  8. Passage iPSC.
    1. Une fois que les iPSC atteignent une confluence de 70 à 80 %, aspirez le milieu et effectuez un passage sur cellule unique avec TrypLE pendant 5 min à 37 °C (1 mL/puits dans une plaque à 6 puits).
    2. Après 5 min, ajoutez 3 ml de 1x PBS pour arrêter la réaction de dissociation et lavez les cellules une fois avec 3 ml de PBS.
    3. Centrifuger les cellules à 300 × g pendant 5 min. Après le lavage, remettre en suspension les iPSC unicellulaires dans le milieu mTeSR Plus, puis déposer la plaque sur une plaque à 6 puits pré-enduite BMM.
      REMARQUE : Le volume total de support requis est de 3 mL/puits dans une plaque à 6 puits. Le média doit être changé tous les 2-3 jours, et l’étape 1.8 doit être répétée lorsque les cellules deviennent confluentes à 70-80 % pendant au moins 1-2 passages avant de concevoir les iPSC.
  9. Vérifiez régulièrement la pluripotence des iPSC. Colorez les iPSC avec l’anticorps TRA-1-81 conjugué à l’allophycocyanine (APC) et à l’antigène embryonnaire spécifique du stade 4 conjugué à PE-Cy7 (SSEA-4) pendant 30 min sur glace, puis analysez-les à l’aide de la cytométrie en flux comme décrit précédemment23,41.
    REMARQUE : Les iPSC utilisées dans cette expérience sont adaptées à TrypLE. Les iPSC qui n’ont pas encore été passées avec TrypLE nécessitent généralement 8 à 10 passages pour s’adapter complètement à TrypLE, ce qui garantit la production de corps embryoïdes de spin (EB) de haute qualité.

2. Ingénierie d’iPSC humaines pour exprimer des CAR anti-GPC3 à l’aide du vecteur piggyBac

  1. Enduire une nouvelle plaque à 6 puits de BMM et incuber à 37 °C pendant au moins 1 h (cela peut être plus long tant que le liquide ne sèche pas).
  2. Préchauffage de mTeSR Plus avec 10 μM associé à Rho, bobine enroulée contenant un inhibiteur de protéine kinase (ROCK) (Y-27632) (à partir d’un stock de 1 mM préparé dans de l’eau distillée stérile) à 37 °C.
  3. Allumez le système de nucléotion. Sélectionnez l’unité X, puis sélectionnez les emplacements des puits à transfecter. Choisissez la solution P3 et saisissez manuellement le code (CA-137).
  4. Récoltez les iPSC à 70-80 % de confluence avec 1 mL de TrypLE et incubez à 37 °C pendant 5 min. Vérifiez au microscope pour confirmer la dissociation.
  5. Pipeter 4 à 6 fois pour obtenir une suspension unicellulaire, puis neutraliser avec 5 mL de PBS et granuler à 300 × g pendant 5 min.
  6. Lavez à nouveau délicatement les cellules pour éliminer toute trace de TrypLE.
  7. Réintroduisez dans 1 mL de mTeSR Plus avec inhibiteur de roche et comptez les cellules.
  8. Pour créer des iPSC CAR anti-GPC3, utilisez 1 × 106 cellules par transfection dans un tube de microcentrifugation et tournez à 300 × g pendant 5 min.
  9. Pendant la rotation, combinez l’ADN du transposon exprimant le CAR avec le vecteur d’expression de la transposase super PiggyBac dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL selon un rapport de 3:1 (p. ex., 3 μg de plasmide contenant le transposon pour 1 μg de plasmide transposase).
  10. Inclure un témoin positif de protéine fluorescente verte (GFP) (Table des matériaux) utilisant 0,5 μL de solution à 1 mg/mL, et un témoin négatif non transfecté pour confirmer l’expression de la GFP.
  11. Remettre soigneusement la pastille cellulaire en suspension dans 20 μL de solution de nucléofecteur P3 à température ambiante (RT) avec le supplément fourni dans le kit de nucléofection. Ensuite, ajoutez ce mélange dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant de l’ADN plasmidique, ce qui donne un volume final d’environ 22-25 μL.
    REMARQUE : Remettre en suspension toutes les iPSC à transfecter dans la solution du nucléofecteur P3 avant d’ajouter des plasmides CAR GPC3 ou un plasmide de contrôle GFP aux cellules.
  12. Transférez la suspension de cellule/ADN dans des bandelettes de 20 μL à 16 puits. Assurez-vous que l’échantillon couvre le fond de la cuvette sans aucune bulle.
  13. Tapotez doucement des bandes de 16 puits sur le dessus de la paillasse pour éliminer les bulles d’air et déposer les cellules au fond.
  14. Placez les bandelettes à 16 puits contenant les iPSC et le mélange d’ADN CAR dans le système de nucléofection, sélectionnez le programme CA-137, solution P3, puis démarrez le programme. Ce programme se terminera dans 1 s et affichera une coche verte.
  15. Ajoutez 80 μL de milieu mTeSR Plus préchauffé avec inhibiteur de ROCK dans le puits et transférez soigneusement les cellules sur la plaque à 6 puits recouverte de BMM (volume final de 1 mL par puits).
  16. Vérifiez brièvement les cellules au microscope à fluorescence après 4 h pour toute expression de GFP afin de confirmer le taux de réussite de la transfection.
  17. Criblez les iPSC pour l’expression de la GFP afin d’évaluer l’efficacité de la transfection 24 h après la transfection à l’aide de la cytométrieen flux 23,41 pour confirmer l’expression de la GFP.
  18. Incuber pendant 4 jours à 37 °C, en changeant le milieu au besoin avant de procéder à la sélection du médicament.
    REMARQUE : Chaque nucléofection nécessite 0,2-2 x 106 iPSC par réaction. En fonction du nombre de réactions, des plaques à 24 puits ou à 6 puits peuvent être utilisées.

