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Article de méthode

Une approche non virale pour générer des lymphocytes T récepteurs antigéniques chimériques transitoires à l’aide de l’ARNm pour l’immunothérapie du cancer

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DOI :

10.3791/67548

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21 février 2025

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1ProMab Biotechnologies

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour générer des cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR) transitoires à l’aide d’ARNm non intégrateurs pour l’immunothérapie du cancer et fournit des méthodes fiables pour évaluer les cellules CAR-T et leur fonction cytotoxique.

Résumé

La thérapie par lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) est devenue un traitement pionnier du cancer, remportant un succès sans précédent dans le traitement de certaines hémopathies malignes telles que les lymphomes et les leucémies. Cependant, à mesure que de plus en plus de patients atteints de cancer reçoivent des thérapies cellulaires CAR-T, des tumeurs malignes primaires secondaires associées au traitement sont de plus en plus signalées, en partie en raison de l’insertion inattendue d’un transgène CAR, ce qui soulève de graves problèmes de sécurité. Pour résoudre ce problème, nous décrivons ici une approche non virale et non intégratrice pour générer des cellules CAR-T transitoires à l’aide de l’ARNm. Nous avons électroporé des lymphocytes T avec de l’ARNm modifié codant pour un CAR spécifique du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2) et généré des cellules CAR-T transitoires ciblées par HER2. Le CAR a été exprimé efficacement à la surface de la cellule T 1 jour après l’électroporation, a augmenté au jour 2 et a considérablement diminué au jour 5. Les cellules CAR-T transitoires ont montré une puissante cytotoxicité contre les cellules cancéreuses de l’ovaire SKOV-3 HER2 positives et ont sécrété des niveaux élevés d’IFN-Υ. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour le développement de cellules CAR-T transitoires à petite échelle sans intégration permanente du transgène CAR-T, décrivant des procédures détaillées pour la préparation de l’ARNm CAR, l’activation et la transfection des cellules T, l’évaluation de l’expression des CAR et l’analyse in vitro de la fonction des cellules CAR-T. Cette méthode convient à la génération transitoire de cellules CAR-T dans les études précliniques et cliniques.

Introduction

Le cancer est une menace de plus en plus importante pour la santé humaine, avec une estimation annuelle de 23,6 millions de nouveaux cas diagnostiqués et de 10 millions de décès dans le monde1. Le traitement chirurgical combiné à la radiothérapie et à la chimiothérapie reste la référence en matière de soins pour divers types de cancers non invasifs et invasifs localisés 2,3,4. Bien que le traitement systématique traditionnel ait obtenu un énorme succès dans la prise en charge des cancers à un stade précoce, il est très toxique et a un effet limité sur les cancers métastatiques et hématologiques5. Les patients atteints de ces cancers subissent des traitements fréquents et subissent une toxicité importante dans l’espoir de stabiliser et de retarder la progression de la maladie. La thérapie par lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) est récemment apparue comme une thérapie ciblée révolutionnaire qui démontre une efficacité puissante pour les cancers hématologiques à cellules B et offre de l’espoir à ces patients désespérés6.

