Article de méthode

Détection d’auto-anticorps anti-MDA5 à l’aide de cellules HeLa et immunocytochimie par microscopie optique

DOI :

10.3791/67575

⸱

31 octobre 2025

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1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous fournissons une méthodologie d’immunocytochimie (ICC) étape par étape pour détecter l’anti-MDA5. Cette approche implique des techniques de fixation cellulaire, de perméabilisation, d’incubation d’anticorps et d’imagerie, qui permettent la détection précise des auto-anticorps anti-MDA5, aidant au diagnostic de la maladie pulmonaire interstitielle à progression rapide chez les patients atteints de myosite.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auto-anticorps anti-MDA5 sont des biomarqueurs essentiels de la dermatomyosite (DM), de la dermatomyosite amyopathique (CADM) et de la polymyosite (PM), en particulier dans l’identification des patients à risque de pneumopathie interstitielle à progression rapide (MPI-RP). La détection précoce de ces auto-anticorps est essentielle pour améliorer les résultats des patients, car un diagnostic tardif conduit souvent à de mauvais pronostics. À l’heure actuelle, le dosage radio-immunologique est la référence pour détecter les anti-MDA5, mais son utilisation est limitée par les coûts élevés, les procédures longues et la nécessité d’une expertise spécialisée. De plus, le test blot, un outil clinique largement utilisé, présente un taux élevé de faux positifs pour les auto-anticorps MDA5, ce qui peut compromettre la précision du diagnostic. Pour remédier à ces limites, nous proposons une méthode de test de confirmation non radioactive, très sensible et standardisée utilisant l’immunocytochimie (ICC). Ce protocole consiste à traiter les cellules HeLa avec une construction MDA5, à perméabiliser les cellules avec Triton X-100 pour faciliter la liaison des auto-anticorps primaires anti-MDA5, et à détecter les anticorps liés à l’aide d’anticorps secondaires conjugués à des enzymes (par exemple, la peroxydase de raifort) avec le chromogène DAB pour l’imagerie microscopique. L’ICC offre une approche pratique, rentable et très sensible pour visualiser les auto-anticorps anti-MDA5 dans les structures cellulaires. En intégrant l’ICC comme procédure de confirmation supplémentaire, cette étude vise à améliorer la fiabilité de la détection anti-MDA5, améliorant ainsi les stratégies diagnostiques et pronostiques de la RP-MPI chez les patients atteints de DM, de CADM et de MP.

Introduction

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Les myopathies inflammatoires idiopathiques (MII), communément appelées myosites, sont un groupe hétérogène de maladies auto-immunes caractérisées par une inflammation musculaire chronique, des manifestations cliniques variables et des résultats thérapeutiques divers. Les symptômes courants comprennent la faiblesse musculaire, la réduction de l’endurance et la myalgie1. Les principaux sous-types de MII comprennent la polymyosite (MP) et la dermatomyosite (DM), tandis que la dermatomyosite cliniquement amyopathique (CADM) se distingue par des éruptions cutanées caractéristiques similaires à celles observées dans le DM, mais avec une atteinte musculaire minime ou nulle. Une complication majeure de la MP, du DM et de la MAO est la pneumopathie interstitielle (MPI), qui touche environ 40 % des patients et est associée à une mortalité accrue2.

L’évolution clinique et le pronostic de la MPI dans la MII varient considérablement. La MPI associée au DM et à la CADM (DM-/CADM-ILD) a tendance à être plus résistante au traitement et engendre un pronostic plus sombre que la MPI associée à la MP. Parmi celles-ci, la PID aiguë ou subaiguë, qui progresse rapidement en trois mois3, est particulièrement sévère, avec un taux de survie à cinq ans de seulement 52 %, contre 87 % pour la PID chronique, qui progresse lentement ou reste stable. La MPI rapidement progressive (RP-ILD), un sous-type de MPI aiguë/subaiguë, se caractérise par une dyspnée d’apparition rapide et des lésions alvéolaires étendues visibles à l’imagerie thoracique. La MPI RP est une maladie potentiellement mortelle de mauvais pronostic, ce qui souligne le besoin urgent d’un diagnostic précoce et d’une intervention rapide pour améliorer les résultats des patients 4,5,6.