3. Sélection clonale et confirmation de la pluripotence des iPSC GPC3-CAR

  1. Effectuez une série de sélections de zéocine (1:10 000) sur les iPSC transfectées pour sélectionner clonalement les iPSC exprimant GPC3-CAR.
  2. Pour confirmer l’efficacité de la transfection, mesurer l’expression de la GFP à l’aide d’un microscope fluorescent et d’une cytométrie en flux23,41.
    REMARQUE : La construction CAR est incorporée avec une balise FLAG 44,45 dans le but d’évaluer l’expression de CAR à la fois pendant le stade iPSC et après la différenciation des cellules NK.
  3. Maintenir les iPSC CAR transfectées sous sélection de médicament jusqu’à ce qu’elles atteignent une expression optimale du gène CAR et de la GFP.
  4. Pour assurer une expression homogène de la GFP et du CAR, prolongez la durée de sélection du médicament de 2 à 3 semaines.
  5. Effectuez un tri cellulaire basé sur l’expression de la GFP ou du CAR à l’aide de la cytométrie en flux pour obtenir une population homogène d’iPSC23 sélectionnées par clonage.
  6. La construction CAR utilisée ici contient un marqueur de sélection de médicament à base de zéocine. Sélectionnez les cellules transfectées du gène CAR GPC3 en ajoutant de la zéocine (50 μg/mL de zéocine) au milieu de culture.
  7. Après la sélection de la zéocine, diluez les iPSC transfectées du gène CAR GPC3 et plaquez-les dans une plaque de 96 puits pour obtenir environ une cellule par puits. Cela peut se faire par dilution en série ou à l’aide d’un trieur de cellules.
    REMARQUE : Utilisez le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler des cellules transfectées uniques en fonction de l’expression d’un marqueur fluorescent lié à la construction CAR.
  8. Laissez les cellules individuelles se développer en colonies dans la plaque de 96 puits.
  9. Nourrissez les cellules avec un milieu de culture frais tous les 3-4 jours une fois et surveillez les puits pour la croissance de la colonie.
  10. Examinez les colonies pour détecter l’expression de la CAR. Cela peut être fait par réaction en chaîne par polymérase (PCR), réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) ou transfert Western pour vérifier la présence de la construction CAR23,47.
  11. Alternativement, utilisez la cytométrie en flux23,41 pour détecter l’expression de surface de la protéine CAR.
    REMARQUE : Dans cette étude, l’expression de CAR a été quantifiée par l’expression de la balise FLAG à l’aide de la cytométrie en flux.
  12. De plus, effectuez un caryotype pour identifier toute anomalie chromosomique.
    REMARQUE : Cette opération peut être effectuée par des organisations tierces telles que Wicell (wicell.org) ou Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. Une fois que les clones CAR-positifs sont identifiés sans aucune anomalie, étendez ces clones dans des récipients de culture plus grands tels que la plaque à 6 puits et la fiole T75.
  14. Cryoconservez les iPSC CAR expansées clonalement à l’aide d’un milieu de cryoconservation dans plusieurs flacons pour une utilisation future.
    REMARQUE : Les points suivants sont recommandés dans cette étape : (i) Maintenir des conditions de culture optimales pour les iPSC afin d’éviter la différenciation. (ii) Laisser 1 à 4 semaines pour obtenir une population homogène d’expression de CAR et de GFP dans les iPSC après la sélection du médicament. (iii) Continuer à surveiller les cellules pour la stabilité de l’expression de CAR et les marqueurs de pluripotence. (iv) Utiliser des contrôles appropriés pendant les étapes de contrôle et de vérification. (v) Après la sélection clonale et l’expansion, vérifier la pluripotence en évaluant l’expression de TRA-1-81 et SSEA-4 sur les iPSC exprimant CAR.

