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Article de méthode

Injection intraveineuse optimisée chez le poisson-zèbre adulte

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DOI :

10.3791/67463

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20 décembre 2024

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1Department of Medicine, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2ZeBlast Technology Limited, Hong Kong Science Park, 3Centre for Oncology and Immunology, Hong Kong Science Park

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole optimisé et efficace pour l’injection intraveineuse de cellules ou d’agents pharmacologiques chez le poisson-zèbre adulte, entraînant une meilleure prise de greffe cellulaire et une augmentation des taux de survie du poisson-zèbre traité.

Résumé

L’injection intraveineuse (IV) est largement reconnue comme la méthode la plus efficace et la plus couramment utilisée pour obtenir une administration systémique de substances dans les modèles de recherche sur les mammifères. Cependant, son application chez le poisson-zèbre adulte pour l’administration de médicaments, la transplantation de cellules souches et les études régénératives et sur le cancer a été limitée en raison des défis posés par leur petite taille corporelle et leurs vaisseaux sanguins complexes. Pour surmonter ces limitations, des techniques d’injection alternatives telles que l’injection intracardiaque et rétro-orbitaire (OI) ont été explorées dans le passé pour la transplantation de cellules souches chez le poisson-zèbre adulte. Cependant, ces techniques ont leurs inconvénients, notamment la nécessité de techniques d’injection méticuleuses ou un risque accru de mortalité.

Dans cette étude, nous avons mis au point une procédure d’injection IV affinée et optimisée spécialement adaptée aux poissons-zèbres adultes, en répondant aux défis associés à leur anatomie unique. Pour démontrer l’efficacité de cette technique, nous avons effectué avec succès des injections IV de cellules de moelle rénale entière de poissons Tg (mpo : EGFP) et de colorant FITC-dextran chez des poissons Casper adultes. La visualisation ultérieure des cellules injectées et des colorants à l’aide d’un microscope à fluorescence a confirmé leur livraison et leur greffe réussies dans le poisson zèbre. De plus, nous avons démontré que par rapport aux injections intracardiaques et OI, l’injection IV entraînait une amélioration des taux de survie et de l’efficacité de la greffe chez le poisson-zèbre traité. Cette approche permet l’administration et la localisation précises des substances et présente un grand potentiel pour le dépistage de drogues et de produits chimiques à grande échelle à l’aide de poissons-zèbres adultes. De plus, la possibilité de suivre visuellement les cellules et les colorants injectés fournit des informations inestimables sur leur greffe, leur migration et leurs interactions avec les tissus de l’hôte, permettant une évaluation plus complète des effets thérapeutiques et des processus biologiques dans les modèles de poisson-zèbre.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle précieux dans la recherche biomédicale, principalement en raison de sa similitude génétique avec les humains, avec plus de 70 % des gènes humains ayant des homologues de poisson-zèbre 1,2. Cette ressemblance génétique, combinée à la taille compacte du poisson-zèbre, à son cycle de développement rapide et à sa capacité de manipulation génétique étendue, en fait un outil puissant pour l’exploration scientifique. Ces attributs sont particulièrement avantageux pour les expériences impliquant la transplantation cellulaire, l’administration de médicaments et le traçage cellulaire. De plus, la clarté optique des larves transparentes et des mutants de pigmentation spécifiques, tels que le poisson-zèbre Casper, permet une visualisation précise des cellules ou des substances transplantées, offrant une alternative plus efficace et plus rentable aux modèles animaux traditionnels.

Le poisson-zèbre est largement utilisé pour développer des modèles de transplantation de cancer et pour effectuer des dépistages de médicaments pour des maladies graves comme le gliome, le mélanome, les tumeurs pancréatiques et la leucémie 3,4,5,6,7,8,9,10. En règle générale, ces modèles sont initiés au stade larvaire pour tirer parti du système immunitaire immature des larves et de leur transparence inhérente, ce qui simplifie le processus d’injection et améliore la faisabilité des études à court terme. Cependant, l’utilisation de larves limite la durée d’évaluation de la greffe et des interventions thérapeutiques 7,11. La transition de ces protocoles expérimentaux vers le poisson-zèbre adulte présente des défis tels que des procédures d’injection plus complexes, une efficacité de greffe réduite, des taux de mortalité plus élevés et une variabilité accrue des réponses individuelles. Ces défis soulignent le besoin critique d’améliorer les techniques d’injection et d’administration de substances, en particulier pour les études impliquant des poissons-zèbres adultes qui nécessitent de longues périodes d’observation.