Les auto-anticorps spécifiques de la myosite (MSA) sont apparus comme des biomarqueurs essentiels dans la MPI associée à la myosite, les auto-anticorps anti-MDA5 jouant un rôle particulièrement important. Ces auto-anticorps sont fréquemment détectés chez les patients atteints de PM-/DM-/CADM-ILD et servent d’indicateurs pronostiques importants pour la MPI-RP 7,8,9. MDA5 (melanoma differentiation-associated gene 5) est un récepteur de reconnaissance de motifs cytosoliques codé par un gène inductible par l’interféron qui détecte l’ARN double brin viral et mitochondrial, initiant des réponses immunitaires médiées par l’interféron10. Bien que les mécanismes pathogènes précis restent incertains, on pense que les auto-anticorps anti-MDA5 perturbent la fonction de MDA5, contribuant ainsi à la pathogenèse auto-immune.

La détection précoce des auto-anticorps anti-MDA5 est essentielle pour l’identification précoce et la prise en charge de la MPI RP. Traditionnellement, l’immunoprécipitation (IP) radiomarquée à l’aide de 35extraits de cellules K562 marqués à la S-méthionine a été considérée comme l’étalon-or pour la détection des auto-anticorps anti-MDA511. Cependant, cette méthode n’est pas pratique pour une utilisation clinique de routine en raison de son coût élevé, de sa dépendance à l’égard d’équipements spécialisés et de personnel formé, de réglementations strictes en matière d’élimination des déchets radioactifs et de la durée de conservation limitée des réactifs radiomarqués. Dans la pratique clinique, les tests par transfert sont couramment utilisés comme alternatives ; cependant, ils sont associés à un taux élevé de faux positifs pour les auto-anticorps anti-MDA5 12,13, ce qui soulève des inquiétudes quant à la précision du diagnostic. Par conséquent, il est urgent de disposer d’un test de confirmation fiable et non radioactif pour valider les résultats positifs et améliorer la fiabilité du diagnostic.

Pour combler cette lacune, nous proposons l’utilisation de l’immunocytochimie (ICC) comme test de confirmation supplémentaire pour les auto-anticorps anti-MDA5. Cette approche consiste à transfecter des cellules HeLa avec une construction MDA5, à incuber les cellules avec du plasma de patient et à détecter des auto-anticorps anti-MDA5 liés à l’aide d’anticorps secondaires conjugués à des enzymes (par exemple, la peroxydase de raifort) combinés à un substrat chromogène pour la visualisation en microscopie optique. ICC fournit une plate-forme non radioactive, hautement sensible et standardisée pour visualiser les auto-anticorps anti-MDA5 dans les compartiments cellulaires. En intégrant l’ICC au test blot, cette méthode vise à réduire les taux de faux positifs, à améliorer la précision du diagnostic et, en fin de compte, à améliorer la prise en charge clinique et les résultats pour les patients.

L’objectif de cette étude est d’établir un protocole robuste et non radioactif pour la détection des auto-anticorps anti-MDA5, en abordant les limites des méthodes de détection actuelles et en offrant aux cliniciens un outil pratique et fiable pour le diagnostic précoce de la MPI-RP chez les patients atteints de MP, de DM et de CDM. Dans la narration vidéo qui l’accompagne, cette évolution potentiellement mortelle est familièrement décrite comme une « mort rapide » ; scientifiquement, elle correspond à une PID rapidement progressive (RP-ILD). Ce travail s’appuie sur les preuves existantes et a le potentiel d’améliorer considérablement l’évaluation pronostique et la prise de décision thérapeutique dans la pratique clinique.

