Détection d’auto-anticorps anti-MDA5 à l’aide de cellules HeLa et immunocytochimie par microscopie optique

Les myopathies inflammatoires idiopathiques (MII), communément appelées myosites, sont un groupe hétérogène de maladies auto-immunes caractérisées par une inflammation musculaire chronique, des manifestations cliniques variables et des résultats thérapeutiques divers. Les symptômes courants comprennent la faiblesse musculaire, la réduction de l’endurance et la myalgie¹. Les principaux sous-types de MII comprennent la polymyosite (MP) et la dermatomyosite (DM), tandis que la dermatomyosite cliniquement amyopathique (CADM) se distingue par des éruptions cutanées caractéristiques similaires à celles observées dans le DM, mais avec une atteinte musculaire minime ou nulle. Une complication majeure de la MP, du DM et de la MAO est la pneumopathie interstitielle (MPI), qui touche environ 40 % des patients et est associée à une mortalité accrue².

L’évolution clinique et le pronostic de la MPI dans la MII varient considérablement. La MPI associée au DM et à la CADM (DM-/CADM-ILD) a tendance à être plus résistante au traitement et engendre un pronostic plus sombre que la MPI associée à la MP. Parmi celles-ci, la PID aiguë ou subaiguë, qui progresse rapidement en trois mois³, est particulièrement sévère, avec un taux de survie à cinq ans de seulement 52 %, contre 87 % pour la PID chronique, qui progresse lentement ou reste stable. La MPI rapidement progressive (RP-ILD), un sous-type de MPI aiguë/subaiguë, se caractérise par une dyspnée d’apparition rapide et des lésions alvéolaires étendues visibles à l’imagerie thoracique. La MPI RP est une maladie potentiellement mortelle de mauvais pronostic, ce qui souligne le besoin urgent d’un diagnostic précoce et d’une intervention rapide pour améliorer les résultats des patients ^4,5,6.

Les auto-anticorps spécifiques de la myosite (MSA) sont apparus comme des biomarqueurs essentiels dans la MPI associée à la myosite, les auto-anticorps anti-MDA5 jouant un rôle particulièrement important. Ces auto-anticorps sont fréquemment détectés chez les patients atteints de PM-/DM-/CADM-ILD et servent d’indicateurs pronostiques importants pour la MPI-RP ^7,8,9. MDA5 (melanoma differentiation-associated gene 5) est un récepteur de reconnaissance de motifs cytosoliques codé par un gène inductible par l’interféron qui détecte l’ARN double brin viral et mitochondrial, initiant des réponses immunitaires médiées par l’interféron¹⁰. Bien que les mécanismes pathogènes précis restent incertains, on pense que les auto-anticorps anti-MDA5 perturbent la fonction de MDA5, contribuant ainsi à la pathogenèse auto-immune.

La détection précoce des auto-anticorps anti-MDA5 est essentielle pour l’identification précoce et la prise en charge de la MPI RP. Traditionnellement, l’immunoprécipitation (IP) radiomarquée à l’aide de ³⁵extraits de cellules K562 marqués à la S-méthionine a été considérée comme l’étalon-or pour la détection des auto-anticorps anti-MDA5¹¹. Cependant, cette méthode n’est pas pratique pour une utilisation clinique de routine en raison de son coût élevé, de sa dépendance à l’égard d’équipements spécialisés et de personnel formé, de réglementations strictes en matière d’élimination des déchets radioactifs et de la durée de conservation limitée des réactifs radiomarqués. Dans la pratique clinique, les tests par transfert sont couramment utilisés comme alternatives ; cependant, ils sont associés à un taux élevé de faux positifs pour les auto-anticorps anti-MDA5 ^12,13, ce qui soulève des inquiétudes quant à la précision du diagnostic. Par conséquent, il est urgent de disposer d’un test de confirmation fiable et non radioactif pour valider les résultats positifs et améliorer la fiabilité du diagnostic.

