Article de méthode

Essai d’imagerie par nano-injection de citerne magna appariée et de contraste de chatoiement laser pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral in vivo

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DOI :

10.3791/67544

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8 juillet 2025

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral in vivo, les méthodes pharmacologiques traditionnelles sont invasives, endommageant souvent le crâne, la dure-mère et les leptoméninges. Dans ce travail, nous avons développé une technique mini-invasive qui combine l’injection intracisternale magna (ICM) guidée par nano-injecteur avec l’imagerie de contraste laser speckle, préservant ainsi l’intégrité du crâne et des leptoméninges.

Résumé

La régulation du flux sanguin cérébral (CBF) est cruciale pour le maintien des fonctions cognitives, mais ses mécanismes sous-jacents restent mal compris. L’étude des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans cette régulation nécessite une approche pharmacologique qui permet une administration précise du médicament dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) tout en permettant une surveillance en temps réel de la dynamique du flux sanguin cérébral. Dans cet article, nous présentons une méthode d’étude de la régulation du flux sanguin cérébral in vivo en combinant l’injection intracisternale magna (ICM) à base de nano-injecteurs avec l’imagerie de contraste de chatoiement laser.

La technique d’injection ICM basée sur un injecteur de nanolitres permet une administration précise du médicament dans une plage dynamique de nL/min à μL/min. Dans nos expériences, cette approche a considérablement réduit le volume d’injection de 5-10 μL traditionnel à seulement 1,5 μL, maintenant ainsi une pression intracrânienne normale. Lorsqu’il est combiné à l’imagerie par contraste de chatoiement laser, nous avons pu surveiller la dynamique du flux sanguin cérébral (CBF) en temps réel avant, pendant et après les injections d’ICM.

À l’aide de cette méthode, nous avons évalué les changements de CBF en réponse à l’injection ICM de trois vasodilatateurs différents : la (S)-3,5-dihydroxyphénylglycine (DHPG), l’acétylcholine et l’adénosine. Bien que les trois vasodilatateurs aient augmenté le CBF basal, ils ont eu des effets distincts sur la dynamique du CBF. Par exemple, l’impact de l’adénosine était transitoire, tandis que la DHPG et l’acétylcholine produisaient des effets durables. Avec ses avantages uniques, cette méthode représente un ajout précieux à la boîte à outils de l’étude de la régulation du CBF chez les rongeurs in vivo.

Introduction

Le flux sanguin cérébral (CBF) assure un apport continu d’oxygène et de nutriments au cerveau tout en éliminant les déchets métaboliques, qui sont essentiels au maintien de fonctions cognitives normales 1,2. Dans des conditions homéostatiques, le CBF reste relativement stable malgré les fluctuations de la pression de perfusion, un processus connu sous le nom d’autorégulation 3,4,5. En plus de l’autorégulation, le CBF local peut être ajusté dynamiquement en réponse à l’activité neuronale voisine, un phénomène appelé couplage neurovasculaire 6,7. L’autorégulation et le couplage neurovasculaire sont régulés par un groupe de cellules - cellules endothéliales, cellules murales, astrocytes, fibroblastes et neurones - collectivement connus sous le nom de cellules unitaires neurovasculaires 4,7. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels ces différents types de cellules se coordonnent pour moduler le CBF sont encore largement inconnus.

Les méthodes d’étude de la régulation du CBF sont généralement divisées en modèles in vitro et in vivo. Les études in vitro, utilisant souvent des coupes cérébrales aiguës, sont généralement combinées à des techniques électrophysiologiques ou pharmacologiques pour examiner comment les neurones et les cellules gliales régulent la dilatation ou la constriction des vaisseaux sanguins individuels 8,9,10. La principale limite des modèles in vitro est qu’ils ne reproduisent pas les conditions in vivo, en particulier l’absence de pression artérielle physiologique. Les modèles in vivo pour l’étude de la régulation du CBF vont de l’approche à l’échelle macroscopique à l’approche à l’échelle microscopique. Les techniques à l’échelle macroscopique, telles que la tomographie par émission de positons (TEP) et l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), sont non invasives mais présentent une faible résolution spatiale et temporelle 11,12,13,14.