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Protocole

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1. Culture cellulaire et transfection

  1. Maintenez les cellules HeLa avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotique-antimycosique à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 .
  2. Passez les cellules tous les 2-3 jours ou lorsque les cellules atteignent une confluence de 90 % à 100 %.
  3. Semez 7 × 104 cellules HeLa dans chaque puits d’une plaque de 24 puits (1,9 cm2/puits) 24 h avant la transfection pour permettre aux cellules d’atteindre environ 90 % de confluence.
  4. Diluer 500 ng de plasmide (pENTER-MDA5) et 1,5 μL de réactif de transfection chacun dans 25 μL de milieu sérique réduit.
  5. Ajouter de l’ADN dilué au réactif de transfection dilué (rapport 1:1). Bien mélanger et incuber pendant 5 min.
  6. Ajoutez le mélange aux cellules ensemencées la veille et agitez pour mélanger immédiatement le complexe ADN-lipide. Confirmez que les cellules sont confluentes à 80 % à 90 %.
  7. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 24 h et procéder à la réalisation de l’ICC.
    REMARQUE : Nous avons utilisé un vecteur disponible dans le commerce (pEnter-MDA5) ; Vous trouverez plus d’informations dans la table des matériaux. L’efficacité de la transfection est de ~50 %.
    Le succès de la transfection et de l’expression de la protéine cible peut être déterminé en transfectant les cellules avec un plasmide exprimant une protéine fluorescente et en effectuant un transfert Western pour visualiser l’expression de la protéine cible.

2. Fixation cellulaire

  1. Après l’incubation, lavez les cellules 2 fois avec du PBS pour éliminer tout milieu restant.
    REMARQUE : Le lavage peut être effectué en secouant la plaque sur un agitateur orbital.
  2. Fixer les cellules dans 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS. Laissez les cellules pendant 15 minutes à température ambiante.
    ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique. Utilisez des directives de manipulation appropriées.
  3. Aspirez le réactif fixateur et utilisez du PBS pour laver les cellules 2x.

3. Perméabilisation cellulaire

  1. Ajoutez le réactif Triton X-100 (0,3 % dans du PBS) et laissez reposer les cellules pendant 10 minutes à température ambiante.
  2. Après 10 min, jetez le détergent.
  3. Ajoutez du PBS pour laver les cellules une fois.

4. Blocage cellulaire

  1. Effectuer un blocage avec 10 % de sérum de bovin fœtal dans du PBS (1x) et incuber les cellules pendant 1 h à température ambiante.
  2. Retirez le réactif bloquant, puis ajoutez du PBS pour laver les cellules une fois.

5. Hybridation de l’anticorps du patient

  1. Ajoutez le plasma dilué du patient aux cellules. Assurez-vous de diluer l’échantillon du patient (dilution 1:5 000 dans PBS) dans PBS avant utilisation.
    REMARQUE : Ajustez la dilution pour améliorer le signal ou réduire l’arrière-plan si nécessaire. Pour garantir des résultats impartiaux, le personnel qui effectuait les tests ne savait pas quels échantillons appartenaient aux patients et lesquels provenaient d’individus en bonne santé.
  2. Incuber l’échantillon à 4 °C pendant 12 à 16 h (toute la nuit).
  3. Après la période d’incubation, prélever l’échantillon du patient et laver les cellules 3 fois avec du PBS.

6. Hybridation de l’anticorps secondaire

  1. Traitez les cellules avec des IgG de chèvre diluées conjuguées à la peroxydase de raifort (dilution 1:250 dans le PBS) et laissez les cellules pendant 1 h à température ambiante.
  2. Une heure plus tard, éliminez les anticorps secondaires.
  3. Rincer avec du PBS 3x.

7. Coloration cellulaire

  1. Après avoir lavé les cellules, colorez-les avec 300 μL de solution de travail/puits DAB.
    REMARQUE : Cette solution a été préparée en mélangeant du concentré de chromogène DAB et du diluant DAB selon les instructions du fabricant.
  2. Après avoir coloré les cellules pendant 5 min, retirez le colorant, rincez à l’eau distillée désionisée et agitez pendant 5 min.

8. Contre-coloration cellulaire

  1. Contre-colorez le noyau cellulaire avec de l’hématoxyline diluée.
    REMARQUE : Nous utilisons Hematoxylin Gill II dans une dilution de 10 fois et attendons 5 min pour le processus de coloration.
  2. Après 5 min, jetez l’hématoxyline, puis lavez-la avec de l’eau distillée déminéralisée pendant 2 x 5 min.

