Mise au point d’un système protoplaste du chou pour l’étude de la tolérance à l’hypoxie chez les brassicacées

Résumé

Ce protocole décrit un système efficace de protoplastes du mésophylle du chou. Divers traitements déficients en oxygène ont été testés, et le système a montré une forte activation des gènes sensibles à l’hypoxie, facilitant l’étude des mécanismes génétiques et moléculaires de la tolérance aux inondations chez les légumes Brassicaceae .

Résumé

Alors que le changement climatique entraîne des précipitations plus abondantes, le chou, un légume clé des Brassicaceae , fait face à d’importantes pertes de rendement en raison du stress d’hypoxie induit par les inondations. Pour identifier les mécanismes de tolérance à l’inondation chez les choux, une plate-forme polyvalente pour les études fonctionnelles génétiques est nécessaire pour surmonter la nature récalcitrante de la transformation des choux. Dans cette étude, un système d’expression transitoire du protoplast du chou et un protocole d’induction de l’hypoxie du protoplast correspondant ont été développés. Ce protocole a permis d’obtenir un rendement élevé et une intégrité d’isolement des protoplastes à partir de feuilles de chou, avec une efficacité de transfection supérieure à 40 % en utilisant des conditions enzymatiques optimisées. Pour atténuer l’influence hypoxique potentielle avant les traitements, la solution W5 a été remplie de bulles d’oxygène gazeux pour augmenter les niveaux d’oxygène dissous. Plusieurs produits chimiques pour ajuster les niveaux d’oxygène et les traitements physiologiques de piégeage de l’oxygène ont été testés, notamment l’EC-Oxyrase, l’OxyFluor, le sulfite de sodium et un absorbeur d’oxygène. Des tests à double luciférase ont montré que les promoteurs des gènes de réponse respiratoire anaérobie BoADH1 et BoSUS1L étaient activés dans les protoplastes du chou après des traitements par hypoxie, le niveau d’induction le plus élevé étant observé après un traitement avec l’absorbeur d’oxygène. En résumé, le système d’expression transitoire du protoplast du chou combiné au traitement par hypoxie démontre une plate-forme efficace et pratique. Cette plateforme peut faciliter l’étude de la fonction des gènes et des mécanismes moléculaires associés aux réponses à l’hypoxie chez les choux.

Introduction

Le changement climatique mondial a exacerbé les inondations, qui sont devenues un problème de plus en plus critique dans le monde entier. Au cours des dernières décennies, on a assisté à une tendance à la hausse de la fréquence des inondations, ce qui a entraîné des pertes de récoltes^{substantielles1,2}. Le chou (Brassica oleracea var. capitata L.), un légume d’importance mondiale importante, est sensible aux effets néfastes des fortes pluies, ce qui nécessite le développement de cultivars de chou tolérants aux inondations pour assurer une production durable face aux événements météorologiques extrêmes. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires associés au stress lié aux inondations chez le chou pour relever ce défi.

Pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes chez les plantes submergées, les lignées transgéniques sont largement utilisées pour les études fonctionnelles génétiques. Cependant, cette approche est limitée par des coûts élevés, des processus de transformation et de sous-culture chronophages, ainsi que par de faibles efficacités de transformation chez de nombreuses espèces cultivées, ce qui nécessite le développement de méthodologies alternatives. Les systèmes d’expression transitoire basés sur les protoplastes ont été largement appliqués dans la recherche moléculaire végétale en tant qu’alternative polyvalente et efficace. Ces systèmes facilitent l’étude de l’activité des promoteurs, des voies de signalisation en réponse aux signaux environnementaux, des interactions protéine-protéine ou protéine-ADN et de la localisation subcellulaire³. L’établissement de systèmes d’expression transitoires de protoplastes a été signalé non seulement chez des plantes modèles ^4,5, mais aussi dans des cultures économiquement importantes telles que la canne à sucre⁶, l’œillet⁷, les orchidées Phalaenopsis ⁸ et l’aubergine⁹. De plus, ces systèmes ont été mis en œuvre avec succès dans des plantes ligneuses, notamment Camellia oleifera¹⁰et Populus trichocarpa¹¹. Cependant, les protocoles d’application des systèmes de protoplastes pour étudier les légumes-feuilles sous stress d’hypoxie induit par la submersion sont limités. Par conséquent, un protocole intégré a été développé dans ce travail pour ceux qui s’intéressent à l’étude des réponses à l’hypoxie dans les légumes-feuilles à l’aide d’un système d’expression transitoire du protoplast du chou.