Les cellules CAR-T sont des lymphocytes T modifiés exprimant un CAR à la surface de la cellule qui reconnaît spécifiquement les antigènes associés aux tumeurs (TAA) et active les cellules sans nécessiter de présentation antigénique des protéines du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)7. Lors de l’activation, les cellules CAR-T sécrètent un panel de cytokines et lysent les cellules tumorales indépendamment des CMH, améliorant ainsi la destruction des tumeurs même lorsque les CMH sont régulés à la baisse ou perdus en raison du microenvironnement tumoral immunosuppresseur 8,9. Les CAR se composent d’au moins trois domaines distincts : une variante extracellulaire de fragment de chaîne unique (scFv) contenant les régions variables reconnaissant l’antigène d’un anticorps spécifique de la TAA, un domaine transmembranaire qui ancre le CAR à la surface de la cellule et un domaine intracellulaire qui médie le recrutement des protéines adaptatrices et la signalisation en aval10. Sur la base des variations dans les domaines intracellulaires, les structures CAR ont évolué sur cinq générations jusqu’à présent, la première génération ne contenant que le domaine d’activation CD3ζ et les générations suivantes possédant un ou plusieurs domaines de costimulation supplémentaires provenant de molécules telles que 4-1BB et CD2811. Ces domaines intracellulaires affectent les mécanismes de signalisation des cellules CAR-T, la prolifération, la survie et la toxicité, qui déterminent ensemble l’efficacité antitumorale clinique. Le succès clinique de la thérapie cellulaire CAR-T provient des cellules CAR-T de deuxième génération qui ciblent spécifiquement CD19, un biomarqueur fortement exprimé sur les cellules de la lignée B, pour traiter les leucémies et les lymphomes à cellules B12,13. À ce jour, la Food and Drug Administration (FDA) a approuvé six thérapies cellulaires CAR-T de deuxième génération ciblant soit le CD-19, soit l’antigène de maturation des cellules B (BCMA) pour les hémopathies malignes en rechute ou réfractaires, y compris le lymphome à grandes cellules B, le lymphome à cellules du manteau et le myélome multiple 6. Les nouvelles générations de cellules CAR-T font actuellement l’objet d’études précliniques et cliniques intensives14,15.

La production clinique de cellules CAR-T est un processus complexe, coûteux et chronophage. À l’heure actuelle, les leucocytes utilisés pour la préparation des cellules CAR-T proviennent des patients eux-mêmes afin d’éviter les réactions allogéniques, bien que les cellules CAR-T universelles (ou prêtes à l’emploi) dérivées de donneurs soient en cours de développement actif et d’évaluation clinique16. Après l’isolement des leucocytes du sang périphérique du patient par leucaphérèse, un fragment de gène étranger codant pour le CAR est introduit dans les lymphocytes T activés en utilisant des approches virales ou non virales 17,18,19. Les rétrovirus et les lentivirus sont les vecteurs viraux les plus courants pour l’administration du gène CAR, ce qui entraîne une intégration aléatoire et permanente de l’ADN codant pour le CAR dans le génome des lymphocytes T20. Les approches non virales, y compris les nanoparticules d’ARNm-lipides, les systèmes de transposons et l’édition du génome CRISPR/Cas9, sont moins courantes21. Par la suite, les lymphocytes T exprimant des cellules CAR-T sont expansés ex vivo à grande échelle, puis collectés et réinjectés chez les patients22,23. La fabrication de vecteurs viraux qui répondent aux normes strictes des bonnes pratiques de fabrication (BPF) est très difficile, complexe et coûteuse, ce qui impose un fardeau important aux fabricants, aux organismes de réglementation et aux patients, limitant ainsi son application clinique à grande échelle.