4. Génération de cellules progénitrices hématopoïétiques à partir d’iPSC CAR modifiées par formation de corps embryoïde (EB) de spin

REMARQUE : Un protocole de spin EB ou organoïde hématopoïétique est utilisé pour produire des progéniteurs hématopoïétiques23,34. Les cellules à l’intérieur des EB se différencient en cellules stromales pour soutenir le développement des lymphocytes38, éliminant ainsi le besoin de cellules stromales dérivées de xénogènes comme OP9 23,34,48. Vous trouverez ci-dessous les instructions pour collecter des cellules à partir d’un seul puits d’une plaque à 6 puits pour la formation d’EB.

  1. Passage ~200 000 cellules/puits d’une plaque pré-revêtue de BMM à 6 puits 2 jours avant la formation de l’EB de spin. Assurez-vous qu’il atteint 70-80 % de confluence le jour de la configuration des EB de spin. Généralement, 1 puits d’une plaque à 6 puits est suffisant pour deux plaques de spin EB.
  2. Retirer le milieu de culture et détacher les cellules en les incubant avec 1 mL de TrypLE Select préchauffé à 37 °C 5 min.
  3. Dissociez soigneusement les agrégats cellulaires en une suspension cellulaire unique à l’aide d’une micropipette de 1 mL et transférez les cellules dans un tube conique de 15 mL. Ajoutez 3 ml de 1x PBS pour arrêter la réaction de dissociation, et lavez les cellules une fois avec 3 ml de PBS.
  4. Remettez les cellules en suspension dans le milieu mTesR Plus et filtrez-les à travers une crépine de cellules de 70 μM pour éliminer les agrégats.
  5. Faites tourner les cellules pour éliminer le surnageant et lavez à nouveau les cellules avec 5 ml de PBS. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu STEMdiff APEL (milieu de formation EB).
  6. Compter et diluer les cellules jusqu’à la densité appropriée à l’aide du milieu de formation d’EB contenant les cytokines suivantes (SCF : 40 ng/mL, BMP4 : 20 ng/mL, VEGF : 20 ng/mL) plus 10 μM inhibiteur de ROCK.
  7. Ensemencez 3000 à 10000 cellules/puits dans 100 μL de milieu (100 000 cellules/mL) dans les plaques à 96 puits.
    REMARQUE : Le nombre de cellules utilisées dans la formation de l’EB peut varier en fonction de la lignée iPSC. Il est recommandé de tester entre 3 000 et 10 000 cellules par puits dans des plaques de 96 puits.
  8. À l’aide d’une pipette multicanaux, chargez la suspension cellulaire dans des plaques de 96 puits à 100 μL/puits.
    REMARQUE : Pour une meilleure formation des corps embryoïdes (EB), il est recommandé d’utiliser des plaques à fond rond à 96 puits à fixation ultra-faible.
  9. Centrifuger la plaque à 96 puits à 300 × g pendant 5 min, puis incuber les plaques à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 6 jours.
    REMARQUE : Des études préliminaires ont révélé que 6 jours sont suffisants pour donner naissance à >30 % de cellules CD34+ pour les lignées CAR iPSC dans cette étude.
  10. Vérifier la qualité de l’EB par cytométrie en flux23,41.
    1. Préparez 4 ml de trypsine préchauffée à 0,25 % avec du sérum de poulet à 0,4 % (16 μL pour 4 ml de trypsine) pour dissocier les EB.
    2. Transférer 10 à 30 EB dans un tube conique de 15 ml.
    3. Ajouter la solution trypsine/sérum de poulet aux EB et incuber au bain-marie pendant 10 min, en tourbillonnant toutes les 30 s pour assurer une dissociation complète des EB.
    4. Pipeter les EBs trypsinisés. Mélangez plusieurs fois de haut en bas pour bien dissocier l’EBS.
    5. Ajouter 5 ml de 1x PBS pour arrêter le processus de trypsinisation.
    6. Filtrez la solution cellulaire à travers une crépine de 70 μm dans un nouveau tube conique.
    7. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min.
    8. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans 3 à 5 mL de milieu frais.
    9. Comptez les cellules, colorez avec des marqueurs EB typiques tels que CD34, CD31, CD43 et CD45, et analysez à l’aide de la cytométrie en flux23,41 (Figure 3).
    10. Ajouter le volume recommandé d’anticorps selon les instructions du fabricant dans chaque tube contenant des cellules individuelles dissociées d’EB dans 100 μL de tampon d’écoulement et incuber sur glace pendant 30 min39,41.
    11. Après l’incubation, laver les cellules deux fois avec un tampon de flux, ajouter le colorant bleu SYTOX vivant/mort et analyser à l’aide de la cytométrie en flux.
      REMARQUE : En règle générale, >30 % de cellules CD34+ sont obtenues à partir de la population totale de corps embryoïdes de Spin dissociés au jour 6 à l’aide des CSPi utilisées dans cette étude, bien que ce pourcentage puisse varier en fonction de la source de CSPi et des conditions de culture.