Pour effectuer la réponse d’hypoxie induite par la submersion au niveau cellulaire, plusieurs méthodologies de piégeage de l’oxygène ont été employées dans des études précédentes pour simuler des environnements hypoxiques. Il s’agit notamment de l’utilisation d’EC-Oxyrase, d’OxyFluor, de sulfite de sodium et de sacs consommateurs d’oxygène. L’EC-Oxyrase est généralement utilisée pour le traitement anaérobie dans les lignées cellulaires humaines¹² et les protoplastes d’Arabidopsis ¹³. L’OxyFluor s’est avéré efficace pour atténuer le photoblanchiment causé par les espèces réactives de l’oxygène lors de l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes^14,15. Le sulfite de sodium a été utilisé dans le traitement anaérobie des nématodes¹⁶ et, plus récemment, dans les protoplastes du riz, en conjonction avec des techniques telles que les tests d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)¹⁷. Les packs d’absorbeurs d’oxygène, principalement utilisés pour la culture bactérienne anaérobie¹⁸, ont également démontré leur efficacité à induire l’activation des promoteurs de ZmPORB1 dans les protoplastes de maïs dans des conditions anaérobies¹⁹.

Le présent travail vise à établir un pipeline robuste pour l’isolement et l’expression transitoire des protoplastes du chou. Par la suite, l’efficacité de divers traitements d’ajustement de l’oxygène a été évaluée en évaluant l’activité promotrice des gènes de réponse anaérobie à l’aide de tests à double luciférase. Le protocole élaboré dans le cadre de cette étude devrait être utile pour les recherches futures sur le stress de submersion ou d’hypoxie dans les systèmes de Brassica.

Protocole

Deux cultivars commerciaux de chou (B. oleracea var. capitata) ont été utilisés dans cette étude : 'Fuyudori' et '228'. Une représentation graphique du flux de travail du protocole est illustrée à la figure 1. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des plants de chou

1. Semez les graines de chou 'Fuyudori' et '228' à l’aide d’un substrat végétal commercial dans des trous ronds de forme carrée (P 4,5 cm x H 4,5 cm) de plateaux à 48 puits (L 49 cm x L 28 cm x H 5 cm). Enfoncez les graines à environ 1 cm de profondeur dans le milieu de culture.
2. Cultivez les plants de chou dans une salle de culture à 22 °C avec un cycle lumière-obscurité de 16/8 h. Maintenez l’intensité lumineuse de 100 μmol ^m-2·^s-1 (tube fluorescent blanc) pendant la phase d’éclairage.
3. Après 2-3 semaines de croissance, utilisez des plants de chou au stade 2 feuilles pour une meilleure isolation des protoplastes du mésophylle.
   REMARQUE : La taille suggérée des semis de chou est un stade à 2 feuilles, au cours duquel la deuxième vraie feuille est complètement développée, mais la troisième vraie feuille n’est pas élargie et sa longueur est inférieure à 1 cm (figure 2A). Pour synchroniser les stades de développement des plants de chou, les graines de 'Fuyudori' doivent être semées environ 2 jours plus tôt que celles de '228' en raison de leurs vitesses de croissance différentes. Cet ajustement assure une croissance et une maturité uniformes parmi les plants de chou au stade souhaité.