Pour combler cette lacune, nous proposons l’utilisation de l’immunocytochimie (ICC) comme test de confirmation supplémentaire pour les auto-anticorps anti-MDA5. Cette approche consiste à transfecter des cellules HeLa avec une construction MDA5, à incuber les cellules avec du plasma de patient et à détecter des auto-anticorps anti-MDA5 liés à l’aide d’anticorps secondaires conjugués à des enzymes (par exemple, la peroxydase de raifort) combinés à un substrat chromogène pour la visualisation en microscopie optique. ICC fournit une plate-forme non radioactive, hautement sensible et standardisée pour visualiser les auto-anticorps anti-MDA5 dans les compartiments cellulaires. En intégrant l’ICC au test blot, cette méthode vise à réduire les taux de faux positifs, à améliorer la précision du diagnostic et, en fin de compte, à améliorer la prise en charge clinique et les résultats pour les patients.

L’objectif de cette étude est d’établir un protocole robuste et non radioactif pour la détection des auto-anticorps anti-MDA5, en abordant les limites des méthodes de détection actuelles et en offrant aux cliniciens un outil pratique et fiable pour le diagnostic précoce de la MPI-RP chez les patients atteints de MP, de DM et de CDM. Dans la narration vidéo qui l’accompagne, cette évolution potentiellement mortelle est familièrement décrite comme une « mort rapide » ; scientifiquement, elle correspond à une PID rapidement progressive (RP-ILD). Ce travail s’appuie sur les preuves existantes et a le potentiel d’améliorer considérablement l’évaluation pronostique et la prise de décision thérapeutique dans la pratique clinique.

1. Culture cellulaire et transfection

1. Maintenez les cellules HeLa avec le milieu Eagle modifié de Dulbecco contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotique-antimycosique à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ .
2. Passez les cellules tous les 2-3 jours ou lorsque les cellules atteignent une confluence de 90 % à 100 %.
3. Semez 7 × 10⁴ cellules HeLa dans chaque puits d’une plaque de 24 puits (1,9 cm²/puits) 24 h avant la transfection pour permettre aux cellules d’atteindre environ 90 % de confluence.
4. Diluer 500 ng de plasmide (pENTER-MDA5) et 1,5 μL de réactif de transfection chacun dans 25 μL de milieu sérique réduit.
5. Ajouter de l’ADN dilué au réactif de transfection dilué (rapport 1:1). Bien mélanger et incuber pendant 5 min.
6. Ajoutez le mélange aux cellules ensemencées la veille et agitez pour mélanger immédiatement le complexe ADN-lipide. Confirmez que les cellules sont confluentes à 80 % à 90 %.
7. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ pendant 24 h et procéder à la réalisation de l’ICC.
   REMARQUE : Nous avons utilisé un vecteur disponible dans le commerce (pEnter-MDA5) ; Vous trouverez plus d’informations dans la table des matériaux. L’efficacité de la transfection est de ~50 %.
   Le succès de la transfection et de l’expression de la protéine cible peut être déterminé en transfectant les cellules avec un plasmide exprimant une protéine fluorescente et en effectuant un transfert Western pour visualiser l’expression de la protéine cible.

2. Fixation cellulaire

1. Après l’incubation, lavez les cellules 2 fois avec du PBS pour éliminer tout milieu restant.
   REMARQUE : Le lavage peut être effectué en secouant la plaque sur un agitateur orbital.
2. Fixer les cellules dans 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS. Laissez les cellules pendant 15 minutes à température ambiante.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique. Utilisez des directives de manipulation appropriées.
3. Aspirez le réactif fixateur et utilisez du PBS pour laver les cellules 2x.

3. Perméabilisation cellulaire

1. Ajoutez le réactif Triton X-100 (0,3 % dans du PBS) et laissez reposer les cellules pendant 10 minutes à température ambiante.
2. Après 10 min, jetez le détergent.
3. Ajoutez du PBS pour laver les cellules une fois.

4. Blocage cellulaire

1. Effectuer un blocage avec 10 % de sérum de bovin fœtal dans du PBS (1x) et incuber les cellules pendant 1 h à température ambiante.
2. Retirez le réactif bloquant, puis ajoutez du PBS pour laver les cellules une fois.