5. Différenciation des cellules NK dérivées de GPC3 CAR iPSC à partir de spin EB

REMARQUE : Les EB de spin exprimant le CAR GPC3 peuvent être transférés dans des plaques à 24 puits ou des plaques à 6 puits recouvertes de gélatine à 2 % ou sans revêtement. Pour les changements moyens, les plaques à 6 puits sont plus appropriées, tandis que le revêtement à la gélatine à 2 % améliore la fixation des EB.

  1. Préparez des plaques à 6 puits recouvertes de gélatine en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Préparez une solution de gélatine à 2 % (p/v) en dissolvant la gélatine dans de l’eau de qualité culture tissulaire.
    2. Stériliser la solution en autoclave à 121 °C, 15 psi pendant 30 min.
    3. Enduire la surface de chaque puits de 5 à 10 μL de solution de gélatine par cm2 (~1 mL par puits d’une plaque à 6 puits).
    4. Incuber les plaques à 37 °C pendant 2 à 4 h avant utilisation. Après l’incubation, aspirer toute solution de gélatine restante avant de procéder au transfert des EB.
  2. Préparez le milieu de différenciation des cellules NK : ajoutez 56,6 % de DMEM+ GlutaMAX-I, 28,3 % de F12+ GlutaMAX-I, 15 % de sérum AB humain inactivé par la chaleur, 1 % de P/S, 2 mM de L-glutamine, 1 μM de β-mercaptoéthanol, 5 ng/mL de sélénite de sodium, 50 μM d’éthanolamine et 20 mg/L d’acide ascorbique. Conserver à 4 °C dans l’obscurité.
  3. Ajouter 3 mL de milieu de différenciation NK contenant les cytokines suivantes dans chaque puits des plaques à 6 puits recouvertes de gélatine (IL-3 : 5 ng/mL, SCF : 20 ng/mL, IL-7 : 20 ng/mL et IL-15 : 10 ng/mL).
  4. Le jour 6, transférez les EB de Spin directement dans les plaques à 6 puits recouvertes de gélatine préparées contenant un milieu de différenciation NK en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Transférez avec précaution les EB des plaques à 96 puits dans une boîte de 10 cm, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL pour prélever la majeure partie du milieu.
    2. Ajouter 3 mL de milieu de différenciation NK contenant les cytokines ci-dessus dans chaque puits de la plaque à 6 puits recouverte de gélatine.
    3. Répartissez 16 à 20 EB dans chaque puits de la plaque à 6 puits à l’aide d’une micropipette de 1 ml.
      REMARQUE : En moyenne, les EB d’une seule plaque de 96 puits peuvent être utilisés pour ensemencer une plaque de 6 puits pour la plaque de différenciation NK.
  5. Effectuez des changements moyens tous les 5 à 7 jours. Après la première semaine de différenciation des cellules NK, exclure l’IL-3 du milieu.
    REMARQUE : Après 14 jours, le support doit être changé tous les 3-4 jours.
  6. Continuez les changements moyens pendant 3-4 semaines. Evaluer l’expression des marqueurs des cellules NK (CD45+CD56+) par cytométrie en flux24,42 sur des cellules en suspension.
  7. Lorsque >80 % des cellules en suspension expriment CD45+CD56+, récoltez les cellules en les faisant passer à travers un filtre de 70 μm pour éliminer les amas éventuels.
  8. Co-culture de cellules NK récoltées avec 100 aAPCs34,48 irradiés gris et culture dans un milieu d’expansion NK contenant de l’IL-2 (100ng/mL) et de l’IL-15 (10 ng/mL).