2. Isolement des protoplastes du chou

1. Préparer 12,5 mL de solution enzymatique (tableau 1) avant chaque isolement de protoplastes.
   1. Préchauffer une solution avec 10 mM de MES (pH 5,7) et 0,6 M de mannitol à 55 °C. Continuez à réchauffer la solution à 55 °C pendant 10 min après avoir ajouté 1,5 % de cellulase R10 et 0,75 % de macérozyme R10.
   2. Une fois que la solution enzymatique a refroidi à température ambiante (25 °C), ajoutez 10 mM de CaCl₂ et 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Stérilisez la solution enzymatique préparée dans une boîte de Pétri de 9 cm à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
      REMARQUE : Le préchauffage de la solution augmente la solubilité de l’enzyme et inactive la protéase. Les effets de la digestion varient en fonction des différents types d’enzymes cellulases. L’association de Cellulase R10 et de Macerozyme R10 convient à l’isolement des protoplastes du chou.
2. Récupérez les deuxièmes vraies feuilles nouvellement développées de cinq à huit plants de chou et coupez-les en lanières de 0,5 à 1,0 mm à l’aide d’une lame de rasoir tranchante. Transférez immédiatement les bandes de feuilles dans la solution enzymatique fraîchement préparée.
   REMARQUE : Il est crucial de sélectionner des feuilles saines et désignées du chou au bon stade. Les deuxièmes vraies feuilles nouvellement développées à partir de semis de chou au stade 2 feuilles offrent la plus grande efficacité d’isolation des protoplastes. Les plantes trop matures, les cotylédons ou les feuilles âgées ne sont pas recommandés pour l’isolement des protoplastes. Cinq à douze vraies feuilles bien développées peuvent produire des protoplastes de chou dans 12,5 ml de solution enzymatique. Le nombre de feuilles nécessaires à l’isolement des protoplastes dépend de la quantité souhaitée de protoplastes nécessaires. En règle générale, les protoplastes obtenus à partir de cinq à huit feuilles sont suffisants pour les procédures expérimentales ultérieures.
3. Après une infiltration sous vide dans l’obscurité pendant 30 minutes (figure 2B), maintenez les lamelles de chou immergées dans la solution enzymatique (figure 2C) dans l’obscurité à température ambiante pendant 4 à 16 heures supplémentaires.
   REMARQUE : Le temps de digestion enzymatique peut varier entre les cultivars de chou et doit être optimisé en fonction du génotype spécifique. Par exemple, 'Fuyudori' nécessite un temps de digestion plus long (16 h) que '228' (4 h) en raison de l’épaisseur plus épaisse des feuilles de 'Fuyudori'.
4. Diluer la solution contenant des protoplastes avec un volume égal de solution W5, qui se compose de 2 mM de MES (pH 5,7), 154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl₂, 5 mM de KCl et 5 mM de glucose (voir le tableau 1 pour la préparation), pour arrêter la digestion enzymatique.
5. Libérez la suspension du protoplast en tourbillonnant doucement ou à l’aide d’un agitateur orbital. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 μm dans un tube conique de 50 mL.
   REMARQUE : Les protoplastes isolés peuvent passer à travers une crépine cellulaire de 70 μm, tandis que les débris végétaux non digérés sont retenus par la crépine et ensuite retirés de la suspension. Les crépines à cellules peuvent être réutilisées et conservées dans de l’éthanol à 75 % après le lavage, mais il est nécessaire de rincer complètement les crépines à cellules avec une solution W5 pour éliminer l’éthanol résiduel avant utilisation.
6. Centrifuger la solution de protoplastes avec 150 x g pendant 2 min à 4 °C, puis retirer délicatement le surnageant. Lavez délicatement les protoplastes granulés en ajoutant 10 mL de solution W5 le long de la paroi du tube conique à un débit approximatif de 1 mL·^s-1. Centrifugez le tube à 150 x g pendant 2 min à 4 °C et répétez cette procédure de lavage pour assurer l’élimination complète de la solution enzymatique.
7. Remettez les protoplastes en suspension dans la solution W5 et placez-les sur de la glace pendant 30 min. Après l’incubation dans la glace, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette 1 mL à la fois jusqu’à ce que tout le surnageant soit retiré.
8. Remettre les protoplastes en suspension dans une solution de MMG pré-refroidie composée de 4 mM de MES (pH 5,7), 0,4 M de mannitol et 15 mM de MgCl₂ (voir le tableau 1 pour la préparation).
9. Mesurez la concentration de protoplastes à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la concentration finale à 4 x 10⁵ protoplastes·^mL-1 à l’aide d’une solution MMG.