5. Hybridation de l’anticorps du patient

1. Ajoutez le plasma dilué du patient aux cellules. Assurez-vous de diluer l’échantillon du patient (dilution 1:5 000 dans PBS) dans PBS avant utilisation.
   REMARQUE : Ajustez la dilution pour améliorer le signal ou réduire l’arrière-plan si nécessaire. Pour garantir des résultats impartiaux, le personnel qui effectuait les tests ne savait pas quels échantillons appartenaient aux patients et lesquels provenaient d’individus en bonne santé.
2. Incuber l’échantillon à 4 °C pendant 12 à 16 h (toute la nuit).
3. Après la période d’incubation, prélever l’échantillon du patient et laver les cellules 3 fois avec du PBS.

6. Hybridation de l’anticorps secondaire

1. Traitez les cellules avec des IgG de chèvre diluées conjuguées à la peroxydase de raifort (dilution 1:250 dans le PBS) et laissez les cellules pendant 1 h à température ambiante.
2. Une heure plus tard, éliminez les anticorps secondaires.
3. Rincer avec du PBS 3x.

7. Coloration cellulaire

1. Après avoir lavé les cellules, colorez-les avec 300 μL de solution de travail/puits DAB.
   REMARQUE : Cette solution a été préparée en mélangeant du concentré de chromogène DAB et du diluant DAB selon les instructions du fabricant.
2. Après avoir coloré les cellules pendant 5 min, retirez le colorant, rincez à l’eau distillée désionisée et agitez pendant 5 min.

8. Contre-coloration cellulaire

1. Contre-colorez le noyau cellulaire avec de l’hématoxyline diluée.
   REMARQUE : Nous utilisons Hematoxylin Gill II dans une dilution de 10 fois et attendons 5 min pour le processus de coloration.
2. Après 5 min, jetez l’hématoxyline, puis lavez-la avec de l’eau distillée déminéralisée pendant 2 x 5 min.

9. Constat

1. Observez les résultats de la coloration à l’aide d’un microscope optique.
   REMARQUE : Un vrai positif montre une forte coloration brune à l’intérieur des cellules HeLa exprimant MDA5 ; cela confirme la présence d’auto-anticorps anti-MDA5 dans l’échantillon du patient. Un résultat négatif montre que les cellules HeLa ne présentent pas de coloration brune, ce qui indique l’absence d’auto-anticorps anti-MDA5. Un résultat faussement positif montre une coloration brune étendue dans toutes les cellules, quelle que soit l’expression de MDA5. Cette coloration non spécifique, observée dans d’autres maladies auto-immunes, doit être distinguée d’un vrai positif pour éviter les erreurs de diagnostic.

Le personnel qui effectuait les tests ne connaissait pas l’identité des échantillons, y compris les patients spécifiques auprès desquels ils avaient été obtenus, afin de minimiser les biais potentiels dans le processus d’évaluation. Cependant, bien que les échantillons témoins sains n’aient pas été soumis à l’insu, ils ont toujours produit des résultats clairs et sans équivoque.

La figure 1A démontre l’expression réussie de MDA5 dans les cellules HeLa transfectées avec la construction pENTER-MDA5. Pour valider l’efficacité de la transfection, l’ICC a été réalisée à l’aide d’un anticorps anti-MDA5 commercial. Une forte coloration cytoplasmique brune a été observée dans environ 50 % des cellules transfectées, indiquant une expression robuste de la protéine MDA5. En revanche, les cellules non transfectées traitées dans des conditions identiques n’ont montré aucune coloration cytoplasmique, confirmant la spécificité de l’anticorps et l’absence d’expression endogène de MDA5.

Selon le protocole ICC, des échantillons représentatifs de patients anti-MDA5-positifs, confirmés par immunoprécipitation radiomarquée, ont montré une coloration cytoplasmique brune claire dans les cellules HeLa exprimant MDA5, tandis que les cellules non transfectées sont restées non colorées (Figure 1B). Ce modèle de coloration indique la présence d’auto-anticorps anti-MDA5 dans le plasma du patient et s’aligne sur la détection de référence établie à l’aide de 35extraits de cellules K562 marqués à la S-méthionine.