6. Expansion des cellules NK dérivées de CAR iPSC anti-GPC3

REMARQUE : En règle générale, un rendement de 2 à 20 × 10 cellules6 NK peut être obtenu à partir d’une seule plaque à 6 puits, même avant l’expansion. Pour faciliter l’expansion ultérieure des cellules NK pour les applications en aval, des cellules présentatrices d’antigène artificielles (aAPCs) sont utilisées pour générer des cellules NK >1 × 109 .

  1. Utilisez des cellules K562 modifiées exprimant 41BBL et l’IL-21 liée à la membrane (41BBL-mbIL-21)48 comme aAPCs pour induire l’expansion des cellules NK.
  2. Avant de co-cultiver des aAPC avec des cellules NK, irradiez les aAPC avec 100 gray et conservez-les sous forme de stocks congelés.
  3. Récoltez les cellules de suspension de la plaque à 6 puits et cultivez les cellules NK dans un milieu d’expansion NK complété par 50 U/mL d’IL-2 et d’IL-15 (10 ng/mL ; à ajouter fraîchement) à une densité de 5 × 105 cellules/mL.
  4. Ajouter les aAPC irradiés décongelés aux cellules NK dans un rapport de 1:1.
  5. Réapprovisionner le milieu de culture tous les 3 à 4 jours, en ajoutant de l’IL-2 et de l’IL-15 fraîches à une concentration de 50 U/mL et 10 ng/mL, respectivement.
  6. S’assurer que les cellules NK dérivées de CAR iPSC conservent leur capacité d’expansion sur une période de >3 mois, en maintenant à la fois la viabilité cellulaire et l’activité cytolytique.

7. Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules NK dérivées de GPC3 CAR iPSC

REMARQUE : La caractérisation des cellules NK dérivées de GPC3 CAR iPSC implique une évaluation complète de leur profil phénotypique et de leur activité fonctionnelle.

  1. Évaluer l’expression des récepteurs d’activation NK, y compris CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL et FasL, sur les cellules NK dérivées de CAR iPSC anti-GPC3 par cytométrieen flux 24,42 pour déterminer l’activité et l’état de maturation des cellules CAR NK (Figure 4).
  2. Évaluez l’activité fonctionnelle in vitro des cellules NK dérivées de GPC3 CAR iPSC à l’aide de tests Caspase-3/7 basés sur la cytométrie en flux, de tests de libération de granules CD107a, de tests de libération de cytokines IFN-γ et TNF-α contre diverses cibles tumorales.
  3. Pour le dosage de la Caspase3/7, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Comptez les cellules cibles et pré-colorez-les avec un colorant fluorescent de traçage cellulaire à une concentration finale de 5 μM dans du PBS pendant 15 min à 37 °C.
    2. Laver les cellules cibles colorées dans un milieu de culture complet avant de les co-cultiver avec des cellules NK dérivées de CAR iPSC à divers rapports effecteur/cible (E :T) à 37 °C.
    3. Après 3 h et 30 min de co-culture, ajouter le réactif de détection vert Caspase-3/7 pour 30 min supplémentaires d’incubation, ce qui donne un temps d’incubation total de 4 h.
    4. Ajouter 1 μL de solution de coloration des cellules mortes pendant les 5 dernières minutes de coloration et mélanger délicatement.
    5. Analyser les cellules colorées à l’aide de la cytométrie en flux23,41 (Figure 5).
  4. Mettre en œuvre ce protocole pour assurer une compréhension complète des caractéristiques phénotypiques et de l’activité fonctionnelle des cellules NK dérivées de GPC3 CAR iPSC, permettant une évaluation robuste de leur potentiel thérapeutique.
    REMARQUE : Il faut généralement 4 à 5 semaines pour obtenir >90 % de cellules CD45+CD56+ à partir de la différenciation des cellules NK dérivées de GPC3 CAR iPSC basées sur le spin EB et des conditions d’expansion NK à l’aide des lignées GPC3 CAR iPSC. Certaines lignées cellulaires iPSC peuvent ne nécessiter que 3 semaines, et certaines lignées peuvent prendre plus de temps (environ 4 à 5 semaines).