3. Transfection des protoplastes

1. Mélanger un volume total de 10 μL de plasmide (5-10 μg) (Fichier supplémentaire 1) avec 100 μL de protoplastes (4 x 10^{4 protoplastes} ) et placer sur de la glace pendant 10 min.
   REMARQUE : Pour la purification de plasmide de qualité transfection, un kit plasmidique disponible dans le commerce est utilisé en suivant les instructions du fabricant. Environ 4 x 10⁴ protoplastes sont généralement utilisés dans un test de rapporteur à double luciférase. Pour les expériences à plus grande échelle, une plus grande quantité de protoplastes est disponible pour la transfection. Plus précisément, environ 2 x 10⁵ protoplastes transfectés avec 10 μg de plasmide présentent une efficacité de transfection prouvée allant de 30 % à 40 %.
2. Ajouter un volume égal (110 μL) de solution de PEG fraîchement préparée (voir le tableau 1 pour la préparation) contenant 40 % de polyéthylène glycol 4000 (PEG4000), 0,1 M de CaCl₂ et 0,2 M de mannitol dans la solution de protoplaste et mélanger délicatement.
3. Incuber le mélange de protoplastes à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 min, puis ajouter 440 μL de solution W5 pour terminer la réaction.
4. Centrifuger les protoplastes transfectés à 150 x g pendant 2 min à 4 °C et remettre la pastille en suspension dans 750 μL de solution W5 enrichie en oxygène. Transférez les protoplastes remis en suspension dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits pré-enduite de 1 % de BSA.
   REMARQUE : La solution W5 utilisée pour l’incubation cellulaire doit être remplie de bulles d’oxygène à l’aide d’un concentrateur d’oxygène (~90 % d’oxygène) relié à une pierre à air pendant 5 minutes (Figure 2D). Suite à ce processus d’oxygénation, la concentration finale d’oxygène dissous dans la solution W5 est passée de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 à 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, mesuré à l’aide d’un oxygénomètre dissous. Le volume de la solution W5 pour la remise en suspension du protoplaste transfecté dépend du type de plaque de culture cellulaire tissulaire utilisée. Pour les plaques de culture cellulaire à 12 ou 24 puits, il est conseillé de réduire le volume de la solution W5 pour atténuer le stress d’hypoxie pendant l’incubation en raison de la profondeur plus profonde dans les puits. Pour l’enrobage BSA, chaque puits de la plaque de culture a reçu 1 mL de solution BSA à 1 %, qui a été laissé enrober les puits pendant 10 s. La solution BSA a ensuite été éliminée de chaque puits, et les puits ont ensuite été remplis à nouveau avec de la solution W5. Cette procédure visait à créer une surface temporaire non adhérente à l’aide de BSA, empêchant efficacement les protoplastes de coller à la surface plastique de la plaque de culture lors des étapes expérimentales ultérieures.