La principale méthode à microéchelle pour étudier le CBF in vivo est l’imagerie à deux photons, qui fournit une résolution spatio-temporelle élevée 9,15,16,17,18. Cependant, cette technique nécessite l’ablation du crâne et de la dure-mère, et lorsqu’elle est combinée à une manipulation pharmacologique, elle devient encore plus invasive, provoquant potentiellement une hémorragie, endommageant les tissus cérébraux et modifiant la pression intracrânienne19. Par conséquent, il est crucial de disposer d’une méthode de manipulation et de surveillance du CBF in vivo qui réponde à des critères spécifiques : elle doit être non invasive (préservant l’intégrité du crâne, des leptoméninges et des vaisseaux), fournir une haute résolution spatio-temporelle et permettre une manipulation pharmacologique précise du CBF. Dans cet article, nous présentons une nouvelle méthode qui combine l’injection intracisternale magna (ICM) basée sur un injecteur de nanolitres et l’imagerie de contraste de chatoiement laser, répondant à toutes ces exigences.

Les approches pharmacologiques traditionnelles pour étudier la régulation du CBF impliquent souvent l’ablation du crâne et des méninges afin d’exposer le tissu cérébral à l’administration locale de médicaments. En revanche, l’injection d’ICM évite ces dommages en administrant des médicaments directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR), ce qui leur permet de suivre le flux naturel du LCR et donc de mieux imiter les conditions physiologiques. L’un des défis de l’injection ICM est qu’elle nécessite généralement de grands volumes de liquide, souvent 5 μL ou plus chez la souris20. Étant donné que le volume total du LCR chez les souris adultes est d’environ 36 μL, l’injection de 5 μL peut augmenter la pression intracrânienne et modifier la dynamique du CBF. Notre système de nano-injecteurs, qui utilise des pipettes en verre, délivre le fluide avec un contrôle précis du volume et de la vitesse sans provoquer de fuite de LCR au site d’injection.

L’uréthane et l’alpha-chloralose sont utilisés dans notre étude car ils fournissent une base physiologique plus stable du flux sanguin cérébral et préservent le couplage neurovasculaire (CNV) mieux que les alternatives couramment utilisées comme l’isoflurane ou la kétamine/xylazine (KX). À l’aide de ce système, nous avons testé trois vasodilatateurs différents-(S)-3,5-Dihydroxyphénylglycine (DHPG), l’acétylcholine et l’adénosine, et avons confirmé qu’il permet une manipulation et un suivi précis de la dynamique du CBF in vivo.

Protocole

Ce protocole a été approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie. Toutes les expériences étaient conformes au Guide des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire. Six souris mâles C57BL/6, âgées de 10 à 14 semaines, ont été utilisées pour les expériences. Les procédures chirurgicales sont décrites à la figure 1A.

1. Préparation à l’opération

  1. Placez un coussin chauffant sur le cadre stéréotaxique et préchauffez-le à 37 °C ~ 20 min avant l’opération. Préparez de l’uréthane frais (750 mg/kg) et du chloralose (50 mg/kg) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour l’anesthésie.
    REMARQUE : Pour la préparation de la solution d’alpha-chloralose dans du PBS, nous avons chauffé la solution dans un bain-marie à 40 °C et l’avons tourbillonnée toutes les 10-15 minutes jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute. Les solutions d’uréthane et d’alpha-chloralose ont été filtrées à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm avant utilisation.
  2. Avant l’opération, rassemblez tous les outils chirurgicaux nécessaires, y compris des ciseaux, des pinces, des porte-micro-aiguilles, des hémostatiques, des cotons-tiges, des essuie-glaces et des sutures. Stérilisez les instruments à l’autoclave (121 °C à 15 psi pendant 60 min).
  3. Préparez des tubes capillaires en verre (diamètre extérieur 1,14 mm, diamètre intérieur 0,53 mm, 88,9 mm de longueur). À l’aide d’un extracteur de verre, créez des pipettes en verre pour injection21. La résistance préférée de la pipette est d’environ 80 à 100 MΩ. Stérilisez et conservez les pipettes en verre dans un récipient propre.
  4. Préparez un nano-injecteur avec le volume d’injection (25 nL - 4,5 μL) et la vitesse d’injection (6 nL/s - 644 nL/s).
  5. Préparez les solutions vasodilatatrices suivantes dans le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) : (S)-3,5-dihydroxyphénylglycine (DHPG) à 5 mM, acétylcholine à 0,5 mM et adénosine à 10 mM.
  6. Préparez le méloxicam (4,0 mg/kg) pour soulager la douleur pendant la chirurgie. Administrer du méloxicam par voie sous-cutanée aux souris environ 30 minutes avant la chirurgie pour assurer une analgésie adéquate.