Malgré le succès passionnant de la thérapie CAR-T, sa sécurité suscite des inquiétudes croissantes. Étant donné la nature aléatoire de l’intégration du transgène CAR dans le génome des lymphocytes T lors de la transduction virale ou des transposons, une perturbation des gènes suppresseurs de tumeurs ou l’activation des oncogènes peut se produire, conduisant à une transformation maligne des lymphocytes T24,25. Depuis l’approbation par la FDA du premier produit de thérapie cellulaire CAR-T en 2017, des études de suivi montrent que jusqu’à 15 % des patients qui reçoivent le traitement développent des tumeurs malignes primaires secondaires (SPM) telles que le lymphome à cellules T (TCL), le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) et le cancer de la peau 26,27,28,29. Il est frappant de constater que les transgènes CAR ont été fortement détectés dans certains SPM 30,31, et que certains cas de TCL ont été directement causés par une expansion anormale des cellules CAR-T 24,32,33, indiquant un rôle direct des produits CAR-T dans l’induction de certains SPM. D’autres études ont en outre identifié des insertions de transgènes CAR dans des gènes critiques tels que TET234, JAK135 et PBX236 dans les cellules tumorales SPM. À la lumière de l’accumulation de preuves de tumeurs malignes à cellules T après une thérapie cellulaire CAR-T, la FDA a récemment conclu qu’une mise en garde encadrée mettant en évidence un risque grave de malignité à cellules T est nécessaire pour toutes les thérapies cellulaires CAR-T ciblant CD19 et BCMA37. Cependant, des études de cohorte à grande échelle suivant les effets à long terme du traitement CAR-T rapportent une incidence de SPM allant de 3,8 % à 15 % chez les patients traités 26,27,28,38,39. L’incidence n’est pas significativement plus élevée que celle observée chez les patients atteints d’un cancer du sang recevant un traitement systématique traditionnel40,41, ce qui suggère un profil relativement sûr pour la thérapie cellulaire CAR-T. Néanmoins, il est urgent de développer des cellules CAR-T sûres et efficaces qui minimisent le risque de MPS grâce à des approches plus rentables.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une approche non virale et non intégratrice pour générer des cellules CAR-T. L’objectif est de fournir un guide simple, étape par étape, pour générer des cellules CAR-T efficaces à petite échelle avec une expression transitoire de CAR, évitant ainsi la mutagenèse insertionnelle et minimisant le risque de SPM. Nous montrons que l’électroporation de lymphocytes T avec un ARNm modifié codant pour un CAR spécifique du TAA HER2 a entraîné une expression robuste et transitoire du CAR anti-HER2 à la surface des lymphocytes T. Lors de l’expression du CAR, les lymphocytes T ont puissamment tué les cellules tumorales HER2-positives et sécrété un niveau élevé d’IFN-Υ. Le protocole est décrit en quatre sections distinctes mais continues qui comprennent la préparation de l’ARNm CAR, l’activation et l’électroporation des cellules T, l’évaluation de l’expression des CAR et l’analyse de la fonction des cellules CAR-T. Cette approche convient au développement et à la production de cellules CAR-T transitoires pour la recherche universitaire et les thérapies cellulaires cliniques.

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Protocole

Les PBMC utilisés ici ont déjà été isolés à partir de sang total du Stanford Hospital Blood Center selon le protocole approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) (13942) en utilisant le gradient de densité de Ficoll-Paque décrit ci-dessus42. Le consentement éclairé des participants n’était pas applicable, car le sang que nous avons utilisé pour collecter les PBMC a été obtenu commercialement auprès du centre de transfusion sanguine de l’hôpital de Stanford.