4. Traitement de l’hypoxie sur les protoplastes du chou

1. Effectuez des traitements d’hypoxie d’origine chimique ou physique immédiatement après la transfection du protoplaste.
   REMARQUE : Il est recommandé d’appliquer le traitement par hypoxie immédiatement après la transfection du protoplaste. L’incubation prolongée des protoplastes peut diminuer la réponse d’hypoxie ultérieure.
   1. Pour l’hypoxie induite chimiquement sur les protoplastes du chou, ajoutez de l’OxyFluor, de l’EC-Oxyrase et du sulfite de sodium à la solution de protoplaste W5.
      REMARQUE : L’utilisation de 0,6 unité·^{mL-1 EC-oxyrase} , de 0,6 unité·^mL-1 d’OxyFluor et de 1 g·^mL-1 de sulfite de sodium dans W5 a été les conditions testées capables d’induire le promoteur BoADH1 et BoSUS1L (figure 3A) avec de faibles dommages à l’intégrité des protoplastes dans les deux variétés de chou examinées.
   2. En cas d’hypoxie induite par un sac de consommation d’oxygène, placez deux packs d’absorbeurs d’oxygène dans un bocal anaérobie de 3,5 L pour créer un environnement hypoxique.
2. Récoltez les protoplastes traités à l’hypoxie par centrifugation à 150 x g pendant 2 min à 4 °C. Congelez les protoplastes collectés à l’aide d’azote liquide et stockez-les dans un congélateur à -80 °C pour les tests ultérieurs.

5. Double dosage de la luciférase

1. Effectuez le test de rapporteur à double luciférase conformément aux instructions du fabricant, avec des modifications mineures.
   1. Remettre en suspension les protoplastes de chou dans 50 μL de 1x tampon de lyse passive et vortex pendant 10 s.
   2. Incuber des protoplastes perturbés sur de la glace pendant 10 min et recueillir le surnageant après centrifugation à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   3. Ajouter 20 μL de lysat cellulaire dans chaque puits de la microplaque. Versez 100 μL de réactif de dosage de la luciférase II dans les puits et mesurez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques.
   4. Ajouter 100 μL du réactif d’essai disponible dans le commerce dans chaque puits et mesurer l’activité de la Renilla luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Résultats

Ce travail a permis de développer un système d’expression transitoire utilisant des protoplastes de chou (voir la figure 1 pour le flux de travail). Des protoplastes ont été isolés chez des vraies feuilles de chou de 2 à 3 semaines de taille appropriée (figure 2A) chez des cultivars commerciaux de chou 'Fuyudori' et '228' par digestion cellulase/macérozyme et par infiltration sous vide foncé (figures 2B et C). Pour atténuer les conditions hypoxiques rencontrées par les protoplastes immergés pendant l’incubation, la solution W5 a été oxygénée à l’aide d’un barboteur à pierre à air relié à une machine à oxygène (Figure 2D). Ce processus a considérablement augmenté la concentration d’oxygène dissous dans la solution W5 de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 à 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1 après 5 min de bouillonnement d’oxygène. Après le processus d’isolement, le rendement en protoplastes a été de 1,04 x 10⁷ pour 'Fuyudori' et de 4,00 x 10⁶ protoplastes·g⁻¹ de poids frais pour '228' après une nuit de digestion (figure 2E). Par la suite, la GFP a été utilisée comme gène rapporteur pour évaluer l’efficacité de la transformation de la méthode de transfection médiée par le PEG, démontrant que l’efficacité de la transfection des protoplastes chez le chou était supérieure à 40 % chez les deux cultivars (figure 2F), confirmant ainsi la viabilité de ce système.

De plus, des constructions promotrices des gènes de réponse à la respiration anaérobie du chou, les vecteurs BoADH1p ::Luc et BoSUS1Lp ::Luc (Figure 3A), ont été introduites dans des protoplastes de chou en tant que rapporteurs pour évaluer les effets d’induction hypoxique de plusieurs traitements. Divers traitements d’ajustement de l’oxygène ont également été appliqués à ce système de modèle d’expression transitoire. Les résultats ont montré que tous les traitements de piégeage de l’oxygène, à l’exception du sulfite de sodium, induisaient avec succès une réponse d’hypoxie dans les protoplastes du chou (Figure 3B). Plus précisément, l’activité promotrice de BoADH1 a été multipliée par environ 2,6 et 3,2 par rapport au témoin après un traitement par EC-Oxyrase et OxyFluor, respectivement, et, notamment, par plus de 7,0 fois avec un traitement par pack d’absorbeur d’oxygène (Figure 3B). De même, l’activité du promoteur BoSUS1L a augmenté d’environ 1,7 fois et 1,8 fois avec le traitement EC-Oxyrase et OxyFluor, respectivement, tandis que le traitement par pack d’absorption d’oxygène a induit une augmentation substantielle de plus de 5,6 fois (Figure 3B). Ces résultats suggèrent que l’absorbeur d’oxygène démontre une efficacité supérieure dans la création d’un environnement hypoxique dans ce système expérimental de protoplaste de chou.