2. Intervention chirurgicale

  1. Peser six souris mâles C57BL/6 (âgées de 10 à 14 semaines) et les anesthésier par injection intrapéritonéale d’uréthane (750 mg/kg) et de chloralose (50 mg/kg). Placez les souris dans une chambre d’anesthésie avec 1 % d’isoflurane pour maintenir l’anesthésie. Ce processus prend environ 40 min à 1 h.
    REMARQUE : L’isoflurane peut accélérer l’induction de l’anesthésie.
  2. Retirez soigneusement les souris de la chambre d’anesthésie et évaluez la profondeur de l’anesthésie en confirmant l’absence du réflexe de pincement des orteils. À l’aide d’un coton-tige, appliquez de la crème dépilatoire sur le haut du crâne et la nuque pour enlever la fourrure.
  3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse et réappliquez-en au besoin tout au long de la procédure. Surveillez régulièrement pendant l’expérience et administrez une pommade supplémentaire si nécessaire.
  4. Positionnez la souris en position couchée à l’intérieur du cadre stéréotaxique, en assurant une ventilation adéquate avec de l’air médical à un débit de 1 à 2 L/min. Fixez la souris avec des barres d’oreille pour une bonne fixation, puis inclinez doucement la tête vers le bas pour former un angle de 120° avec le corps, exposant ainsi la citerne magna.
    REMARQUE : L’isoflurane est exclusivement utilisé pour l’induction de l’anesthésie et non pendant la phase d’entretien.
  5. Désinfectez la zone chirurgicale à l’aide d’au moins trois applications alternées d’alcool à 70 % et d’un gommage chirurgical (p. ex., chlorhexidine ou povidone iode) pour assurer une stérilisation adéquate de la peau.
  6. Localisez la crête occipitale à l’aide d’un microscope chirurgical. Soulevez la peau sus-jacente à l’aide d’une pince à épiler et faites une incision médiane de 1 cm. Contrôlez tout saignement avec des cotons-tiges.
  7. Exposez les muscles du cou et incisez-les soigneusement et séparez-les le long de la ligne médiane à l’aide d’une pince. Utilisez deux pinces incurvées, une dans chaque main, pour rétracter doucement les muscles et exposer la dure-mère, qui forme la limite externe de la citerne magna.
  8. Ajustez la position de la tête en l’inclinant vers le bas pour former un angle de 150° avec le corps pour une exposition optimale de la citerne magna.
  9. Faites une incision de 5 mm le long de la suture sagittale, en couvrant les points lambda et bregma. À l’aide de deux pinces incurvées, écartez doucement la peau et nettoyez la surface du crâne avec une solution saline. Assurez-vous qu’aucun cheveu ne reste sur le crâne exposé.
  10. Après le nettoyage, appliquez une couche de gel à ultrasons de ~ 1 mm d’épaisseur sur le crâne exposé à l’aide de cotons-tiges pour maintenir l’humidité dans la zone. Étant donné que le gel à ultrasons peut contenir des bulles d’air, assurez-vous que toutes les bulles d’air sont éliminées avant l’imagerie.
  11. Placez la souris sous l’objectif du système d’imagerie par contraste de chatoiement laser. Mettez le système et les logiciels qui l’accompagnent. Assurez-vous que le cerveau de la souris est centré dans le champ d’imagerie, puis utilisez la fonction de mise au point automatique pour obtenir la mise au point correcte pour l’imagerie. Si nécessaire, retirez délicatement les poils ou les bulles d’air restants du champ d’imagerie à l’aide d’une pince à épiler.