1. Préparation de l’ARNm des CAR

  1. Préparation du modèle
    REMARQUE : Un plasmide linéarisé ou un fragment de PCR peut servir de matrice pour synthétiser l’ARNm CAR in vitro, à condition qu’ils contiennent un promoteur 5' SP6 ou T7 approprié, une région non traduite 5' (UTR), un transgène CAR et un 3'UTR avec une queue poly(A) appropriée. Dans cette étude, nous avons utilisé une construction d’ADN plasmidique CAR contenant un promoteur SP6, une bêta-globine humaine courte 5'UTR, un transgène CAR et un 3'UTR composé de deux bêta-globine 3'UTR en tandem suivis d’une queue poly(A)43 de 112 pb. Les UTR, la séquence codante et la queue poly(A) affectent tous la stabilité de l’ARN et l’efficacité de traduction 43,44,45. Il a été démontré qu’une queue poly(A) de 120 pb augmente le rendement en protéines en culture cellulaire par rapport aux queues poly(A) plus courtes43.
    1. Préparez l’ADN plasmidique CAR build à l’aide d’une trousse de préparation de plasmide conformément aux instructions du fabricant. Un ADN plasmidique de haute qualité est essentiel pour générer un rendement élevé d’ARNm CAR.
    2. Linéariser l’ADN plasmidique CAR avec l’enzyme de restriction BglII. Choisissez une enzyme de restriction qui coupe après la queue poly(A), de préférence près de l’extrémité de la queue poly(A). Digérer 10 μg (ou 10 000 ng) du plasmide quantifié par un spectrophotomètre dans un mélange réactionnel de 100 μL contenant 10 μL de l’enzyme, 10 μL de tampon de digestion et de l’eau exempte de nucléases pendant une nuit à 37 °C.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’enzyme de restriction ne coupe pas dans le transgène CAR et ses séquences latérales de promoteur, UTR et de queue poly(A). La linéarisation complète du plasmide CAR est nécessaire pour une transcription efficace de l’ARNm CAR.
    3. Ajouter 200 μg/mL de protéase K et 0,5 % p/v SDS dans le mélange de digestion et incuber à 50 °C pendant 1 h.
    4. Purifier l’ADN plasmidique CAR linéarisé. Ajouter un volume égal de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24:1, v/v) à la réaction de digestion. Agiter vigoureusement pendant environ 15 s. Faites tourner l’échantillon dans une centrifugeuse de paillasse à vitesse maximale pendant 5 min à température ambiante (RT).
    5. Transférez la couche aqueuse supérieure, qui contient l’ADN, dans un nouveau tube de microcentrifugation. Évitez le transfert des couches intermédiaire et inférieure, qui contiennent des impuretés de protéines et de phénols. Effectuez un deuxième cycle d’extraction au chloroforme pour réduire les impuretés.
    6. Ajouter 1/10ede volume d’acétate d’ammonium 7,5 M ou d’acétate de sodium 3 M et mélanger délicatement. Ajoutez 2,5 volumes d’éthanol pour précipiter l’ADN. Conserver l’échantillon à −20 °C pendant au moins 30 min.
    7. Faites tourner l’échantillon à vitesse maximale pendant 15 min à 4 °C pour granuler l’ADN. Retirez le surnageant avec précaution. Ajoutez 500 μL d’éthanol à 70 % pour laver la pastille d’ADN.
    8. Faites tourner à nouveau l’échantillon pendant 2 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant. Laissez une petite quantité de solution dans le tube.
    9. Répétez l’essorage pendant 2 min à 4°C. Retirez délicatement le surnageant restant. Faites sécher à l’air libre la pastille d’ADN à RT pendant environ 10 minutes dans une hotte stérile jusqu’à ce qu’aucune solution d’éthanol ne soit visible au fond du tube.
      REMARQUE : Évitez de trop sécher la pastille d’ADN, car elle pourrait être difficile à dissoudre.
    10. Ajoutez 20 μL d’eau sans nucléase et faites doucement une pipette de haut en bas pour dissoudre l’ADN. Centrifugez brièvement l’échantillon à la vitesse maximale. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
    11. Conservez l’échantillon sur de la glace pour une utilisation immédiate ou à une température de −20 °C pour une utilisation future. Chargez 100 ng de l’ADN purifié sur un gel d’agarose et vérifiez la taille et l’intégrité. L’ADN doit apparaître sous la forme d’une seule bande distincte de la taille attendue. Il ne faut pas observer de bandes supplémentaires ou tachées.
      REMARQUE : La qualité de l’ADN matrice est essentielle pour une transcription efficace de l’ARNm. Évitez d’utiliser de l’ADN impur, fragmenté et dégradé comme matrice pour la transcription de l’ARNm.
  2. Transcription in vitro (IVT)
    1. Synthétiser l’ARNm CAR in vitro. Assurez-vous d’utiliser des réactifs, des tubes et des pointes de pipette sans nucléases tout au long des procédures.
    2. Décongeler les réactifs énumérés dans le tableau 1 à RT, à l’exception du mélange d’ARN polymérase SP6, qui doit être conservé à −20 °C jusqu’à utilisation. Préparez la réaction de transcription dans l’ordre indiqué dans le tableau 1 à RT. Mélangez doucement et incubez à 37 °C pendant au moins 2 h.
      REMARQUE : La réaction peut être augmentée ou réduite en fonction de la quantité d’ARNm nécessaire. La réaction illustrée ci-dessus produit généralement au moins 100 μg (ou 100 000 ng) d’ARNm coiffé lors de l’utilisation d’ADN matrice de haute qualité. Une incubation plus longue, c’est-à-dire pendant la nuit, peut augmenter le rendement de l’ARNm.
    3. Ajoutez 2 μL de DNase I sans RNase à la réaction, mélangez doucement et incubez pendant 15 min à 37 °C pour dégrader l’ADN matrice.
    4. Purifiez l’ARNm CAR transcrit à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ARN (voir le tableau des matériaux). Suivez les instructions du fabricant du kit pour la purification. Éluer l’ARNm dans l’eau exempte de nucléases.
      REMARQUE : L’ARNm peut également être purifié à l’aide de la méthode d’extraction au phénol-chloroforme illustrée ci-dessus (étape 1.1.4).
    5. Mesurez la concentration d’ARNm à l’aide d’un spectrophotomètre. Chargez au moins 200 ng de l’ARNm sur un gel d’agarose et vérifiez sa taille et son intégrité. L’ARNm doit apparaître comme une bande dominante de la taille attendue, sans bandes supplémentaires ou tachées. Conservez l’ARNm à −80 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé.