Figure 1 : Représentation graphique du flux de travail d’isolement des protoplastes. Cette figure illustre le processus étape par étape impliqué dans l’isolement des protoplastes du tissu foliaire du chou. Le flux de travail est représenté visuellement pour fournir une compréhension claire de la procédure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Isolement du protoplaste dans le tissu foliaire du chou. (A) L’apparition des variétés de chou commerciales 'Fuyudori' et '228' au stade de croissance recommandé est montrée. Les deuxièmes feuilles vraies nouvellement complètement développées (indiquées par la pointe de flèche) des choux au stade 2 feuilles sont sélectionnées pour l’isolement des protoplastes. Barre d’échelle : 2 cm. (B) Une pompe à vide et un dessiccateur sont utilisés pour le processus d’infiltration sous vide des lamelles de feuilles de chou, avec une infiltration de 30 minutes effectuée avant la digestion enzymatique. (C) L’état des lamelles de feuilles de chou pendant la digestion enzymatique est décrit. La digestion complète du tissu foliaire nécessite un total de 4 à 16 heures. Barre d’échelle : 3 cm. (D) Les photos montrent l’utilisation d’un concentrateur d’oxygène relié à une pierre à air pour augmenter la concentration d’oxygène dissous dans la solution W5. Barre d’échelle : 5 cm. (E) Plus de 4,00 x 10⁶ protoplastes du mésophylle par gramme de poids frais (FW) ont été obtenus à partir des variétés de chou 'Fuyudori' et '228' et ont été observés au microscope. Barre d’échelle : 200 μm. (F) L’efficacité de transfection des protoplastes des deux génotypes de choux, à l’aide d’un rapporteur GFP exprimé de manière constitutive, est supérieure à 40 %. Barre d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Réponse à l’hypoxie des protoplastes du chou dans des conditions de carence en oxygène. (A) Les constructions géniques de la réponse à l’hypoxie, les promoteurs BoADH1 et BoSUS1L, sont utilisées comme rapporteurs pour évaluer la réponse à l’hypoxie dans les protoplastes du chou 'Fuyudori'. (B) Un total de 5 μg de plasmides rapporteurs est transfecté dans des protoplastes de chou 'Fuyudori', qui sont incubés dans une solution W5 à bulles d’oxygène avant d’être exposés à des traitements d’hypoxie pendant 4 heures. Les niveaux d’oxygène sont réduits pendant l’incubation en ajoutant de l’EC-oxyrase (0,6 unité·^mL-1), de l’OxyFluor (0,6 unité·^mL-1) et du sulfite de sodium (1 g·^mL-1) à la solution W5. Le traitement de l’absorbeur d’oxygène est effectué en plaçant deux sacs d’absorption d’oxygène dans un bocal anaérobie de 3,5 L. Le groupe « CK » représente le groupe témoin sans aucun traitement contre l’hypoxie. Après le traitement, les protoplastes sont récoltés pour un double dosage de la luciférase. Chaque valeur représente la moyenne ± écart-type, avec n = 4. Des lettres différentes indiquent des différences significatives (P < 0,05) sur la base d’une ANOVA à un facteur avec test post-hoc LSD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Préparation de la solution enzymatique, de la solution W5 et de la solution MMG. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Détails du plasmide pour la transfection des protoplastes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole présente une méthode simplifiée pour l’isolement des protoplastes à partir de deux cultivars de chou commerciaux. L’efficacité de cette méthode est principalement évaluée à l’aide de deux paramètres critiques de contrôle de la qualité : le rendement des protoplastes viables et l’efficacité de la transfection des protoplastes. La mise en œuvre de ce protocole a permis d’obtenir un rendement supérieur à 4,00 x 10⁶ protoplastes·g⁻¹· FW du tissu du mésophylle des deux cultivars de chou (figure 2E, F). Ce rendement est comparable à ceux rapportés chez d’autres espèces, notamment l’aubergine, l’œillet, la canne à sucre et le Camellia oleifera, où les rendements en protoplastes variaient de 2,5 x 10⁶ à 1,4 x 10⁷ protoplastes·g⁻¹· FW 6,7,9,17. Ces résultats suggèrent l’applicabilité potentielle du protocole à divers contextes génétiques avec B. oleracea.