Les caractéristiques des patients sont résumées dans le tableau supplémentaireS1, qui décrit les diagnostics cliniques, le statut des anticorps anti-MDA5 et la classification en trois groupes : anti-MDA5 positif, faux positif et contrôle sain. En plus du statut des anticorps, le tableau supplémentaire S1 résume désormais les données démographiques des patients, y compris l’âge, le sexe et le diagnostic sous-jacent pour chaque cohorte. La réactivité des anticorps a été classée semi-quantitativement comme faible (1+), modérée (2+) ou forte (3+) en fonction de l’intensité de la bande, reflétant l’augmentation des niveaux d’anticorps. Cela fournit un contexte clinique pour l’interprétation des résultats de l’ICC, tout en maintenant l’objectif méthodologique principal de la présente étude. La cohorte de l’étude comprenait 10 patients avec des auto-anticorps anti-MDA5 confirmés (groupe positif), cinq patients atteints de maladies auto-immunes qui ont donné des résultats faussement positifs par test par transfert commercial (groupe faussement positif) et 10 individus sains (groupe témoin sain). Chaque échantillon a été testé avec des témoins positifs et négatifs et vérifié indépendamment à l’aide d’une immunoprécipitation radiomarquée. Pour les échantillons dont les résultats de coloration sont clairs et concluants, une seule analyse ICC a été jugée suffisante. Dans les cas où la coloration était ambiguë ou limite, d’autres tests ont été effectués, y compris des dilutions en série et des tests ICC répétés, pour assurer une interprétation précise. Cette approche a permis d’assurer à la fois la rigueur méthodologique et l’efficacité des ressources dans la validation des performances de la méthode de détection basée sur l’ICC.

Les résultats faussement positifs sont illustrés à la figure 2. Dans ces échantillons, du plasma de patients atteints de maladies auto-immunes autres que les myopathies inflammatoires idiopathiques (MII) a été utilisé. Contrairement à la figure 1, une coloration cytoplasmique brune a été observée de manière extensive dans toutes les cellules, quel que soit le statut d’expression de MDA5. Ce modèle de coloration indique une liaison non spécifique et met en évidence le potentiel de faux positifs dans les échantillons de patients atteints d’autres maladies auto-immunes. Les résultats négatifs sont présentés à la figure 3, où le plasma d’individus sains a été testé. Pratiquement aucune coloration cytoplasmique brune n’a été observée dans les cellules HeLa transfectées ou non, indiquant l’absence d’auto-anticorps anti-MDA5 dans ces échantillons.

Figure 1 : Validation de l’expression de MDA5 et détection d’auto-anticorps anti-MDA5 à l’aide d’ICC. (A) Les cellules HeLa transfectées avec un plasmide exprimant MDA5 ont été colorées à l’aide d’un anticorps anti-MDA5 commercial. Une forte coloration cytoplasmique brune a été observée, indiquant une expression robuste de la protéine MDA5. En revanche, les cellules non transfectées traitées dans des conditions identiques n’ont montré aucune coloration, confirmant à la fois la spécificité des anticorps et l’absence d’expression endogène de MDA5. (B) Les cellules HeLa transfectées avec MDA5 ont été incubées avec du plasma de patients confirmés positifs pour anti-MDA5 par immunoprécipitation radiomarquée. Une coloration brune cytoplasmique claire a été observée, démontrant la présence d’auto-anticorps anti-MDA5 dans l’échantillon du patient. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviation : ICC = immunocytochimie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Détection de signaux faussement positifs à l’aide du plasma de patients atteints de maladies auto-immunes autres que la MII. Une coloration cytoplasmique brune généralisée a été observée dans les cellules transfectées et non transfectées, suggérant une liaison non spécifique des anticorps. Ces résultats illustrent le potentiel de détection de faux positifs dans les tests de transfert linéaire lors de l’utilisation de plasma de patients atteints de maladies auto-immunes non liées à des patients IIM anti-MDA5-positifs. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviation : IIM = myopathies inflammatoires idiopathiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats négatifs de coloration au plasma d’individus témoins sains. Les cellules HeLa transfectées avec MDA5 et incubées avec du plasma d’individus sains ont montré peu ou pas de coloration cytoplasmique brune. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire S1 : Caractéristiques du patient. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Des parties de ce manuscrit ont été générées avec l’aide de GPT-4 d’OpenAI. Les auteurs ont révisé et édité le contenu pour en assurer l’exactitude et l’originalité.