3. Configuration de la nano-injection

  1. Fixez la pompe au bras manipulateur stéréotaxique et connectez le câble au contrôleur. Allumez le contrôleur et sélectionnez la pompe cible. Dans le panneau de configuration, réglez DIRECTION sur INFUSE. Réglez la vitesse sur 2 μl par minute et le volume sur 4,5 μl.
    REMARQUE : Le système de nano-injection se compose de deux composants principaux : la pompe d’injection et le contrôleur. Chaque contrôleur peut faire fonctionner deux pompes simultanément. Pour l’injection ICM, nous n’utilisons qu’une seule pompe.
  2. Une fois l’INFUSE terminé, sortez une pipette en verre du récipient et remplissez-la d’huile minérale incolore et inodore à l’aide d’une aiguille flexible MicroFil de 34 g ou d’un type d’aiguille similaire. Assurez-vous que toute la pipette en verre est remplie d’huile.
  3. Dévissez la pince de serrage de la pompe, insérez la pipette en verre, puis serrez la pince. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur de la pipette en verre.
  4. Changez la DIRECTION dans le panneau de configuration pour RETIRER. Réglez la vitesse sur 2 μ L/min et le volume sur 4,5 μ L.
  5. Déplacez le bras stéréotaxique pour introduire doucement la pipette dans la solution préparée et prélever le volume souhaité.

4. Injection de vasodilatateurs dans la citerne magna et surveillance du CBF

  1. Assurez-vous que la pompe est solidement fixée au bras manipulateur stéréotaxique. Ajustez l’angle du bras manipulateur stéréotaxique à 45° dans le plan antéro-postérieur.
  2. À l’aide d’une pince à épiler incurvée sous le microscope de dissection, exposez soigneusement la citerne magna. Nettoyez la zone avec une solution saline pour éliminer tout sang. Utilisez le micromanipulateur stéréotaxique pour positionner la pipette en verre près de la dure-mère de la citerne magna.
  3. Une fois que la pipette en verre touche la dure-mère, manœuvrez-la doucement pour passer au centre de la citerne magna, en évitant toute pénétration dans le cervelet ou la moelle. Assurez-vous que l’extrémité de la pipette en verre est insérée à une profondeur de 1 à 2 mm avant de relâcher la pince à épiler.
    REMARQUE : Un cadre stéréotaxique numérique est essentiel pour surveiller la profondeur de pénétration de la pipette en verre dans la citerne magna.
  4. Changez la DIRECTION dans le panneau de configuration en INFUSE. Réglez la vitesse d’injection sur 300 nL/min et le volume sur 1,5 μL.
  5. Lancez le logiciel d’imagerie par contraste de chatoiement laser (LSCI) et ajustez la mise au point pour obtenir l’image la plus claire des vaisseaux sanguins. Assurez-vous qu’il n’y a pas de cheveux ou de bulles d’air dans le champ de vision.
  6. Réglez l’intervalle d’imagerie sur 5 s dans le panneau de configuration LSCI. Enregistrez le CBF de référence pendant environ 10 minutes, en vous assurant que la ligne de base reste stable. S’il y a des fluctuations dans la ligne de base, continuez l’enregistrement pendant une durée plus longue jusqu’à ce que la stabilité soit atteinte.
  7. Après 10 min d’enregistrement de base stable, lancez la nano-injection et notez l’heure de début de l’injection dans le système d’enregistrement LSCI. Une fois l’injection terminée, marquez l’heure de fin et poursuivez l’enregistrement pendant 20 minutes supplémentaires ou plus. Une fois l’expérience terminée, perfusion transcardiaque les souris avec PBS et collecte des tissus cérébraux pour une analyse histologique.