Le succès du protocole dépend de plusieurs facteurs critiques. La première est l’utilisation de feuilles spécifiées provenant de semis de chou sains à un stade de croissance approprié (figure 2A). L’utilisation de plantes plus anciennes ou malsaines peut entraîner des protoplastes de mauvaise qualité. Il est également crucial de couper soigneusement le tissu foliaire en bandes de 0,5 à 1,0 mm et d’éviter de l’écraser avec une lame émoussée. Le processus de digestion enzymatique, qui dure entre 4 et 16 heures, est une autre étape critique. Les périodes de digestion inférieures à 4 h peuvent entraîner une digestion incomplète, tandis que celles dépassant 16 h de digestion risquent un stress cellulaire. Notamment, les génotypes à feuilles plus épaisses, comme 'Fuyudori', peuvent bénéficier de temps de digestion prolongés pour maximiser le rendement en protoplastes. En revanche, '228' n’a nécessité que 4 heures pour une digestion complète. De plus, une large gamme de temps de digestion peut offrir une plus grande flexibilité dans la planification expérimentale. Par exemple, une digestion en 4 heures permet d’isoler les protoplastes et de réaliser les tests transitoires subséquents en une seule journée. À l’inverse, une digestion de 16 heures permet d’initier la digestion enzymatique le soir et de compléter les étapes subséquentes le lendemain, ce qui peut améliorer la commodité lors de l’application de ce protocole. De plus, il est crucial de manipuler les protoplastes en douceur tout au long du processus d’isolement des protoplastes en raison de leur fragilité et de leur sensibilité aux contraintes mécaniques.

Pour simuler des conditions anaérobies représentatives du stress d’inondation, ce protocole a utilisé des agents de piégeage d’oxygène courants et des sacs consommateurs d’oxygène pour créer des environnements hypoxiques. Pour améliorer l’efficacité du système, une machine à oxygène est utilisée pour oxygéner la solution W5 (Figure 2D), dans le but de réduire les signaux de réponse hypoxique de fond dans les protoplastes de chou pendant leur période d’incubation avant le traitement. Un processus d’oxygénation de 5 minutes augmente considérablement le niveau d’oxygène dissous de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 à 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, indiquant un effet prononcé dans l’atténuation des conditions hypoxiques. Parmi les méthodes de piégeage de l’oxygène utilisées dans cette étude, les packs d’absorbeurs d’oxygène ont montré des performances supérieures, induisant l’activité promotrice la plus élevée dans deux gènes centraux de la réponse anaérobie (Figure 3). De plus, cette méthode offre l’avantage supplémentaire de l’évolutivité, permettant le traitement simultané de plusieurs échantillons grâce à l’utilisation de sacs consommateurs d’oxygène dans un seul bocal anaérobie, par opposition à l’application individuelle d’agents de piégeage de l’oxygène sur chaque plaque de culture cellulaire. En résumé, les packs d’absorbeurs d’oxygène fournissent une plate-forme pratique et efficace adaptée à l’évaluation de la réponse des protoplastes du chou dans des conditions hypoxiques.

Bien que ce protocole présente plusieurs avantages, il est important de reconnaître ses limites, notamment l’efficacité de transfection relativement modeste des protoplastes du chou. Bien que cette efficacité n’atteigne pas les 90 % rapportés pour Arabidopsis⁵, elle s’avère néanmoins suffisante pour la réussite des études ultérieures sur l’activité du promoteur (Figure 3), indiquant un potentiel important pour l’analyse fonctionnelle dans ce système.