Historiquement, les injections intracardiaques12 et rétro-orbitales (RO)13 ont été les principales méthodes d’administration de médicaments et de transplantation cellulaire chez le poisson-zèbre adulte. L’injection intracardiaque, qui consiste à injecter des substances directement dans le cœur, assure une circulation systémique immédiate des médicaments, mais est associée à des risques importants, notamment des lésions cardiaques potentielles et une mortalité élevée. D’autre part, l’injection d’osmose inverse, qui délivre des matériaux au sinus veineux derrière l’œil, favorise également une distribution systémique rapide, mais peut être stressante pour le poisson et exige une grande précision d’exécution14. Les injections IV, bien établies pour l’administration systémique de substances chez les souris et les rats, sont cruciales pour les études pharmacocinétiques, les évaluations de l’efficacité des médicaments et les interventions thérapeutiques dans ces modèles 15,16,17,18. Récemment, les injections IV ont pris de l’importance dans la recherche sur le poisson-zèbre, en particulier dans les études sur les réponses immunitaires innées19,20 et les lésions rénales aiguës21 chez les larves de poisson-zèbre. Cependant, leur application chez les poissons-zèbres adultes reste limitée.

Dans cette étude, nous avons développé et optimisé une procédure d’injection IV spécialement conçue pour le poisson-zèbre adulte, ce qui améliore considérablement les taux de survie, la précision et l’efficacité de l’administration. Nous démontrons visuellement cette méthode et fournissons un protocole détaillé à l’aide de cette technique raffinée. Nous avons administré avec succès des injections IV de cellules de moelle rénale entière (WKM) de poissons Tg (mpo : EGFP) et de colorant FITC-dextran chez des poissons Casper adultes, avec confirmation de l’administration et de la greffe évaluées par microscopie fluorescente. Nos résultats montrent que la technique d’injection IV raffinée est plus efficace et plus cohérente que les méthodes intracardiaques et RO traditionnelles. Alors que l’utilisation du poisson-zèbre dans la recherche scientifique continue de se développer, l’adoption de cette technique d’injection IV améliorée est susceptible d’améliorer notre compréhension de la pathogenèse des maladies et d’accélérer le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’utilisation des animaux de laboratoire et de recherche (CULATR) de l’Université de Hong Kong (HKU).

1. Préparation du matériau d’injection

  1. Préparez le milieu de suspension cellulaire : 0,9 x PBS + 5 % de sérum fœtal bovin (FBS) + 1 % de pénicilline/streptomycine (Pen/Streptomycine).
  2. Stérilisez la seringue Hamilton et l’aiguille qui s’y trouve (34 G, longueur de 10 mm, capacité de 10 μL, voir le tableau des matériaux) sous une lumière UV d’une longueur d’onde de 270 à 280 nm et exposez les articles pendant 2 h.
  3. Préparez des cotons-tiges stérilisés, des tampons en mousse et du papier de soie.
  4. Préparez le mélange d’anesthésie en diluant la tricaïne avec de l’eau de poisson stérilisée à une concentration finale de 0,2 mg/mL.
  5. Pour la transplantation de cellules WKM chez le poisson Casper , 2 jours avant la transplantation, administrer une dose d’irradiation sublétale de 25 Gy, divisée en deux séances de 12,5 Gy chacune, administrée le même jour avec un intervalle de 7 à 8 heures entre les doses. Pour le processus d’irradiation, placez 5 à 10 poissons adultes dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant de l’eau de poisson et exposez-les dans un irradiateur gamma.
    REMARQUE : D’après l’analyse de la survie, la dose a été jugée sublétale après l’exposition de poissons Casper à divers niveaux d’irradiation allant jusqu’à 35 Gy, surveillés pendant 30 jours (figure 1A). La durée exacte de l’exposition doit être calibrée en fonction des réglages de l’irradiateur. Aucune irradiation n’est nécessaire pour les procédures impliquant uniquement l’administration de médicaments.
  6. Utiliser un stérilisateur à vapeur autoclave de laboratoire pour stériliser l’eau du poisson destinée à l’hébergement des poissons traités (voir la Table des matières) afin de prévenir les infections et d’assurer un environnement de récupération sûr pour le poisson après l’injection.
    REMARQUE : Le processus de stérilisation est adapté à l’unité d’autoclave spécifique utilisée, et nous adhérons aux directives du fabricant pour l’autoclave des solutions liquides pour préparer l’eau du poisson.
  7. Préparez le tampon de lavage des aiguilles : plusieurs tubes d’éthanol à 75 % et de l’eau ultrapure dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml.
  8. Préparez le tampon de transplantation en dissolvant le FITC-Dextran (poids moléculaire : 10 000) dans le milieu de suspension cellulaire préalablement préparé (0,9x PBS avec 5 % de FBS et 1 % de Pen/Strep). Ajustez la concentration à 100 μg/mL.
    REMARQUE : Ce tampon sera utilisé pour les injections, avec un volume prévu de 2 μL par poisson.