2. Activation et électroporation des lymphocytes T

  1. Mettre en suspension 1 x 106 cellules mononucléées de sang périphérique humain (PBMC) cryopréservées dans 1 mL de milieu CAR-T (milieu AIM-V complété par 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS), de la pénicilline/streptomycine et 10 ng/ml d’IL-2 humaine recombinante). Activez les lymphocytes T avec un nombre égal de billes Human T-Activator CD3/CD28 prélavées (voir le tableau des matériaux). Cultivez et dilatez les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 pendant plusieurs jours.
    REMARQUE : La quantité de PBMC peut être augmentée ou réduite en fonction de la quantité de lymphocytes T nécessaires pour les expériences ultérieures.
  2. Décongélation de l’ARNm de CAR préparé sur de la glace. Ajouter 1 mL de milieu CAR-T par puits à deux puits d’une plaque de 12 puits et équilibrer le milieu en plaçant la plaque dans l’incubateur à 37 °C.
  3. Transférez 5 x 106 cellules T dans un tube stérile et retirez les billes en plaçant le tube sur un support magnétique et en pipetant soigneusement la suspension cellulaire vers un nouveau tube.
  4. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de PBS stérile.
  5. Centrifugez à nouveau le tube. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 200 μL de tampon néon T (voir le tableau des matériaux).
  6. Pipetez 100 μL de cellules dans un nouveau tube et ajoutez 5 μg (ou 5 000 ng) d’ARNm CAR dans les cellules46. Compléter le tampon néon T jusqu’à un total de 125 μL et mélanger par pipetage de haut en bas.
    REMARQUE : La quantité d’ARNm de CAR à transfecter par électroporation peut être augmentée jusqu’à 8 μg (ou 8 000 ng) par 1 x 106 cellules T sans affecter négativement la viabilité cellulaire, et une quantité plus élevée d’ARNm peut entraîner une augmentation de l’expression de CAR46.
  7. Ajoutez 25 μL de tampon néon T aux cellules de 100 μL restantes. Cela sert de contrôle négatif.
  8. Électroporez les lymphocytes T. À l’aide de la pipette néon, aspirez le mélange de lymphocytes T/ARNm CAR ou les lymphocytes T de contrôle négatif dans une pointe Neon de 100 μL et électroporatez les cellules avec une impulsion de 10 ms de 1800 V.
  9. Transférez immédiatement les cellules dans le milieu de culture équilibré dans la plaque à 12 puits (préparée à l’étape 2.2) après l’électroporation.
  10. Remettez la plaque dans l’incubateur et élargissez les cellules jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Pour assurer une croissance saine et rapide des cellules CAR-T, maintenez la densité cellulaire entre 1−3 x 106 cellules/ml avec un milieu frais jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