Compte tenu de l’importance mondiale du chou en tant que culture légumière majeure, l’intégration de ce protocole aux traitements par hypoxie et aux techniques d’analyse génétique est prometteuse pour mieux comprendre les mécanismes de régulation du chou dans des conditions d’inondation. De telles connaissances pourraient accélérer le développement de variétés de chou tolérantes aux inondations, répondant ainsi à un besoin critique face aux conditions météorologiques extrêmes et à l’augmentation des inondations.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide éthanesulfonique 2-(N-morpholino)	PhytoTech Labs	M825	Pour la préparation de solutions enzymatiques
228 graines de chou	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japon)
50 mL Tube conique	SPL Life Sciences	50050	Pour la préparation de solutions enzymatiques
Plaque de culture tissulaire à 6 puits	Alpha Plus	16106	Pour l’incubation de protoplastes
70 &mu ; Crépine à cellules m	Sorfa  ;	SCS701	Pour la filtration des protoplastes
Boîte de Pétri 9 cm	Alpha Plus	16001	Pour la digestion enzymatique
Bocal anaérobie	HIMEDIA	Bocal anaérobie 3,5 L	Pour le traitement de l’hypoxie  ;
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906	Pour la préparation de la solution W5 et l’enrobage de la plaque
de culture Chlorure de calcium	J.T.Baker	131301	Pour la préparation de la solution W5 et de la solution PEG
Cellulase R10	Yakult		Pour la préparation de la solution enzymatique
Dessiccateur	Tarsons  ;	402030	Pour l’infiltration sous vide
D-Glucose	Bioshop	GLU501	Pour la préparation de la solution W5
Compteur d’oxygène dissous	Thermo Scientific	Orion Star A223	Pour la mesure de l’oxygène
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	Pour la préparation de solutions enzymatiques, de solutions PEG et de solutions MMG
Système de dosage Dual-Luciferase Reporter	Promega	E1960	Pour le test de rapporteur à double luciférase
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	Pour le traitement de l’hypoxie
Graines de chou Fuyudori	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japon)
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse	Hitachi	CR21GIII	Pour la récolte de protoplastes
Macerozyme R10  ;	Yakult		Pour la préparation de solutions enzymatiques
Chlorure de magnésium	Alfa Aesar	12315	Pour la préparation de solutions MMG
Microcentrifugeuse	Hitachi	CT15RE	Pour la récolte de protoplastes
Greneuse	de microplaques	655075	Pour le dosage de la double luciférase rapporteure
Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires	SpectraMax Mini	Pour Dosage de la double luciférase
rapporteur Millex 0,22 &mu ; m filtre à seringue	Merck	SLGP033RS	Pour la préparation de solutions enzymatiques
Pompe à vide sans huile	Rocker  ;	Rocker 300	Pour l’infiltration sous vide
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	Pour le traitement de l’hypoxie
Pack absorbeur d’oxygène	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	Pour le traitement de l’hypoxie
Concentrateur d’oxygène	ULTIMATE PERFECT	AII-X	Pour le bouillonnement de l’oxygène dans la solution W5
Substrat végétal	Klasmann-Deilmann	Substrat Potgrond H	Pour la préparation des plants de chou
Kit Midi plasmide	QIAGEN	12145	Pour la purification de l’ADN plasmidique de qualité transfection
Polyéthylène Glycol 4000	Fluka	81240	Pour la transfection de protoplastes
Chlorure de potassium	J.T.Baker	304001	Pour la préparation de la solution W5
Lame de rasoir	Gillette		Pour la préparation des lamelles de chou
Chlorure de sodium	Bioshop	SOD002	Pour la préparation de la solution W5
Sulfite de sodium	Sigma-Aldrich	S0505	Pour le traitement de l’hypoxie
Bain-marie	Yihder	BU-240D	Pour la préparation d’une solution enzymatique