Article de méthode

Identification de sites d’intégration de lentivirus fonctionnellement pertinents dans une banque de cellules de mutagenèse insertionnelle

DOI :

10.3791/67552

⸱

10 janvier 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mutagenèse insertionnelle est un outil essentiel en génétique avancée pour identifier les éléments génomiques fonctionnels. Ici, nous décrivons l’InSET, une méthode de détection des sites d’intégration des lentivirus au sein d’une bibliothèque de cellules de mutagenèse insertionnelle basée sur les lentivirus.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étendue des séquences fonctionnelles dans le génome humain est un sujet central mais débattu en biologie. Bien que les criblages génétiques inverses à haut débit aient fait des progrès dans l’exploration de ce domaine, ils limitent souvent leur portée à des éléments génomiques connus et peuvent introduire des effets non spécifiques. Cela souligne le besoin urgent de nouveaux outils de génomique fonctionnelle qui permettent une compréhension plus profonde et impartiale de la fonctionnalité du génome. Ce protocole introduit l’InSET, une méthode permettant d’identifier les sites d’intégration des lentivirus au sein d’une bibliothèque de cellules de mutagenèse insertionnelle basée sur les lentivirus. InSET facilite la capture des sites d’intégration lentivirale à l’échelle du génome, avec le séquençage de nouvelle génération utilisé pour détecter et quantifier les séquences flanquantes. La conception d’InSET permet d’analyser les variations d’abondance des sites d’intégration dans les cribles phénotypiques à grande échelle, ce qui en fait un outil robuste pour la génétique avancée et l’identification d’éléments génomiques fonctionnels. L’un des principaux avantages d’InSET est sa capacité à révéler des éléments génomiques jusqu’alors non identifiés, y compris de nouveaux exons fonctionnels d’ARN codants et non codants pour des protéines, indépendamment de l’annotation préalable. Dans l’ensemble, InSET présente une valeur significative dans l’étude de la complexité complexe du génome humain et du transcriptome, où de nombreux éléments génomiques attendent une caractérisation fonctionnelle.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La génomique fonctionnelle reste un domaine crucial et difficile, même à l’ère post-génomique, avec une partie importante des régions génomiques encore sans caractérisation fonctionnelle. L’une des principales raisons de ces défis réside dans la nature complexe du génome humain et du transcriptome, qui sont caractérisés par une transcription omniprésente et un épissage alternatif universel dans les régions codantes et non codantes des protéines1,2,3,4,5. Cette complexité a été largement mise en évidence par des études d’enrichissement ciblées en ARN 6,7,8,9. Il est de plus en plus reconnu que de nombreux nouveaux éléments génomiques restent non cartographiés et fonctionnellement non annotés10,11,12en plus des segments bien annotés du génome humain.

Ces dernières années, des progrès ont été observés dans les outils de génétique inverse, tels que l’interférence ARN (ARNi) et les systèmes CRISPR/Cas13,14,15,16,17,18,19,20,21. Cependant, ces méthodes présentent des inconvénients notables, notamment des effets non spécifiques et des coûts élevés associés à la génération de banques complexes d’ARN en épingle à cheveux courts (shRNAs) ou d’ARN guides simples (sgRNAs)22,23,24,25. De plus, ces méthodes se concentrent principalement sur des éléments génomiques annotés. En revanche, la génétique directe a l’avantage d’identifier de nouveaux éléments génomiques fonctionnels non annotés. Compte tenu de la complexité du génome humain et du transcriptome, ainsi que du grand nombre de nouveaux éléments génomiques, cette capacité de génétique avancée est d’une importance significative.

Les banques de cellules de génétique directe sont fréquemment générées par intégration rétrovirale aléatoire, ce qui rend la détection efficace des sites d’intégration à l’échelle du génome cruciale pour un test de génétique directe. La détection de ces sites d’intégration implique généralement des outils de marche génomique 26. Bien que ces outils aient connu des progrès significatifs, peu d’entre eux sont optimisés pour les applications de séquençage de nouvelle génération (NGS) et ensuite appliqués dans des études de mutagénèse insertionnelle. La mutagenèse insertionnelle dans les lignées cellulaires utilise souvent des méthodes telles que la PCR inverse (I-PCR) ou la PCR médiée par amplification linéaire (LAM-PCR) pour détecter les sites d’intégration 27,28,29. Cependant, ces méthodes nécessitent généralement des étapes de digestion enzymatique de restriction ou de ligature, ce qui peut réduire l’efficacité et introduire des biais dans les résultats.