3. Évaluation de l’expression du CAR

  1. Mélangez les cellules CAR-T en pipetant doucement de haut en bas plusieurs fois dans chaque puits, et transférez au moins 1 x 10 cellules5 dans un tube FACS de 5 ml.
  2. Ajouter 3 ml de tampon de lavage à froid (PBS contenant 2 mM d’EDTA et 0,5 % p/v BSA) dans le tube. Centrifuger le tube à 500 x g pendant 5 min à RT. Retirer le surnageant avec précaution.
  3. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 100 μL de tampon de lavage. Ajouter 2 μL d’anticorps anti-IgG F(ab')2 humain de chèvre, un réactif de détection CAR (APC), un anticorps anti-IgG F(ab')2 humain (voir le tableau des matériaux) et 2 μL d’un colorant de viabilité 7-AAD dans les cellules en suspension.
    REMARQUE : Le CAR peut également être détecté à l’aide d’un antigène cible correctement marqué ou d’un anticorps anti-marqueur si le CAR contient un marqueur (c’est-à-dire FLAG). Si un anticorps non marqué est utilisé pour la détection des CAR, l’incubation avec un anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence est nécessaire après l’étape 3.4.
  4. Mélangez l’échantillon en secouant doucement le tube et incubez sur de la glace pendant 30 min. Évitez la lumière pendant l’incubation. Lavez les cellules avec 3 ml de tampon de lavage à froid et centrifugez le tube à 500 x g pendant 5 min à RT.
  5. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon de lavage. Analysez immédiatement les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux. Assurez-vous que l’étiquette fluorescente du réactif de détection et le colorant de viabilité sont correctement compensés à l’aide de commandes positives et négatives appropriées.
  6. Évaluez l’expression de CAR à l’aide de la stratégie de contrôle suivante : Gate sur les cellules à l’aide du tracé FSC-A vs SSC-A ; Porte sur les cellules uniques à l’aide du tracé FSC-A vs FSC-H ; Gate sur les cellules vivantes à l’aide de la coloration 7-AAD.
  7. Calculez le pourcentage de lymphocytes T vivants qui ont été colorés par l’anticorps anti-IgG F(ab')2 humain. Comparez les cellules CAR-T aux cellules T de contrôle négatif, qui devraient avoir une coloration minimale.