Résultats

Une fois l’opération terminée, nous avons fixé la souris dans un cadre stéréotaxique avec un affichage numérique (Figure 1A, B). Pour la mesure du débit sanguin cérébral (CBF), nous avons soigneusement séparé la peau du crâne après l’incision et appliqué un gel à ultrasons transparent pour maintenir l’humidité à la surface du crâne (Figure 1C). Pour faciliter l’injection intracisternale magna (ICM), nous avons disséqué les muscles du cou autour de la crête occipitale pour exposer la citerne magna. Après cela, nous prélevons la solution cible avec une pipette en verre et utilisons le micromanipulateur pour guider la pipette en verre afin qu’elle pénètre les membranes de la citerne magna à une profondeur de 1 à 2 mm (Figure 1D, E). Le bras stéréotaxique a été incliné à un angle de 45o pour faciliter l’insertion.

Ensuite, nous avons examiné les changements dynamiques du CBF en réponse à trois vasodilatateurs différents : la (S)-3,5-dihydroxyphénylglycine (DHPG), l’acétylcholine et l’adénosine 22,23,24,25. Nous avons d’abord enregistré une ligne de base de 10 minutes avant d’injecter 1,5 μL de chaque vasodilatateur à la vitesse de 300 nL/min pendant 5 min. Après l’injection, nous avons enregistré 20 minutes supplémentaires de données. Nos résultats ont montré que les trois vasodilatateurs augmentaient le CBF, bien qu’avec une dynamique distincte. La DHPG a induit une forte augmentation du CBF, suivie d’une baisse progressive après injection (Figure 2A,B). En revanche, l’acétylcholine a provoqué une augmentation progressive de la FBC tout au long de la période d’enregistrement (figures 2C et D). L’adénosine a également produit une augmentation transitoire du CBF, qui est revenu au niveau de base environ 15 à 20 minutes après l’injection (Figure 2E,F).

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Figure 1 : Résumé des procédures chirurgicales. (A) Principales procédures chirurgicales étape par étape pour la nanoinjection + modèle LSCI. (B) Schémas montrant le système combiné nanoinjection + LSCI. Le nanoinjecteur est fixé de manière stable sur le bras stéréotaxique et le bras est incliné de 45o pour faciliter la pénétration de la membrane atlanto-occipitale dans la citerne magna. (C) Vue de haut en bas du crâne de la souris sous le système LSCI. Le crâne est recouvert d’un gel à ultrasons. (D) Vue de dos montrant la pipette en verre pénétrant dans la magna cisternale. La pipette en verre a été remplie de bleu Evans pour faciliter la visualisation. Utilisez le cadre stéréotaxique numérique pour cette expérience afin que la distance de pénétration puisse être quantifiée avec précision. (E) Schémas montrant l’emplacement de l’extrémité de la pipette en verre dans la magna cisternale. La tête de la souris a été inclinée de 30o pour faciliter l’injection de magna cisternale. Abréviation : LCSI = imagerie par contraste de chatoiement laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Augmentation du débit sanguin cérébral après nano-injection de vasodilatateurs. (A) Images représentatives montrant les changements du débit sanguin cérébral avant et après l’injection de DHPG. La vitesse du sang est codée par couleur. Le bleu représente la basse vitesse et le rouge représente la grande vitesse. (B) Flux sanguin en temps réel dans la région marquée d’une ligne rouge, qui indique la fenêtre de temps pour l’injection de DHPG. (C) Images représentatives montrant les changements du débit sanguin cérébral avant et après l’injection d’ACh. La vitesse du sang est codée par couleur. Le bleu et le rouge indiquent respectivement les vitesses basses et élevées. (D) Flux sanguin en temps réel dans la région marquée par la ligne rouge, qui indique la fenêtre de temps pour l’injection d’ACh. (E) Images représentatives montrant des changements du débit sanguin cérébral avant et après l’injection d’adénosine. La vitesse du sang est codée par couleur. Le bleu et le rouge indiquent respectivement les vitesses basses et élevées. (F) Flux sanguin en temps réel dans la région marquée par la ligne rouge, qui indique la fenêtre de temps pour l’injection d’adénosine. Abréviations : DHPG = (S)-3,5-Dihydroxyphénylglycine ; ACh = acétylcholine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous présentons une nouvelle méthode pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral (CBF) in vivo en combinant une nano-injection précise de magna cisternale avec l’imagerie par contraste de chatoiement laser (LSCI). Cette approche permet une administration précise du médicament dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) tout en permettant une surveillance en temps réel du CBF, facilitant ainsi l’évaluation de la réactivité vasculaire cérébrale.