Pour améliorer la détection efficace des sites d’intégration à l’échelle du génome dans les cribles génétiques avancés, une méthode appelée Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET) a été introduite ici. En intégrant le génominage avec le NGS, InSET permet l’identification à haut débit des sites d’intégration des lentivirus dans les banques de mutagenèse insertionnelle basées sur les lentivirus. Par rapport aux méthodes existantes27,28,29, InSET est relativement simple et direct, éliminant les étapes de digestion ou de ligature des enzymes de restriction, ce qui le rend plus pratique et accessible. De plus, bien que le dépistage génétique avancé existant dans les cellules de mammifères soit limité à un très petit nombre de lignées cellulaires haploïdes ou quasi-haploïdes27,28,29,30,31, il a été prouvé qu’InSET fonctionne dans les lignées cellulaires aneuploïdes32.

Cette étude fournit un protocole détaillé, étape par étape, pour la mise en œuvre de la méthode InSET. De plus, il démontre l’application d’InSET dans les études de mutagénèse insertionnelle. InSET est un outil puissant pour identifier de nouveaux exons au sein d’éléments génomiques, englobant à la fois les ARN codants et non codants dans les lignées cellulaires humaines.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figure 1 fournit une vue d’ensemble schématique de la méthode InSET. Pour une couverture optimale, préparez cinq banques parallèles à partir de 1 μg d’ADN génomique, puis regroupez-les pour le séquençage de nouvelle génération. Cette procédure a été menée à bien de manière continue lors de tests précédents, bien que les utilisateurs puissent introduire des points de pause à leur guise. Des informations détaillées sur les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude se trouvent dans la table des matériaux.

1. Capture des sites d’intégration des lentivirus dans le génome

  1. Utilisez l’ADN génomique isolé de la banque de cellules de mutagenèse insertionnelle basée sur des lentivirus (1 μg), comme décrit dans une étude précédente32, comme modèle pour une PCR linéaire dans une réaction de 50 μL contenant 1x tampon Taq, 2,5 U d’ADN polymérase Taq, 4 μL de mélange dNTP (2,5 mM chacun) et 0,3 μM d’amorce biotinylée 3-LTR_prime (Tableau 1) dans un tube PCR.
    REMARQUE : L’amorce à 3 LTR_prime recuits dans la région LTR de la séquence du lentivirus. S'il recuit au LTR de 5', le fragment amplifié comprend la séquence génomique flanquante. S'il recuit au LTR 3', le fragment amplifié contient une séquence interne de lentivirus, qui ne peut pas être alignée sur le génome de l'hôte et sera donc filtrée lors de l'analyse des données de séquençage en aval. Cette amorce peut également être modifiée pour s’adapter à d’autres types de vecteurs utilisés pour générer une bibliothèque de cellules de mutagénèse insertionnelle.
  2. Effectuez 50 cycles de PCR linéaire dans un thermocycleur PCR standard, en ajoutant 2,5 U d’ADN polymérase Taq au début et à nouveau immédiatement après 25 cycles. Les conditions de PCR sont les suivantes : 94 °C pendant 5 min ; 50 cycles de 94 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; 72 °C pendant 5 min
    REMARQUE : Pour maintenir l’activité de l’ADN polymérase Taq pendant les réactions prolongées, il est recommandé d’ajouter l’enzyme au début et au milieu de la réaction.
  3. Transférez les produits PCR dans un tube à centrifuger neuf et propre de 1,5 ml.
  4. Mélangez soigneusement les produits PCR avec 10 μL de billes magnétiques de biotine-streptavidine.
  5. Incuber le mélange pendant 2 heures à température ambiante en l’agitant à 400 tr/min dans un bain métallique.
    REMARQUE : Sortez le tube pour bien mélanger avec la pipette toutes les 15 min.
  6. Utilisez un support magnétique pour recueillir les billes, puis retirez soigneusement le surnageant.
  7. Laver les billes avec 300 μL de tampon de liaison/lavage (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d’EDTA, 1 M de NaCl, 0,1 % Tween-20) 6 fois et jeter le surnageant.
  8. Laver deux fois avec de l’eau distillée sans DNase/RNase (300 μL) et jeter le surnageant.
  9. Pour la synthèse du deuxième brin, remettre les billes en suspension dans un volume de réaction de 24 μL contenant 1x tampon de fragments de Klenow, 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM chacun) et 6,25 μM d’amorce P5_N6 (Tableau 1) dans un tube PCR.
    REMARQUE : Préparez une solution mère de 100 μM de P5_N6 amorce. L'amorce P5_N6 est composée d'une séquence d'adaptateur P5 fixe à l'extrémité 5' et d'une séquence d'hexamère aléatoire à l'extrémité 3'. L’hexamère aléatoire peut se lier à une gamme variée de séquences cibles, ce qui le rend adapté à l’amplification de divers fragments d’ADN générés par PCR linéaire.
  10. Pré-incuber le mélange à 15 °C pendant 20 min dans un thermocycleur PCR.
  11. Ajouter 2 U de fragment de Klenow (gros fragment d’ADN polymérase d’E. coli).
  12. Incuber les mélanges dans un thermocycleur PCR dans les conditions suivantes : montée lente à 0,5 °C/min de 15 °C à 25 °C suivie d’une incubation de 30 min, puis montée lentement à 0,5 °C/min à 37 °C suivie d’une incubation de 1 h.
  13. Transférez les produits PCR dans un tube à centrifuger neuf et propre de 1,5 ml.
  14. Utilisez un support magnétique pour capturer les billes, puis jetez le surnageant.
  15. Lavez délicatement les billes avec 300 μL d’eau distillée sans DNase/RNase à 4 °C. Récupérez les perles et jetez le surnageant.