2. Préparation de la moelle rénale entière pour la transplantation

  1. Euthanasier le nombre nécessaire de poissons Tg(mpo : EGFP) en les immergeant dans une solution de tricaïne à 0,4 mg/mL, en veillant à ce qu’ils restent dans la solution pendant au moins 10 minutes après l’arrêt du mouvement operculaire.
  2. Disséquer le poisson Tg(mpo : EGFP) pour isoler et transférer la moelle rénale (KM) dans le milieu de suspension cellulaire à l’intérieur d’un tube de microcentrifugation de 1,5 mL comme décrit précédemment22.
  3. Désagréger les cellules KM par pipetage et filtrage de la suspension à travers une crépine de cellules en nylon de 40 μm.
  4. Centrifuger la suspension à 500 × g pendant 8 min.
  5. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de milieu de suspension cellulaire.
  6. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatisé avec une aliquote de 10 μL de la suspension cellulaire.
  7. Centrifuger à nouveau à 500 × g pendant 8 min.
  8. Ajustez la concentration cellulaire à 150 000 cellules/μL à l’aide du tampon de transplantation.

3. Procédure d’injection

  1. Lavez soigneusement la seringue Hamilton 3-4x avec de l’éthanol à 75 % avant l’injection. Rincez la seringue 3 à 4 fois avec de l’eau ultra-pure pour éliminer tout résidu d’éthanol.
  2. Administrez l’anesthésie au poisson-zèbre en l’immergeant dans le mélange d’anesthésie jusqu’à ce qu’il soit complètement anesthésié, ce qui se traduit par une diminution des mouvements et une perte des réponses réflexes. Une fois que les poissons sont sous sédation, positionnez-les avec leur face dorsale vers le haut et leur tête orientée vers la gauche (Figure 1B). Posez soigneusement le poisson sur du papier de soie propre et humide, ce qui aidera à les stabiliser pour l’injection. Assurez-vous que le tissu est suffisamment humide pour empêcher le poisson de se dessécher, mais pas trop humide pour ne pas le faire glisser.
  3. Saisissez fermement la seringue Hamilton et inclinez l’aiguille à ~45° par rapport au vaisseau primaire (la veine caudale) pour la cibler efficacement tout en minimisant les dommages aux tissus environnants. Pour le poisson-zèbre Capser , visez une section du récipient qui est visible à travers son corps translucide pour un placement précis de l’aiguille (Figure 1B). Pour le poisson-zèbre de type sauvage (Tübingen, TU) à peau pigmentée, visez les vaisseaux primaires qui se trouvent le long de l’axe du corps et à l’arrière de l’anus dans la région des vaisseaux primaires (Figure 1B). Insérez doucement et doucement l’aiguille dans le récipient désigné, administrez l’injection (2 μL) lentement pour minimiser le stress, assurez une absorption optimale de la substance et appliquez une légère pression sur le site avec un coton-tige pendant 10 s pour contrôler tout saignement après l’injection.
  4. Observer au microscope pour confirmer la présence de signaux GFP, assurant ainsi l’efficacité de l’injection. Vérifiez que les cellules ou les colorants apparaissent comme des signaux verts à l’intérieur du récipient (Figure 2A).
  5. Laissez le poisson se rétablir dans de l’eau de poisson fraîchement stérilisée après l’injection pendant 10 minutes jusqu’à ce qu’il soit transféré dans un réservoir statique.
  6. Nettoyez l’aiguille comme décrit précédemment entre les injections de différents réactifs.
  7. Pour éviter l’agglutination des cellules, agitez la suspension des cellules toutes les 10 minutes pour les remettre en suspension.
  8. Maintenir un maximum de 15 poissons transplantés dans un réservoir de 4 L dans des conditions d’eau statique pendant la durée du traitement. Vous pouvez également loger les poissons transplantés individuellement dans des réservoirs statiques de 1 L. Équipez le réservoir d’une pompe à oxygène et effectuez des changements d’eau quotidiens pour minimiser le risque d’infection.
  9. Surveiller et évaluer l’expression de la GFP par cytométrie en flux chez le poisson environ 14 jours après la transplantation afin d’évaluer le taux de greffe. Enregistrez la mortalité quotidienne des poissons pour calculer avec précision les taux de survie. Effectuez une ANOVA à un facteur pour l’analyse de la greffe et le test Log-rank pour l’analyse de survie.