Les manipulations pharmacologiques et les techniques d’administration de médicaments sont essentielles pour étudier le CBF et la réactivité vasculaire cérébrale in vivo. Les méthodes traditionnelles d’application de médicaments, telles que l’utilisation de vasodilatateurs ou de constricteurs, nécessitent souvent l’ablation du crâne, ce qui peut endommager les leptoméninges et même le parenchyme cérébral 9,10,18. Ces techniques invasives peuvent perturber le microenvironnement cérébral, notamment en provoquant des lésions vasculaires et des hémorragies, ne reproduisant ainsi pas les conditions physiologiques réelles. En revanche, notre méthode offre quatre avantages non négligeables.

Tout d’abord, notre approche pour l’application de médicaments est non invasive et préserve les conditions physiologiques. Deuxièmement, les méthodes d’injection classiques d’ICM reposent généralement sur des seringues ou des canules, ce qui peut entraîner des fuites de médicaments ou de traces et de LCR en raison de la grande taille des pointes. Ces méthodes traditionnelles nécessitent souvent de grandes quantités de médicament ou de traces - généralement 5 μL ou plus, ce qui peut modifier la pression intracrânienne. En revanche, notre injection ICM guidée par nano-injecteur ne nécessite qu’un petit volume d’aussi peu que 1,5 μL ou moins. De plus, la vitesse d’injection peut être contrôlée avec précision sur une large plage, de 1 nL/s à 100 nL/s. Nous utilisons généralement une vitesse de 5 nL/s (300 nL/min), car ce taux n’affecte pas la pression intracrânienne. Troisièmement, contrairement aux injections de médicament guidées par pipette dans le parenchyme cérébral ou à la perfusion de médicament sur la surface corticale, notre administration de médicament par injection de magna cisternale suit le flux naturel du LCR, imitant étroitement les conditions physiologiques. Enfin, puisque notre méthode préserve l’intégrité du crâne et des méninges, nous pouvons effectuer des mesures sur le même groupe de souris à différents points temporels, ce qui permet des comparaisons longitudinales - ce qui n’est pas réalisable avec d’autres méthodes d’application de médicaments. Pour les études de survie et les comparaisons longitudinales, des techniques d’asepsie strictes doivent être suivies, y compris une bonne préparation de la peau, l’utilisation d’instruments et de matériaux stériles et le respect des directives institutionnelles en matière de soins aux animaux. Une période de récupération de deux semaines doit être prévue pour la cicatrisation des plaies.

La méthode d’anesthésie peut avoir un impact significatif sur le CBF. Par exemple, l’anesthésie à la kétamine-xylazine peut augmenter le CBF de plus de 50 % au-dessus des niveaux de base, tandis que l’isoflurane peut doubler le niveau basal de CBF. Dans nos expériences, nous avons choisi l’uréthane et le chloralose en raison de leurs effets minimes sur le système cardiovasculaire, ce qui aide à maintenir les niveaux physiologiques de CBF, comme couramment utilisé dans le domaine26,27. De plus, nous avons sauté la canulation intraartérielle pour que les mesures répétées des gaz du sang soient non invasives, bien que de telles procédures puissent être combinées avec notre méthode26.

Notre approche intègre deux systèmes : le système d’injection ICM basé sur la nano-injection28 et le système d’imagerie par contraste de chatoiement laser (LSCI)29. Les expérimentateurs doivent être formés dans les deux systèmes pour mener à bien la procédure. Étant donné que le système LSCI occupe tout l’espace au-dessus de la tête de la souris, l’inclinaison du bras de 45o facilite non seulement l’injection ICM, mais assure également la compatibilité entre les deux systèmes. Cette configuration est essentielle au succès de l’expérience.