2. Construction de la bibliothèque NGS avec PCR imbriquée

  1. Remettre en suspension les billes de l’étape 1.15 dans un volume de réaction PCR de 25 μL contenant 1 tampon Taq, 1,25 U d’ADN polymérase Taq, 0,5 μM d’amorce P5 (Tableau 1), 2 μL de mélange dNTP (2,5 mM chacun) et 0,5 μM d’amorce 3-LTR_Nest (Tableau 1) dans un tube PCR.
  2. Effectuez des réactions de PCR dans un thermocycleur PCR dans les conditions suivantes : 94 °C pendant 3 min ; 20 cycles de 94 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; 72 °C pendant 7 min.
  3. Utilisez 5 μL des produits de PCR de l’étape 2.2 comme modèle pour la prochaine série de PCR dans un volume de 50 μL contenant 1 tampon Taq, 2,5 μL d’ADN polymérase Taq, 4 μL de mélange dNTP (2,5 mM chacun), 0,4 μM de Illumina_P5 d’amorce (tableau 1) et 0,4 μM d’amorce Illumina_P7-3LTR (tableau 1).
  4. Effectuez des réactions de PCR dans un thermocycleur PCR dans les conditions suivantes : 94 °C pendant 3 min ; 15 cycles de 94 °C pendant 30 s, 55 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; 72 °C pendant 7 min.
  5. Transférez les produits de PCR dans un tube à centrifuger propre de 1,5 mL.
    REMARQUE : Le protocole peut être interrompu à cette étape et les échantillons peuvent être stockés à -20 °C.
  6. Purifier les produits PCR à l’aide de 1,2 fois les volumes de billes d’ADN propres, ce qui porte le volume final à 21 μL.
    REMARQUE : Prélever 10 μL de produits PCR dans chacune des 5 banques préparées en parallèle, les regrouper et les purifier jusqu’à un volume final de 21 μL. Le protocole de purification des produits PCR est adapté des instructions du fabricant pour les billes propres d'ADN (voir Tableau des matériaux).
    1. Équilibrez les billes de 2 à 8 °C à température ambiante pendant 30 min.
    2. Mélangez soigneusement les perles en les inversant ou en les vortexant.
    3. Pipetez 1,2 fois les volumes des billes dans un tube à centrifuger propre de 1,5 ml.
    4. Ajoutez les produits PCR dans les billes et mélangez soigneusement en pipetant 10 fois de haut en bas.
    5. Incuber à température ambiante pendant 5 min pour permettre la liaison de l’ADN aux billes.
    6. Placer les échantillons sur un support magnétique et retirer le surnageant une fois que la solution est claire (environ 5 min).
    7. Ajoutez 200 μL d’éthanol à 80 % pour laver les billes, incubez à température ambiante pendant 30 s et retirez le surnageant.
      REMARQUE : L’éthanol à 80 % doit être préparé frais.
    8. Répétez l’étape 2.6.7 une fois.
    9. Faites sécher les perles à l’air libre à température ambiante avec le couvercle ouvert pendant environ 5 min.
    10. Retirez le tube du support magnétique, ajoutez 22 μL d’eau distillée sans DNase/RNase, mélangez soigneusement en pipetant 10 fois de haut en bas et laissez reposer à température ambiante pendant 2 min.
    11. Placez le tube sur le support magnétique jusqu’à ce que la solution soit claire (environ 2 min), puis transférez 21 μL de surnageant dans un tube à centrifuger propre de 1,5 mL.
      REMARQUE : Le protocole peut être interrompu à cette étape et les échantillons peuvent être stockés à -20 °C.
  7. Utilisez 1 μL de produits PCR purifiés pour mesurer la concentration à l’aide du fluorimètre avec le kit de détection de fluorescence dsDNA disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Le protocole de mesure de la concentration suit les instructions du fabricant pour le kit de détection d'ADNdb.
    1. Préparez la préparation de la solution de travail en mélangeant le réactif et le tampon (fournis dans le kit) dans un rapport de 1:200.
    2. Préparez les étalons de dosage en mélangeant 10 μL de l’étalon #1 et 10 μL de l’étalon #2 (fournis dans la trousse), chacun avec 190 μL de solution de travail. Agitez doucement le mélange pendant 2-3 s.
    3. Préparez l’échantillon de test en mélangeant 1 μL des produits PCR purifiés avec 190 μL de solution de travail. Agitez doucement le mélange pendant 2-3 s.
    4. Incuber les étalons et les échantillons de dosage pendant 2 minutes à température ambiante, en les protégeant de la lumière.
    5. Allumez le fluorimètre.
    6. Sélectionnez le programme dsDNA High Sensitivity dans le menu principal.
    7. Pour l’étalonnage, insérez l’étalon #1 dans l’appareil, appuyez sur le bouton Lire l’étalon pour mesurer le premier étalon, puis insérez l’étalon #2 et appuyez sur le bouton Lire l’étalon pour mesurer le deuxième étalon.
    8. Pour la mesure d’échantillons, appuyez sur le bouton Exécuter des échantillons pour accéder à la page de mesure d’échantillons. Insérez chaque tube contenant l’échantillon de test et appuyez sur le bouton Lire le tube pour obtenir la concentration.
      REMARQUE : Le protocole peut être interrompu à cette étape et les échantillons peuvent être stockés à -20 °C.
  8. Effectuez le NGS sur les plates-formes Illumina à l’aide de la stratégie PE150 (appariée) de 150 pb sur une échelle de base de 30 giga.
    REMARQUE : Cette étape est généralement sous-traitée aux sociétés de séquençage.