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Résultats

Pour évaluer l’efficacité et la précision de différentes méthodes d’injection chez les poissons Casper adultes, une analyse comparative a été réalisée à l’aide de techniques intracardiques, OI et IV (figure 2A). Des quantités variables de cellules WKM de poissons Tg(mpo : EGFP) ont été injectées, chacune mélangée avec un colorant FITC-dextran à des concentrations de 1 × 105 et de 3 × 105 cellules. Le succès de chaque méthode a été déterminé par une éva...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons développé un protocole d’injection IV adapté au poisson-zèbre adulte afin d’améliorer la précision et la cohérence de l’administration de cellules ou de médicaments. Un élément essentiel de cette méthode est la capacité de localiser et de visualiser la veine primaire, ce qui est crucial pour l’administration précise des substances. Bien que la souche translucide de poisson-zèbre Casper soit recommandée pour une visibilité optimale du navire, notre pr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions l’installation du poisson-zèbre du Centre de recherche en médecine comparée (CCMR) de l’Université de Hong Kong. Nous remercions Mme Jo Yiu Ling Wong pour l’aide apportée aux animaux. Les travaux ont été soutenus par le programme de recherche thématique (T12-702/20-N), les projets n° 08192066 et n° 08193106, le programme de recherche conjoint 2021/22 du Conseil des subventions de recherche (RGC) 2021/22 N_HKU745/21, le programme national de R&D clé de Chine (2023YFA1800100) et le Centre d’oncologie et d’immunologie dans le cadre de l’initiative Health@InnoHK financée par la Commission de l’innovation et de la technologie, le gouvernement de la RAS de Hong Kong, Chine (A.Y.H.L.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Autoclaves stérilisateur à vapeurHIRAYAMA  ;HRG-140
Centrifugeuse 5424Eppendorf
Countess 3 Compteur de cellules automatiséThermofisher
Countess II FLInvitrogen
Ethyl 3-aminobenzoate de méthanesulfonate sel (Tricaine)Sigma-aldrichMKCL9483
Falcon 40 µ ; Crépine à cellules mCORNINGBleu, stérile, emballé individuellement, 50/caisse
FBS, qualifiéGibco26140079
FITC-Dextran (MW 10000)  ;MedChemExpress60842-46-8
Aiguille d’injectionHamilton ;HAMI20743434 G, longueur 10 mm
Micro seringueHamilton  ;7635-01  ;10 et micro ; Capacité L, modèle 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7,4 (1x)Gibco10010023
Pénicilline-Streptomycine (5 000 U/mL)Gibco&trade ;15070063100x
pointes de pipetteEppendorf  ;epTIPS
Pipette monocanalEppendorf  ;05-403-151
Eau distillée ultrapureInvitrogen10977015

Références

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  22. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. (54), e2839(2011).

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