Pour les débutants utilisant l’injection ICM guidée par nano-injecteur, une pratique approfondie est nécessaire pour maîtriser la coordination de la séparation des muscles avec une pince à épiler dans une main tout en manœuvrant le micromanipulateur pour guider la pipette en verre de l’autre. Une bonne lumière laser et un stéréomicroscope à bras articulé sont essentiels pour une visualisation optimale pendant la procédure.

À l’aide de cette méthode, nous avons évalué comment les vasodilatateurs classiques tels que le DHPG, l’acétylcholine et l’adénosine affectent le CBF. Comme prévu, les trois vasodilatateurs ont augmenté le CBF ; Cependant, ils ont induit des dynamiques différentes. Le DHPG a provoqué une forte augmentation du CBF, suivie d’une lente décomposition, tandis que l’acétylcholine a provoqué une augmentation progressive. En revanche, l’adénosine n’a produit qu’une augmentation transitoire du CBF.

Cette méthode devrait également être applicable aux modèles de rats. Cependant, étant donné que l’épaisseur du crâne du rat est d’environ 0,5 à 1 mm, il devra être aminci pour l’imagerie du contraste de chatoiement laser. De plus, bien que la méthode actuelle puisse être adaptée aux souris éveillées à tête fixe, elle nécessite une formation approfondie pour minimiser les mouvements des animaux pendant les expériences. Nous avons utilisé un nombre limité de souris pour démontrer notre méthode ; Par conséquent, notre étude est statistiquement limitée, et il faut faire preuve de prudence lorsqu’on tire des conclusions générales de nos résultats.

Pour des mesures cohérentes et fiables du CBF, il est important que les expérimentateurs reconnaissent que d’autres paramètres physiologiques, tels que la température corporelle, la pression artérielle et les niveaux de CO2 , jouent un rôle essentiel dans l’évaluation physiologique complète et doivent être soigneusement pris en compte dans les études futures. En résumé, nous présentons une nouvelle méthode in vivo pour étudier la régulation du CBF chez la souris. Cette approche est précise et peu invasive, ce qui la rend bien adaptée à l’étude de la dynamique du CBF induite par les médicaments.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(RS)-3,5-DihydroxyphénylglycineTocrisCat. N° 0342
Chlorure d’acétylcholineSigmaA6625-25G
AdénosineSigmaA9251-25G
Tampon d’alcool isopropylique à 70 % VitrexMedical A/S520213
AmScope SM-8T Series Bras articulé Zoom StéréomicroscopeAmScopeSM-8TZ-144S-10M
Aquasonic Clear Gelde transmission d’ultrasonsAquasonicGelPLI 03-50
Souris Numérique Stereotaxic InstrumentsStoelting51730D
Alcool éthyliqueSigma459836-2L
Fiber-Lite DC950 IlluminateurDolan-Jenner industriesDC950H
Remplacement du verre 1.14 MMWorld Precision Instruments504949
Kimtech Science Precision Wipes Essuie-glacesKimberly Clark Professional5511
Laser Speckle Contrast ImagerMoor instrumentsMOORFLPI-2
Lasik Eye Spear (100 par caisse)  ;hospeqBV40815
MICROFIL FLEXIBLENEEDLE World Precision InstrumentsMF34G-5
Huile minéraleSigmaM5904
Coussin chauffant pour sourisFisher scientific50-195-4000
Nair Lotion Décapante au beurre de cacaoAmazonASIN &rlm ; : &lrm ;
NANOLITER 2020 INJECTORWorld Precision InstrumentsNANOLITER2020
Extracteur de micropipettes P-2000Sutter InstrumentP-2000
Puritan® ; Écouvillons, tête en coton, arbre en bois,Puritan Medical806-WC
Lubrifiant oculaire stérileMedi-Vet11897
UrethaneSigmaU2500
Colle à tissuVetbond World Precision InstrumentsVETBOND&
alpha ;-ChloraloseSigma23120
B000GCW5CS

Références

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