3. Analyse des données

REMARQUE : L’analyse dans des lignées cellulaires humaines a été utilisée comme exemple dans cette section.

  1. Cartographie des sites d’intégration des lentivirus
    1. Filtrez les lectures de séquençage avec plus de 50 % de bases de mauvaise qualité (score Phred <20), plus de 15 bases 'N' ou moins de 150 bases à l'aide de fastp tool33 (voir Tableau des matériaux).
    2. Sélectionnez uniquement les lectures d’extrémité appariées avec la lecture 2 commençant par la balise LTR "GCCTTGTGTGTGGTAGATCCACAG
      ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      REMARQUE : Cette séquence dépend de la séquence du vecteur utilisé pour générer la bibliothèque de cellules de mutagénèse insertionnelle.
    3. Coupez la séquence de balises LTR à partir des lectures sélectionnées à l’étape 3.1.2.
    4. Alignez les lectures ajustées sur le GRCh37/hg19 à l’aide de BWA-MEM 34 (voir Tableau des matériaux) avec les paramètres par défaut.
    5. Ne conservez que les paires de lecture dans lesquelles les paires de lecture 1 et de lecture 2 sont associées de manière unique au génome avec une configuration et un espacement corrects, indiqués par FLAG 147 et FLAG 163.
    6. Définissez la position d’insertion comme première base alignée de la lecture 2 rognée.
    7. Normalisez le nombre de lectures à chaque site d’insertion unique en fonction du nombre total de lectures alignées de manière unique dans chaque échantillon.
  2. Identification des insertions affectant la fitness cellulaire (IACFs)
    REMARQUE : Dans l’analyse statistique, il est conseillé d’effectuer des comparaisons par paires entre les trois répétitions biologiques des échantillons témoins et traités afin d’identifier les positions significativement enrichies ou appauvries. Le nombre de répétitions mentionné ci-dessus est minime. Il est recommandé d’utiliser autant de répétitions que possible pour garantir la fiabilité et l’exactitude des résultats.
    1. Convertissez le nombre de lectures normalisées de chaque position en valeurs d’enregistrementde 10.
    2. Réglez le log10 valeurs des positions avec zéro lectures comme -5.
    3. Effectuez le test t de Student apparié bilatéral sur les valeurs logarithmiques10.
    4. Ajustez les valeurs p pour des comparaisons multiples à l’aide de la méthode de Benjamini-Hochberg dans l’environnement R.
    5. Sélectionnez des positions avec un seuil de taux de fausses découvertes (FDR) de 25 % en tant qu’IACF.
  3. Identification des clusters affectant la fitness cellulaire (CACFs)
    REMARQUE : Trois répétitions biologiques d’échantillons témoins et d’échantillons traités ont été recommandées pour cette analyse.
    1. Identifiez les grappes d’insertion significativement enrichies ou appauvries entre les échantillons témoins et traités à l’aide de SICER35 (voir le Tableau des matériaux) avec un seuil de FDR de 1 %. La commande pour l’analyse SICER est « sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01 ».
      REMARQUE : La signification des paramètres de la commande ci-dessus est la suivante : ["InputDir"] ["fichier de lit des sites d’insertion d’échantillons traités"] ["fichier de lit des sites d’insertion d’échantillons de contrôle"] ["OutputDir"] ["species"] ["seuil de redondance"] ["taille de la fenêtre (bp)"] ["taille du fragment"] ["fraction effective du génome"] ["taille de l’écart (bp)"] ["valeur E"].