4. Analyse de la fonction des cellules CAR-T

  1. Analyse de cytotoxicité
    1. Assurez-vous que les cellules tumorales cibles expriment l’antigène dans une conformation qui peut être reconnue par le CAR. Pour confirmer l’expression de l’antigène, analysez les cellules tumorales par cytométrie en flux en utilisant l’anticorps parent à partir duquel le CAR a été dérivé. Si le CAR ne peut pas reconnaître les cellules tumorales, alors les cellules CAR-T ne parviendront pas à tuer les cellules tumorales.
    2. Préparez les cellules tumorales cibles exprimant l’antigène du CAR à la surface de la cellule. Trypsiniser les cellules tumorales adhérentes avec une solution de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 1 min à 37 °C et préparer une suspension unicellulaire avec un milieu de culture approprié à 1−4 x 105 cellules/mL.
      REMARQUE : Les cellules tumorales doivent être bien adhérentes pour assurer une analyse précise dans les étapes ultérieures. Si les cellules tumorales adhèrent mal, se détachent facilement ou se développent en suspension, enduire les puits de la plaque utilisée à l’étape suivante avec un anticorps approprié, un polymère polycationique ou un matériau biologique tel que la fibronectine ou le collagène pour faciliter la fixation des cellules.
    3. Préparez une plaque E (voir le tableau des matériaux). Concevoir le dispositif expérimental. Ajoutez 50 μL de milieu de culture de cellules tumorales préchauffé dans chaque puits et placez la plaque E dans l’instrument d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA) pour mesurer l’impédance de fond. Mesurez l’impédance à 1 min par mesure (ou balayage) pendant 3 balayages.
      REMARQUE : L’impédance d’arrière-plan est utilisée pour régler l’index de la cellule à zéro. Sans mesure d’impédance de fond, les puits ne peuvent pas être comparés les uns aux autres, ce qui rend les résultats ininterprétables.
    4. Retirez la plaque E de l’instrument RTCA et ajoutez 100 μL de suspension de cellules tumorales dans chaque puits. Par conséquent, chaque puits contient 1−4 x 104 cellules dans un volume total de 150 μL.
      REMARQUE : Le nombre de cellules tumorales à ensemencer dans chaque puits doit être déterminé avant l’expérience. Amorcez la E-Plate avec une plage de numéros de cellules, puis surveillez les index de cellules au cours des prochaines 24 à 48 heures. Le nombre de cellules souhaité maintient une augmentation constante de l’indice cellulaire pendant au moins 24 heures sans plafonner. Un ensemencement cellulaire excessif peut accélérer l’épuisement des nutriments et l’acidification moyenne, entraînant un plafonnement précoce de l’indice cellulaire. De plus, des puits répétés devraient être inclus pour chaque groupe afin de déterminer les mesures aberrantes potentielles.
    5. Équilibrez la plaque E à RT pendant 30 min. Cette étape permet aux cellules tumorales de s’installer et d’adhérer au fond des puits.
      REMARQUE : Cette étape est nécessaire pour une mesure précise de l’indice de cellule. Le fait de sauter cette étape entraîne généralement une variabilité d’un puits à l’autre dans les mesures de l’indice cellulaire et une adhésion inégale des cellules tumorales dans les puits, ce qui entraîne une augmentation du bruit dans le test.
    6. Replacez la E-Plate dans l’instrument RTCA et surveillez les indices des cellules pendant environ 24 h, avec des balayages effectués toutes les 5 à 15 minutes.
    7. Le lendemain, préparez la suspension de cellules CAR-T. Mettez en suspension les cellules CAR-T (les cellules effectrices) à partir de l’étape 2.10 dans le milieu RPMI 1640 plus 10 % de FBS jusqu’à une concentration déterminée par la cellule tumorale (la cellule cible) et le rapport de cellules effectrices/cibles (E :T) souhaité. Par exemple, si la suspension de cellules tumorales était à une densité de 2 x 105 cellules/ml et qu’un rapport E :T de 10:1 est souhaité, alors les cellules CAR-T doivent être suspendues à 2 x 106 cellules/ml. Incluez des contrôles appropriés tels que les cellules tumorales seules (pas de cellules effectrices) et les cellules T de contrôle (cellules T électroporées sans ARNm ou avec l’ARNm de contrôle).
      REMARQUE : Pour des résultats optimaux, utilisez les cellules CAR-T 1 à 2 jours après l’électroporation lorsque l’expression de surface CAR est élevée. Pour explorer le rapport E :T optimal, une plage de rapports E :T (par exemple, 3:1 à 20:1) peut être testée. À moins que la fréquence CAR-T ne soit très faible, c’est-à-dire inférieure à 10 %, un rapport E :T de 10:1 ou 20:1 est généralement suffisant pour obtenir une destruction presque complète des cellules tumorales.
    8. Mettez en pause l’enregistrement de l’index des cellules et retirez la E-Plate de l’instrument RTCA.
    9. Inclinez légèrement la plaque, retirez soigneusement 50 μL de milieu de culture de chaque puits sans toucher les cellules tumorales, et ajoutez 100 μL de cellules CAR-T ou de cellules T témoins dans chaque puits.
    10. Remettez la plaque E dans l’instrument RTCA et reprenez la surveillance de l’indice cellulaire pendant au moins 24 h, avec des balayages effectués toutes les 5 à 15 minutes.
      REMARQUE : La durée de la surveillance de l’indice cellulaire dépend de la rapidité avec laquelle les cellules CAR-T ciblent les cellules tumorales. Une période d’incubation de 24 heures est généralement suffisante pour que les cellules CAR-T exercent un effet cytotoxique maximal.
    11. Arrêtez la surveillance de l’indice cellulaire, retirez la plaque E de l’instrument RTCA et analysez le résultat de cytotoxicité. Calculez la cytotoxicité comme le pourcentage de cellules tumorales qui ont été tuées par les cellules CAR-T. Calculez la cytotoxicité moyenne des cellules CAR-T et contrôlez les cellules T à l’aide du logiciel RTCA. Pour calculer la cytotoxicité manuellement, utilisez la formule
      cytotoxicité = ((indice cellulaire des cellules tumorales) − (indice cellulaire des cellules tumorales plus cellules effectrices)) / (indice cellulaire des cellules tumorales) × 100 %.
  2. Analyse de la sécrétion de cytokines
    1. Pour analyser les cytokines telles que l’IFN-Υ sécrétées par les cellules CAR-T lors de l’analyse de cytotoxicité, transférez le surnageant de la plaque E sur une plaque à 96 puits à fond rond ou en forme de V.
      REMARQUE : Si une analyse temporelle de la sécrétion de cytokines est souhaitée, interrompre la surveillance de l’indice cellulaire à l’étape 4.1.10, prélever une petite partie du surnageant de chaque puits, remettre la plaque E dans l’instrument RTCA et reprendre la surveillance.
    2. Centrifugez la plaque à 96 puits à 300 x g pendant 5 min à RT. Transférez soigneusement les surnageants sur une nouvelle plaque à 96 puits sans perturber les pastilles cellulaires.
    3. Mesurez les niveaux de cytokines dans les surnageants à l’aide de kits commerciaux de dosage immuno-enzymatique (ELISA) conformément aux instructions du fabricant. Les surnageants nécessitent généralement une dilution avant la mesure, parfois plus de 100 fois, en fonction des cytokines analysées.
    4. Analysez les données en interpolant les valeurs d’absorbance de l’échantillon par rapport à une courbe standard générée à partir d’étalons dilués en série. Préparez des graphiques avec des barres d’erreur représentant la moyenne ± l’écart-type (ET) à l’aide d’un logiciel approprié. Pour comparer la différence entre les traitements, un test t de Student peut être effectué. Une valeur p inférieure à 0,05 est généralement considérée comme statistiquement significative.
      REMARQUE : Les points de données qui sont des valeurs aberrantes évidentes, probablement en raison d’erreurs expérimentales, doivent être exclus de l’analyse.