8. Dépannage des éléments et des solutions

REMARQUE : Le dépannage de la différenciation, de l’expansion et des tests fonctionnels des cellules CAR NK GPC3 dérivées d’iPSC à l’aide de la méthode du corps embryoïde de spin (EB) peut impliquer plusieurs étapes. Vous trouverez ci-dessous quelques problèmes courants que l’on peut rencontrer, ainsi que des solutions suggérées :

  1. Symptômes de la formation incohérente d’EB
    1. Vérifiez si les EB sont trop petits ou trop grands, avec des formes irrégulières.
  2. Solution à la formation incohérente d’EB
    1. Ajustez la vitesse et la durée de la centrifugeuse utilisées pour former les EB. Une vitesse d’environ 200-300 × g pendant 5 à 10 min est typique.
    2. Assurez-vous que les plaques à fond en U appropriées ou les boîtes de culture à très faible adhérence sont utilisées pour faciliter la formation d’EB.
    3. Confirmer que les iPSC sont homogènes et exemptes de cellules différenciées qui pourraient affecter la formation d’EB.
  3. Symptômes d’une mauvaise différenciation des iPSC en cellules NK
    1. Vérifier la faible expression des marqueurs des cellules NK (par exemple, CD56, NKp46).
    2. Vérifiez si les EB ne sont pas formés ou si les EB sont mal formés.
  4. Solution à la mauvaise différenciation des iPSC en cellules NK
    1. S’assurer que les concentrations des facteurs de croissance essentiels (p. ex., VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF et IL-3) sont optimales pour la formation de l’EB et la différenciation des cellules NK. Ajustez les concentrations en fonction des études précédentes 23,34,41.
    2. S’assurer que la densité de semis initiale des CSPi est appropriée. En règle générale, une densité de 8000 à 10 000 cellules/100 μL est recommandée pour la formation d’EB de spin.
    3. Vérifiez que le milieu de différenciation est correctement formulé, y compris les suppléments nécessaires (par exemple, alternatives sériques ou sans sérum, autres cytokines).
    4. Prévoyez suffisamment de temps pour la formation de l’EB, un minimum de 6 jours à jusqu’à 12 jours avant de passer au milieu de différenciation des cellules NK.
  5. Symptômes d’une faible expansion des cellules NK
    1. Vérifiez que le rendement cellulaire est limité pendant l’expansion.
    2. Vérifiez si la viabilité des cellules NK expansées n’est pas réduite.
  6. Solutions pour une mauvaise expansion des cellules NK
    1. Augmenter la concentration d’IL-15 et d’IL-2 pendant la phase d’expansion. Cela peut considérablement améliorer la prolifération des cellules NK.
    2. Envisagez d’utiliser des cellules nourricières telles que les aAPC irradiées pour améliorer la survie et l’expansion des cellules NK.
    3. Surveillez régulièrement la densité cellulaire et les cellules de passage avant qu’elles n’atteignent la surpopulation afin de maintenir des conditions de croissance optimales.
  7. Symptômes des résultats des tests fonctionnels sous-optimaux
    1. Vérifiez la cytotoxicité réduite contre les cellules cibles.
    2. Vérifiez si les niveaux de sécrétion de cytokines sont faibles (par exemple, IFN-γ, TNF-α).
  8. Solutions pour les résultats de tests fonctionnels non optimaux
    1. Optimiser le rapport cible/effecteur dans les tests de cytotoxicité. Commencez avec un rapport de 10:1 et ajustez en fonction des résultats.
    2. Assurez-vous que les cellules NK sont correctement activées avant les tests fonctionnels. Cela peut inclure une pré-stimulation avec des cytokines ou une co-culture avec des aAPCs irradiés.
    3. Vérifier la sensibilité de la lignée cellulaire cible à la lyse médiée par les cellules NK. Utilisez des cibles sensibles connues comme contrôles.
    4. Prolonger la durée des tests fonctionnels pour laisser suffisamment de temps à l’activité des cellules NK pour se manifester.
  9. Symptômes des niveaux d’expression variables des CAR
    1. Vérifiez si l’expression incohérente de CAR entre les cellules NK.
  10. Solutions pour des niveaux d’expression CAR variables
    1. Vérifier l’efficacité de la méthode de transfection CAR (p. ex., transduction virale, électroporation). Ajustez les conditions de MOI (multiplicité d’infection) ou d’électroporation si nécessaire.
    2. Mettre en place des marqueurs de sélection appropriés pour enrichir les cellules NK CAR+. Utilisez la sélection d’antibiotiques ou le tri des marqueurs fluorescents si nécessaire.