9. Constat

  1. Observez les résultats de la coloration à l’aide d’un microscope optique.
    REMARQUE : Un vrai positif montre une forte coloration brune à l’intérieur des cellules HeLa exprimant MDA5 ; cela confirme la présence d’auto-anticorps anti-MDA5 dans l’échantillon du patient. Un résultat négatif montre que les cellules HeLa ne présentent pas de coloration brune, ce qui indique l’absence d’auto-anticorps anti-MDA5. Un résultat faussement positif montre une coloration brune étendue dans toutes les cellules, quelle que soit l’expression de MDA5. Cette coloration non spécifique, observée dans d’autres maladies auto-immunes, doit être distinguée d’un vrai positif pour éviter les erreurs de diagnostic.

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Résultats

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Le personnel qui effectuait les tests ne connaissait pas l’identité des échantillons, y compris les patients spécifiques auprès desquels ils avaient été obtenus, afin de minimiser les biais potentiels dans le processus d’évaluation. Cependant, bien que les échantillons témoins sains n’aient pas été soumis à l’insu, ils ont toujours produit des résultats clairs et sans équivoque.

La figure 1A démontr...

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Discussion

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Notre technique basée sur l’ICC pour identifier les auto-anticorps anti-MDA5 offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes traditionnelles telles que l’analyse par transfert de ligne et le dosage radio-immunologique. Auparavant, Nombel et al. ont rapporté des valeurs de sensibilité et de spécificité de 96 % et 100 %, respectivement, en comparant l’immunofluorescence indirecte (IIF) sur des cellules transfectées de MDA5 avec ELISA dans une cohorte de 23 patients atteints de d...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Des parties de ce manuscrit ont été générées avec l’aide de GPT-4 d’OpenAI. Les auteurs ont révisé et édité le contenu pour en assurer l’exactitude et l’originalité.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil national des sciences et de la technologie de Taïwan accordées à Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 et NSTC 113-2320-B-039-032). Cette étude a également été financée en partie par des subventions de l’Université médicale et de l’hôpital de Chine accordées à Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 et C1110812016-12).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques à 24 puits (1,9 cm et sup2 ;/puits)Corning354541
Antibiotique-antimycotiqueGibco15240062
BéchersPYREX1000-600
Tubes coniques (15 mL)Corning430052
Tubes coniques (50 mL)Corning430290
Eau distillée déioniséeNotre eau distillée déionisée est produite en interne à l’aide d’un système Milli-Q (Colonne 1 : Quantum TEX, SN : F4EB53476 ; Colonne 2 : Prepak, SN : F1CB11442)
Caractérisation du sérum bovin fœtalCytivaSH30396.03
cylindres gradués (50 mL)VITLAB64804
Hématoxyline Gill IILeica3801522
Hyclone Dulbecco » s Eagle Medium modifié avec un taux élevé de glucoseCytivaSH30243.02
Réactif de transfection Lipofectamin 2000Invitrogen11668019Réactif de transfection
MDA-5 (D74E4) Rabbit mAbTechnologie de signalisation cellulaire5321
Tubes microcentrifuges (tubes Eppendorf de 1,5 mL)AXYGÈNE142503
Milieu sérique réduit Opti-MEM IGibco31985070
Vibrateur orbital (optionnel)FIRSTEKS300R
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich4 % dans un PBS 1x
PBSPRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
Peroxydase AffiniPure IgG Anti-Humains (H+L)Jackson ImmunoResearch109-035-003
Contrôleur de pipetteThermo Scientific130165
Pipettes  ;GILSON
Pipettes et pointes de pipette (10 & micro ; L)QSP104-Q
Pipettes et pointes de pipette (200 & micro ; L)QSPT090-Q
Pipettes et pointes de pipette (1000 & micro ; L)QSP111-Q
Pipettes sérologiques (5 mL)SPL91005
Pipettes sérologiques (10 mL)SPL91010
Pipettes sérologiques (25 mL)SPL91025
Kit de substrat DAB SignalStainSignalisation cellulaire80590,3 % dans PBS

Références

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Mots-clés

Essai d immunocytochimieMaladie pulmonaire interstitielleBiomarqueurs de la dermatomyositePerm abilisation au Triton X 100D tection la peroxydase de raifortColoration au chromog ne DABMarquage par anticorps secondaire

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