    2. Obtenir des régions de cluster partagées par au moins deux réplicats biologiques avec la fonction « intersect » de la suite BEDTools36 (voir Tableau des matériaux) et désigner ces régions de cluster comme des CACF.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’évaluation du contrôle de la qualité d’une bibliothèque NGS, généralement effectuée par le fournisseur de séquençage, sert de contrôle de qualité standard avant le séquençage. Pour démontrer l’impact de la qualité de la bibliothèque, deux échantillons ont été comparés. La banque de haute qualité, étiquetée s2-20-15, a été préparée à l’aide du protocole PCR imbriqué standard, composé de deux étapes d’amplification séquentielle : la première avec 20 cycles, suivie la seconde avec 15 cycles. En revanche, la bibliothèque d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans l’analyse génétique avancée, la marche du génome est essentielle pour profiler les sites d’intégration dans les banques de cellules de mutagenèse insertionnelle. Les méthodes classiques de marche du génome comme l’I-PCR et la LAM-PCR nécessitent souvent une digestion enzymatique de restriction et une ligature, ce qui peut réduire la complexité de la banque et introduire des biais dus à la dépendance au site enzymatique 27,28,29.<...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000441), la Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (2023J01130), les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales de l’Université Huaqiao (ZQN-924) et les Fonds de recherche scientifique de l’Université Huaqiao (18BS205). P.K. est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32170619), le Fonds de recherche pour les scientifiques internationaux de haut niveau de la National Natural la Fondation des sciences de Chine (32150710525) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (2020J02006).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTAInvitrogenAM9260GPour faire un tampon de liaison/lavage
1 M Tris-HCl (Ph 8.0)Invitrogen15568025Pour faire un tampon de reliure/lavage
10&fois ; Tampon de fragments Klenow  ;Takara2140A
10& fois ; Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659Pour faire Tampon de Liaison/Lavage
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 &mu ; m
BEDToolsSoftware, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEMSoftware, v0.7.12
dNTP MixtureTakara40302,5 mM chacun
Equalbit dsDNA HS Assay KitVazymeEQ111-02
fastpSoftware
HiSeq X TenIlluminaSY-412-1001Plateforme Illumina, externalisée à Novogene Corporation (Pékin)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850Plateforme Illumina, externalisée à Novogene Corporation (Pékin)
Fluorimètre Qubit 3.0ThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq DNA PolyméraseTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328Pour faire Tampon de Liaison/Lavage
Eau distillée UltraPureInvitrogen10977015
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411-01

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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