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Résultats

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Schéma de principe de la différenciation et de l’expansion des cellules NK dérivées d’iPSC anti-GPC3-CAR
Le schéma illustre la différenciation in vitro de cellules NK modifiées anti-GPC3-CAR dérivées de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) et une représentation schématique du vecteur piggyBac portant la construction CAR GPC3. Initialement, les iPSC non modifiées sont transfectées avec un vecteur piggyBac codant pour le CAR GPC3 (récepteur antigénique chimérique). Après la t...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une approche standardisée et reproductible pour générer des cellules NK dérivées d’iPSC exprimant des cellules CAR-exprimant à partir d’une source cellulaire cohérente visant à faciliter l’immunothérapie ciblée contre le cancer « prête à l’emploi ». De nombreuses études précliniques et cliniques ont montré l’efficacité de l’immunothérapie adoptive à base de cellules NK dans le traitement des cancers tout en minimisant les toxicités, comme les maladies du greffon contr...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSK est cofondateur et conseiller de Shoreline Biosciences et détient une participation dans la société. DSK est également consultant pour Therabest et RedC Bio pour lesquels il reçoit des revenus et/ou des capitaux propres. Les termes de ces arrangements ont été examinés et approuvés par l’Université de Californie à San Diego conformément à ses politiques en matière de conflits d’intérêts. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions tous les membres du laboratoire Kaufman pour leur soutien, leurs connaissances scientifiques et leurs discussions. Ces études ont été financées par les subventions NIH/NCI U01CA217885, P30CA023100 (supplément administratif) et le Sanford Stem Cell Institute de l’UCSD. JT : rédaction et révision du manuscrit. DSK : a revu et édité le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
aAPC  ;Dean A. Lee lab  ;N/A
milieu de culture a-MEM  ;Fisher Scientific  ;Cat#12634
APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)BD Biosciences  ;Cat#637308
APC-anti-humain TRA-1-81  ;ThermoFisher17-8883-42  ;
APC-CD16BD Biosciences  ;Cat#302015
APC-CD43  ;BD BiosciencesCat# 560198  ;
APC-CD45  ;BD BiosciencesCat# 555485  ;
APC-GPC3BD Biosciences  ;Cat#DB100B
APC-NKG2D  ;BD Biosciences  ;Cat# 558071  ;
Réactif de détection CellEvent Caspase-3/7 Green  ;Thermo pêcheur  ;Cat#C10423
Kit de prolifération de cellules violettes CellTrace  ;Thermo pêcheur  ;Cat#C34571Colorant fluorescent de traçage cellulaire  ;
La solution CryoStor  ;Stem Cell Technologieshttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlMilieu de cryoconservation
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander MediumLife TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco 11965084
DMEM, hyperglucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateGibco10569010
Kit d’enrichissement de cellules NK humaines EasySep  ;StemCell Technologies, Inc.  ;Cat#19055