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Résultats

Nous avons construit un CAR de deuxième génération ciblant HER2 contenant un scFv dérivé de l’anticorps monoclonal (mAb) de souris anti-HER2 humanisé 4D547, une région transmembranaire et un domaine de costimulation intracellulaire 4-1BB suivi du domaine d’activation CD3ζ (Figure 1A). La séquence d’ADN codant pour le CAR contenait un promoteur 5' SP6 pour piloter la transcription de l’ARNm du CAR in vitro (Figure 1B). L’ARNm du C...

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Discussion

Dans cette étude, nous décrivons une approche non virale et non intégratrice détaillée pour générer des cellules CAR-T transitoires et fournissons des procédures techniques pour évaluer la fonction des cellules CAR-T. Cette approche évite l’utilisation de vecteurs rétroviraux et lentiviraux conventionnels pour l’administration permanente et aléatoire de transgènes CAR, mais tire plutôt parti de l’électroporation pour introduire efficacement des ARNm CAR modifiés in vitro dans le...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li et Vita Golubovskaya sont des employés de ProMab Biotechnologies. Lijun Wu est employée et actionnaire de ProMab Biotechnologies.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par ProMab Biotechnologies.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Colorant de viabilité 7-AAD  ;Biolegend420404
ACEA Novocyte Cytomètre en fluxAgilentNovoCyte 3000
AIM-V moyenGibco12055083
APC chèvre anti-humain IgG F(ab')2anticorps Jackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Restriction EnzymeNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´ ;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Structure du capuchon d’ARN AnalogiqueNEBS1411S
DMEM, haute teneur en glucoseGibco11965092
Dynabeads Activateur humain CD3/CD28billes Gibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 Kit de synthèse d’ARNNew England BioLabs (NEB)E2070S
Protéine recombinante humaine IL-2Marqueurs
MillenniumInvitrogenAM7150
Monarch Kit de nettoyage de l’ARN (500 &mu ; g)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Instrument de transfection au néonInvitrogenMPK5000
Système de transfection au néon 100-&mu ; L KitInvitrogenMPK10096
Pénicilline-Streptomycine (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MoyenGibco11875135
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénolGibco25300120
Phénol UltraPure Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Instrument d’analyse cellulaire en temps réel (RTCA)AgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmide Midiprep KitZymo ResearchD4201
d’ARN Gibco 15140122

Références

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