ÉthanolamineSigma AldrichE9508
Sérum fœtal bovin  ;Fisher Scientific  ;Cat# 10437010
FITC-CD94  ;BD Biosciences  ;Cat#555888
GlutaMAX SupplémentGibco35050061
GolgiPlug  ;BD Biosciences  ;Cat#555029
GolgiStop  ;BD Biosciences  ;Cat#554724
Mélange de nutriments F-12 de Ham, supplément GlutaMAXGibco31765035
sérum de cheval  ;Fisher Scientific  ;Chat # 16050130
Sérum Humain  ;AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
Kit NucleofectorTM de cellules souches humaines  ;Lonza  ;Cat# VPH-5012
Humain : Cellules HePG2  ;ATCC  ;Cat#HB-8065
Humain : HePG2-td-tomates-luc cellules  ;Dan S. Kaufman labN/A
Humain : cellules iPS  ;Dan S. Kaufman lab  ;N/A
Humain : cellules SNU-449ATCCCat#CRL-2234
Humain : SNU-449-td-tomato-luc cells  ;Dan S. Kaufman labN/A
IncuCyte Caspase-3/7 Dosage de l’apoptose verte  ;Essenbioscience  ;Cat#4440
Acide L-ascorbiqueSigma AldrichA5960
MP Biomedicals  ; Sérum humain, type ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR plusStemCell Technologies, Inc.  ;100-0276
Logiciel NovoExpress  ;ACEA Biosciences  ;
Anticorps anti-humain SSEA-4 PE/Cy7  ;Biolegend330420
PE-CD16  ;BD Biosciences  ;Cat#560995  ;
PE-CD226BD Biosciences  ;Cat#559789
PE-CD34  ;BD BiosciencesCat# 555822  ;
PE-CD45  ;BD Biosciences  ;Cat# 555483  ;
PE-CD94  ;BD Biosciences  ;Cat#555888  ;
PE-cy7-CD56  ;BioLegend Cat# 318318  ;
Ligand PE-FAS  ;BD Biosciences  ;Cat#564261  ;
PE-NKp30BD BiosciencesCat# 558407
PE-NKp44  ;BD Biosciences  ;Cat#558563  ;
PE-NKp46BD Biosciences  ;Cat#331908
PE-NKp46  ;BD Biosciences  ;Cat#557991  ;
Couche leucocytaire du sang périphérique  ;Banque de sang de San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/)  ;N/A
PE-TRAIL  ;BD Biosciences  ;Cat#565499  ;
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO  ;Branden Moriarity lab  ;N/A
plasmide pMAX-GFPLonzaN/Acontrôle positif GFP  ;
Prisme 9Graphpad  ;Version 9
pSpCas9  ;GenScriptPX165
Tampon de lyse RBC (10x)BiolegendCat#420301
BFGF humain recombinant de base  ;R& D Systems  ;Cat#4114-TC
BMP-4 humain recombinant  ;PeproTechCat#120-05
Ligand FLT-3 humain recombinant  ;PeproTechCat# 300-19 IL-15
humaine recombinante  ;PeproTechCat# 200-15
IL-2 humaine recombinante  ;PeproTechCat# 200-02
IL-3 humaine recombinante  ;PeproTechCat#200-03
IL-7 humaine recombinante  ;PeproTechCat# 200-07
Protéine ganglionnaire humaine recombinanteR& D Systems  ;Cat#3218-ND-025
SCF humain recombinant  ;PeproTechCat# 300-07
TGF-&bêta humain recombinant ; 1PeproTechCat#100-21
VEGF humain recombinant  ;PeproTechCat# 100-20
RPMI1640Gibco11875093
Sélénite de sodiumSigma Aldrich214485
STEMdiff APEL 2 MediumStemCell Technologies, Inc.  ;5270EB formation medium
STEMdiff APEL2 Medium  ;StemCell Technologies, Inc.  ;Cat#05270
Super piggyBac Vecteur d’expression de la transposaseSBICat#PB210PA-1
SYTOX AADoute de coloration à cellules mortesavancées ThermoFisher ScientificS10274, S10349Kit de solution de coloration des cellules mortes
&beta ;-mercaptoethanolGibco21985023
https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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